METODE CROMATOGRAFICE

ÎN ANALIZA MEDICAMENTULUI

CURS

Prof.dr. Daniela-Lucia Muntean

1
 A. Definiţie

 Cromatografia - procesul de
separare în care
componentele amestecului
probă sunt distribuite diferit
între două faze:
 faza staţionară - un solid,
un material poros, o
suprafaţă activă sub forma
unor particule mici sau un
suport solid acoperit cu un
film de lichid
 faza mobilă - un gaz, un
lichid sau un fluid Principiul
cromatografiei 2
supercritic 2
Clasificarea metodelor cromatografice
 În funcţie de natura fazei mobile, metodele
cromatografice se împart în trei mari categorii:

 Cromatografia lichidă

 Cromatografia gazoasă

 Cromatografia cu fluide în fază supercritică

3
3
 În funcţie de modul de dispunere a fazei staţionare:
 Cromatografia planară – faza staţionară dispusă
planar:
 Cromatografia pe Hârtie - acronim CH sau PC
(Paper Chromatography) - faza staţionară este
reprezentată de o hârtie specială
 Cromatografia în Strat Subţire – acronim CSS
sau TLC (Thin-Layer Chromatography) - faza
staţionară este depusă sub forma unui strat
subţire pe o placă:
 La suprapresiune (faza mobilă este trecută
prin faza staţionară sub presiune)
 La presiune obişnuită (trecerea fazei mobile
prin faza staţionară se face prin capilaritate

4
 Cromatografia pe coloană – faza staţionară
introdusă într-o coloană:

 Cromatografia de lichide pe coloană

 Cromatografia de Lichide pe Coloană Clasică –
acronim CCLC (Classic Column Liquid
Chromatography) - la presiune obişnuită, p  1 bar
 Cromatografia de Lichide de Înaltă Performanţă –
acronim HPLC (High-Performance Liquid
Chromatography) - la presiune înaltă, p  500 bari
 ! NOU Cromatografia de Lichide la Presiune Extremă
– acronim X-LC (Extreme Pressure Liquid
Chromatography) – la presiuni p  1000 bari
 Cromatografia de gaze – acronim GC
 Cromatografia cu fluide în stare supercritică – combină
principiile de separare din cromatografia de gaze şi
cromatografia de lichide de înaltă performanţă

5
Procesul cromatografic

6
6
 Componenţii supuşi procesului cromatografic trebuie să
aibă coeficienţi de distribuţie diferiţi şi factori de
capacitate, de asemenea, diferiţi pentru a putea fi
separaţi. Se presupune că un amestec de trei
componenţi notaţi A, B şi C se aplică pe o coloană.
Componentul B are afinitate pentru faza staţionară, iar
componenţii A şi C, pentru faza mobilă, dar în fiecare
moment există un permanent transfer al moleculelor din
faza staţionară în faza mobilă şi invers. O nouă porţiune
de eluent determină stabilirea unui nou echilibru, în
acord cu coeficienţii lor de distribuţie (unele molecule
iniţial adsorbite de faza staţionară, trec în faza mobilă,
iar locul lor este luat de alte molecule neadsorbite
iniţial). Procesul se repetă de un număr mare de ori aşa
încât, în final, cei trei componenţi sunt separaţi.
Componenţii A şi C cu afinitate pentru faza mobilă
migrează mult mai repede decât componentul B care
7
tinde să rămână în faza staţionară. 7
 Lungimea coloanei pe care se stabileşte echilibrul de distribuţie a unui
component între cele două faze = taler (platou) teoretic, căruia îi
corespunde o anumită înălţime H
 Afinitatea unui component X din amestecul de separat pentru una din
faze poate fi exprimată prin coeficientul de distribuţie K:
cS
K
cM
unde cS este concentraţia sau activitatea componentului X în faza
staţionară şi cM este concentraţia sau activitatea lui X în faza mobilă.

 Preferinţa pentru una din faze mai poate fi exprimată prin factorul de
capacitate sau factorul de retenţie k (notat şi k):
nS
k' 
nM
unde nS este numărul de moli de component X în faza
staţionară, iar nM este numărul de moli de X în faza
mobilă.
8
8
Cromatografia este considerată lineară când
raportul cS/cM sau Q/cM este constant,
unde cS, concentraţia substanţei în faza
staţionară, cM, concentraţia în faza mobilă,
Q, cantitatea de de substanţă în faza
staţionară pe unitatea de suprafaţă. Dacă
acest raport nu este constant vorbim de o
cromatografie neliniară.

