Cromatografia

Cromatografia este procesul fizico-chimic , cu ajutorul caruia se separa substantele

dintr-o solutie, pentru a fi apoi analizate, identificate, purificate sau cuantificate. Ea a fost
descoperita de catre botanistul rus Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919) si a fost utilizata de
acesta in separarea unor pigmenti vegetali. Aceasta metoda se bazeaza pe deplasarea cu viteza
diferita a componentelor unui amestec intre o faza stationara si una mobila, nemiscibile intre
ele. Faza stationara este solida sau lichida, iar faza mobila este reprezentata de un lichid sau
un gaz. Astfel ca substantele care se afla in amestec, vor fi distribuite in timpul deplasarii, in
grade diferite, intre faza stationara si cea mobila.
Schematic o cromatografie consta in:
- trecerea continua a unei faze mobile peste o faza care ramane fixa (faza stationara)
- proba (care contine componentii de separat) este introdusa in faza mobila
- are loc o distributie continua a componentilor intre faza mobila si cea stationara
- fiecare component are un coeficient propriu de distributie intre faze
- coeficienti diferiti de distributie contribuie la separarea componentilor datorita vitezelor
diferite de migrare
Clasificarea metodelor cromatografice se face dupa mai multe criterii:
1. In functie de natura fazelor putem avea urmatoarele tipuri de cromatografie (vezi tabelul
1).

FAZA FAZA DENUMIRE SIMBOL

MOBILA STATIONARA
gaz solid Cromatografia gaz-solid CGS
gaz lichid Cromatografia gaz-lichid CGL
lichid lichid Cromatografia lichid-lichid CLL
lichid solid Cromatografia lichid-solid CLS
fluid solid sau lichid Cromatografia de fluide in stare CFS
supercritic supercritica