9
Echilibrul de distribuţie a unui component între cele două faze se
stabileşte pe o anumită lungime a coloanei. Această distanţă
corespunde unui taler (platou) teoretic. Cu cât o coloană
cromatografică este mai mare, aceasta conţine mai multe talere
teoretice şi deci permite o separare mai bună a amestecului.
În condiţiile unei cromatografii ideale, echilibrul se stabileşte pe o
lungime a coloanei infinit de mică dx numită şi înălţime echivalentă
a unui taler teoretic H: H = dx

Faza staţ. S Faza mob. M

1 H

2 dVS dV

N-1

N
10
 Cauzele care determină lărgirea benzilor
cromatografice:
o difuzia turbulentă

o distribuţia fluxului fazei mobile

o difuzia moleculară în faza mobilă

o transferul de masă între faza mobilă,

faza “mobilă stagnantă” şi faza
staţionară

11
11
Separarea cromatografică este parţial afectată de lărgirea benzilor de eluţie.
Zonele cu substanţe separate devin mai largi cu creşterea distanţei de-a
lungul coloanei şi a timpului de retenţie.

Difuzia turbulentă într-o coloană cromatografică: (1) molecule cu

12
traiectorie liniară, (2) molecule cu traiectorie ondulată
 Particulele fazei Vectori vitezã ai
staţionare fazei mobile

Distribuţia fluxului eluentului într-un pat

cromatografic

Difuzia turbulentă şi distribuţia fluxului pot fi reduse

folosind particule de mărimi egale.

13
13
 particule superficial poroase particule total poroase

Moleculele nereţinute în pori migrează mai repede.

Eliberarea moleculelor intrate în pori se face lent, prin difuzie în
faza mobilă.
Transferul de masă din faza staţionară este încetinit dacă
molecula interacţionează cu faza staţionară (adsorbant sau film de 14
lichid) şi este adsorbită. 14
Condiţii care trebuie respectate într-o
analiză cromatografică
Faza staţionară
• Particule mici
• Suprafaţă poroasă subţire

Solvenţii
• Vâscozitate mică

Debitul fazei mobile

• Valorile mari nu afectează rezoluţia dacă se lucrează cu faze
staţionare cu particule mici

15
15
 Cromatograma – cromatografia pe
coloană
Răspuns detector = f(timp)

16
16
 tR

Forma unui pic cromatografic ideal, tR timp de

retenţie, w – lăţimea picului la bază

17
17
Calitativ: timpul de retenţie tR al unui component este întotdeauna
constant în condiţii cromatografice identice. Timpul de retenţie este
perioada de timp de la injectarea probei şi momentul în care se
înregistrează maximul picului. Dimensiunile coloanei, tipul fazei
staţionare şi compoziţia acesteia, viteza eluentului, mărimea
probei şi temperatura reprezintă condiţiile cromatografice. Deci,
un pic poate fi identificat injectând în aceleaşi condiţii substanţa standard
şi comparând timpul de retenţie din cromatograma standard cu cel din
cromatograma probă.

Cantitativ: aria picului (înălţimea) este direct proporţională cu cantitatea

de component injectat. Se folosesc curbe de calibrare arie – concentraţie
sau înălţime - concentraţie, trasate cu ajutorul unor serii de soluţii etalon
de concentraţii foarte bine cunoscute.
În cromatografia de eluţie se distinge un pic corespunzând fazei mobile,
urmat de picurile diferiţilor soluţi (analiţi).

18
Mărimi de retenţie :
 t0 - timp mort: timpul necesar trecerii fazei mobile prin
coloană; dacă u este viteza acesteia, în cm/s, L,
lungimea coloanei, în cm, atunci: L(cm )
u(cm / s ) 
t0 ( s)
 tR – timp brut de retenţie: timpul scurs de la
introducerea probei în coloană şi momentul atingerii
concentraţiei maxime în detector; ! Este timpul de
retenţie folosit uzual în analiza cromatografică.
t 'R  t R  t 0
 tR – timp de retenţie corectat sau timp de retenţie net:

 w – lăţimea picului pe linia de bază

 w0.5 – lăţimea la jumătatea înălţimii picului cromatografic19
19
Factorul de capacitate k’ (sau k)
Este definit ca: t' t t
k'  R  R 0
t0 t0
k’ depinde de coeficientul de distribuţie K între cele două faze a
componentului de interes:

VS
k'  K
VM
Factor de separare
Doi componenţi dintr-un amestec pot fi separaţi dacă au valori k’
diferite. Această diferenţă se exprimă prin retenţia relativă , cunoscută
şi sub numele de factor de separare sau selectivitate:

t' tR2  t0 k'2 K 2

  R2   
t'R1 tR1  t0 k'1 K1

cu k’2 >> k’1. Dacă  =1, nu are loc separarea.

20
20
! Timpii şi volumele de retenţie brute şi reduse sunt
caracteristice unui solut pentru o coloană şi fază mobilă date.

k’ este independent de lungimea coloanei,

viteza fazei mobile (cu condiţia ca u să nu depăşească
valoarea de 5 cm s-1) şi reprezintă raportul molar al
componentului în faza staţionară şi mobilă. Se preferă
valori ale lui k între 1 şi 5. Dacă valoarea k este prea
scăzută, nivelul separării este necorespunzător
(componentul traversează prea rapid coloana, nu
interacţionează cu faza staţionară şi, de aici, rezultă
imposibilitatea separării cromatografice). Valori înalte
ale lui k înseamnă timpi de analiză lungi.