2. Dupa modul de contact intre faza mobila si cea stationara cromatografiile se impart
in:
a. cromatografie planara (pe hartie sau in strat subtire)
b. cromatografie pe coloana.
1
 a. Cromatografia pe hartie reprezinta una din cele mai simple metode de analiză. In
aceasta metoda faza fixa este reprezentata de o suprafaţa de hartie speciala sau hartie de filtru.
Proba de analizat este plasata pe suprafata hartiei ca un mic punct sau ca o linie. Hartia cu
proba pe ea se plaseaza in interiorul unui tanc in care se afla faza mobila. Faza mobila
(eluentul) este reprezentata de un lichid ce se deplaseaza de-a lungul fazei fixe datorita
fortelor de adeziune si fortelor gravitationale. Cand eluentul atinge spotul de proba, se
stabileste un echilibru al componentelor amestecului intre faza mobila si faza stationara.
Unele molecule din amestec prefera faza stationara si raman in aceeasi pozitie sau migreaza
foarte lent, in timp ce altele prefera faza mobila si migreza rapid cu solventul de elutie. Elutia
este incheiata cand lichidul a spalat intreaga coala de hartie. Frontul solventului este marcat si
dupa uscarea hartiei se procedeaza la vizualizarea componentelor separate, printr-o reactie de
culoare. Pentru identificarea compusilor se va calcula factorul de retentie (reprezinta raportul
dintre distanta parcursa de zona cromatografica a unui compus si distanta parcursa de frontul
solventului) variabila care este specifica fiecarui compus.
Cromatografia pe hartie se foloseste pentru separarea amestecurilor de aminoacizi,
pentru ai putea identifica.
Cromatografia pe hartie se imparte in: cromatografie pe hartie verticala (ascendenta
sau descendenta) si orizontala (Pfeiffer).
Cromatografia in strat subtire este asemanatoare cromatografiei pe hartie diferenta
constand in natura fazei stationare. Aceasta este reprezentata de un strat subtire de silica gel
sau alumina, plasat pe un suport de hartie sticla sau aluminiu. Separarea este mai buna decat
in cazul cromatografiei pe hartie, iar rezolutia este deasemenea superioara.
Cromatografia in strat subtire se utilizeaza in separarea aminoacizilor, a peptidelor si a
colorantilor de fibre.
b. Cromatografia pe coloana este o tehnica de separare in care faza stationara este
impachetata intr-un tub sau o coloana. Spre deosebire de cromatografia planara cea pe
coloana ofera mai multe avantaje precum: distanta de migrare mai mare si prin urmare o
separare mai buna, se poate utiliza o cantitate mai mare de proba, iar faza stationara poate fi
mult mai complexa si diversificata, aceasta putand fi si in stare lichida, ceea ce ofera o gama
mult mai larga a probelor de separat. Un alt avantaj al cromatografiei pe coloana, consta in
durata scazuta a acesteia, deoarece solventul poate fi condus prin coloana prin aplicarea de
presiune pozitiva.
3. In functie de mecanismul de separare metodele cromatografice se clasica in:
2
a. Cromatografie de adsorbtie
b. Cromatografie de partitie
c. Cromatografie de schimb ionic
d. Cromatografie de excluziune moleculara
a. Cromatografia de adsorbtie sau cromatografia lichid-solid, reprezinta forma
clasica a cromatografiei lichide, care a fost introdusa, pentru prima data, de catre Tswett, la
inceputul secolului XX. In ultimii ani ea a fost adaptata devenind o metoda importanta, in
cromatografia lichida de inalta performanta.
In cromatografia de adsorbtie compusii ce se dorec separati sunt adsorbiti pe suprfata
unui material solid, fiind apoi desorbiti din solidul adsorbent prin elutie cu un solvent.
Separarea compusilor depinde de balanta relativa dintre afinitatea compusilor pentru
adsorbent si solubilitatea lor in solventul utilizat. Afinitatile relative ale compusilor ce se
doresc separati sunt in functie de natura chimica a substantei, de natura solventului si de
natura adsorbentului.
Adsorbentii (faza stationara) cei mai utilizati sunt: silicagelul, carbunele, celuloza,
amidonul, gelurile de fosfat de calciu, hidroxilapatita si sucroza.
Cei mai utilizati solventi (faza mobila) sunt: hexanul, benzenul, eterul de petrol, eterul
etilic, cloroformul, clorura de metilen, diversi alcooli (etilic, propilic, n-butilic si t-butilic),
diverse tampoane apoase ori solutii de saruri, unele in combinatii cu solventi organici.
Tehnica cromatografiei de adsorbtie este utilizata cel mai adesea pentru compusi
nepolari care poseda mase molecula mai mici de 5000 Da. Cu toate ca exista o suprapunere
intre cromatografia de adsorbtie si cea de partitie, metodele tind a fi complementare.
In general cromatografia lichid-solid este cea mai fezabila in conditiile in care probele
sunt solubile in solventi nepolari si este limitata de solubilitatea compusilor in solventi aposi.
b. Cromatografia de partitie este cea mai utilizata tehnica de separare din toate
tipurile de procedee cromatografice. Daca in trecut cele mai multe aplicatii se adresau
compusilor neionici, celor polari cu masa moleculara moderata (mai mica de 3000 Da), astazi
dezvoltarea unor metode (procedee de derivatizare ori tehnici bazate pe perechi de ioni) au
extins separarile prin partitie si la compusi ionici.
Cromatografia de partitie pana nu demult era echivalenta cu cromatografia lichid-
lichid. Astazi din aceasta categorie face parte si cromatografia cu faza legata, chiar daca ea
este o combinatie intre cromatografia de partitie si cea de adsorbtie. Diferenta intre cele doua
tehnici ( cromatografia lichid-lichid si cromatografia cu faza legata) consta in metoda prin
3
care faza stationara intra in interactie cu particulele suport, impachetate. In cromatografia
lichi-lichid, faza lichida stationara este retinuta pe suprafata particulelor impachetate prin
adsorbtie fizica. In schimb, in cazul cromatografiei de faza legata, faza stationara este legata
chimic la suprafata particulelor de suport. Primele tipuri de cromatografie de partitie au fost
exclusiv de tip lichid-lichid. Acum, metoda cu faza legata a devenit predominanta datorita
multor dezavantaje ale sistemelor lichi-lichid. Unul dintre aceste dezavantaje il reprezinta
pierderea fazei stationareprin disolutia ei in faza mobila, care astfel necesita reacoperirea
periodica a particulelor suport. In plus problemele de solubilitate ale fazei stationare interzic
utilizarea fazei lichide impachetate in cazul elutiei in gradient. De aceea in continuarea voi
discuta doar despre cromatografia de partitie cu faza legata.
In functie de polaritatea relativa a fazelor mobila si stationara, se pot distinge doua
tipuri de cromatografii cu faza legata: cromatografia cu faza normala si cromatografia cu faza
inversa. In cromatografia cu faza normala faza stationara este reprezentata de molecule
puternic polare cum ar fi apa sau trietilenglicol, legate de particule de silice sau alumina. Faza
mobila la aceste cromatografii este reprezentata de un solvent nepolar cum ar fi hexanul sau
iso-propil eterul. In cromatografia cu faza inversa, faza stationara este nepolara, deseori o
hidrocarbura, in timp ce faza mobila este relativ polara (apa, metanol, acetonitril, etc.).
Cromatografia de partitie este utilizata la scara larga in in industria farmaceutica, in
industria alimentara (analiza unor aditici intr-o bautura), in industria chimica (analiza unor
insecticide organofosforice), in cercetarile biochimice, precum si in medicina clinica (analiza
acizilor biliari, a estrogenilor, etc.) si legala (analiza otravurilor, a alcoolului din sange, a
narcoticelo, etc.).
c. Cromatografia de schimb ionic reprezinta o varianta a cromatografiei de adsorbtie
in care adsorbentul solid poseda grupari chimice incarcate electric legate chimic la un suport
solid, inert. Cromatografia de schimb ionic a fost dezvoltata la mijlocul anilor '70 cand s-a
aratat ca un amestec de anioni sau de cationi poate fi rapid prelucrat pe coloane de
cromatografie sau de inalta performanta, impachetate cu un suport alcatuit dintr-o rasina
schimbatoare de ioni, anioni sau cationi.
Schimbul ionic este probabil cea mai utilizata tehnica cromatografica pentru separarea
si purificarea proteinelor, polipeptidelor, acizilor nucleici, polinucleotidelor si a altor
biomolecule incarcate electric.
d. Cromatografia de excluziune moleculara reprezinta o tehnica de real folos in
laborator, fiind aplicata in particular la separarea speciilor cu masa moleculara mare. Suportul
4
cromatografic impachetat, utilizat in cromatografia de excluziune moleculara este alcatuit din
particule mici, de aproximativ 10 µm de silicat ori particule de polimeri care contin retele de
pori uniformi, intr-un solut si molecule de solvent difuzate in interiorul acestor pori. In
interiorul porilor moleculele sunt efectiv blocate, fiind apoi antrenate prin curgerea fazei
mobile. Domeniul de timp de rezidenta in interiorul porilor depinde de marimea efectiva a
moleculelor de analit. Moleculele care sunt mai mari decat media marimii porilor suportului
ctomatografic sunt excluse si astfel ele nu vor fi retinute, aceste specii fiind primele eluate.
Moleculele care au diametru semnificativ mai mic decat dimensiunile porilor pot penetra in
labirintul de pori din interiorul suportului cromatografic fiind astfel captate, pentru un
timpmult mai indelungat, fiind ultimele eluate. Intre cele doua extreme exista molecule
intermediare a caror domeniu de permeare in pori depinde de diametrele lor.
In cazul separarii biomoleculelor in sisteme apoase, pe suporturi cromatografice
hidrofile cromatografia de excluziune se mai numeste cromatografie de gel filtrare, iar in
cazul separarii in sisteme neapoase pe suporturi cromatografice hidrofofe este denumita
cromatografie de gel permeatie. Aceste metode sunt complementare in sensul ca una este
aplicabila pentru probe solubile in apa, in timp ce a doua este aplicabila substantelor solubile
in solventi mai putin polari.
Cromatografia de excluziune moleculara se foloseste cel mai adesea in separarea unor
molecule cu masa moleculara mare, de speciile unor molecule cu masa moleculara mica. O
alta aplicatie o reprezinta separarea unor omologi sau a unor oligomeri.
In incheiere dupa cele expuse mai sus se poate concluziona ca metodele
cromatografice de analiza prin diversitatea si adaptabilitatea lor reprezinta tehnici de mare
insemanatate in stiinta, dar si in diverse ramuri ale industrie, precum si in medicina.

Bibliografie:
"Biochimie practica" - Dana Iordachescu - Ed. Universitatii din Bucuresti - 1988
"Metode analitice in biochimie - Introducere in cromatografie" - Gheorghe Stoian - Ed. Ars
Docendi - 2007