21
Volume de retenţie:
Dacă D este debitul fazei mobile, VS, volumul fazei staţionare în
coloană, K, coeficientul de repartiţie, atunci se definesc:
 VM – volumul mort: pentru D constant, este dat de expresia:

VM = tM D
 VR – volum de retenţie, volumul necesar pentru eluarea
soluţilor la concentraţiile maxime după introducerea în
coloană; se mai numeşte volum de retenţie brut şi, pentru D
constant, este:
VR = tR D
 În acelaşi timp: VR = VM + K VS
 VR – volum de retenţie redus care, pentru D constant, este:

VR = tR D
şi, deci: VR = VR – VM

22
Dacă se lucrează cu volume de retenţie şi D este debitul constant al fazei
mobile:
DtR2  Dt 0 VR2  VM
 
DtR1  Dt 0 VR1  VM
K2
dar VR2 = VM + K2 VS deci 
VR1 = VM + K1 VS K1
Factorul de separare este o măsură a capacităţii sistemului cromatografic de a
separa doi componenţi, mai bine spus o măsură a selectivităţii. Valoarea ei
depinde de alegerea fazei staţionare şi a fazei mobile şi nu depinde de
parametrii geometrici ai coloanei. Natura fazelor influenţează separarea prin
intermediul constantei termodinamice K.
Rezoluţia
Rezoluţia R reprezintă măsura capacităţii efective de separare a două picuri
vecine. Este definită ca raportul dintre diferenţa timpilor de retenţie tR ale celor
două picuri şi media aritmetică a lăţimii celor două picuri w:
t t t R2  t R1
R  2 R2 R1  1.176
w1  w 2 w 0.5,1  w 0.5, 2

unde w0.5 este lăţimea picului la jumătatea înălţimii.

23
Numărul de talere teoretice
Cromatograma permite calcularea numărului talerelor teoretice N în coloană:
2
t 
N  16 R 
 w 
2
 t 
N  5.54 R 
 w 0 .5 
2
 h  tR 
N  2 
 A 

unde h este înălţimea picului, A aria picului.

Capacitatea de separare
Capacitatea de separare reprezintă numărul de soluţi n care pot fi separaţi pe o
coloană în anumite condiţii experimentale. Este dată de relaţia:
N  1  k' n 
n ln 
4R  1  k 1 
unde
N – este numărul de talere teoretice
R – rezoluţia
k’1 şi k’n – factorii de capacitate ai primului şi, respectiv, ultimului solut.
24
Influenţa unor factori asupra separărilor cromatografice

Factorul de separare  este o măsură a selectivităţii

cromatografice. Valorile mari oglindesc interacţiunea cu faza mobilă şi/sau
faza staţionară, tipurile de interacţiuni fiind forţe de dispersie, interacţiuni
dipol-dipol, legături de hidrogen, interacţiuni  - , valoarea pH-ului în
cromatografia cu schimbător de ioni.
Numărul de talere teoretice N caracterizează eficienţa
coloanei. Numărul de talere teoretice creşte cu gradul de împachetare a
umpluturii coloanei, lungimea coloanei şi depinde de caracteristicile fazei
mobile. O coloană cu un număr mare de talere poate separa amestecuri în
care componentele au valori similare ale retenţiei relative . Dacă  este
mic, este nevoie de un număr mare de talere teoretice.
Factorul de capacitate k’ depinde numai de tăria eluentului,
pentru un raport volumic constant între faza mobilă şi staţionară. O fază
mobilă este puternică dacă eluează rapid componenţii şi este slabă dacă
procesul de eluţie decurge lent.

25
Deviaţiile mici de la forma gaussiană sunt nesemnificative şi sunt
privite ca normale. În schimb, abaterile mari indică faptul că
sistemul cromatografic ales nu este corespunzător. Asimetria
reduce numărul talerelor teoretice şi, deci, rezoluţia, de aceea este
necesar ca factorii cauzatori ai unei astfel de comportări să fie
eliminaţi.
Printre cauzele cele mai importante ale asimetriei
picurilor se numără:

împachetarea slabă a coloanei

valoarea mare a volumului mort
încărcarea coloanei (o coloană nu este capabilă să separe orice
cantitate de substanţă; k’ şi lăţimea picului depind de mărimea
probei)
incompatibilitatea probei cu una sau ambele faze
capacitatea mare de adsorbţie a fazei staţionare (în
cromatografia de adsorbţie)

26
 Cromatografia în strat subţire
CSS

 Principiu

 Fazestaţionare, faze mobile, echipament

 Mărimi caracteristice

 Mod de lucru

 Aspecte calitative şi cantitative în CSS

Aprofundarea noţiunilor: capitolul 2.8 din cartea Analiza medicamentului.
Ghid practic, autori Muntean D.L., Imre S., (2007)
27
27
 28
28
Calcularea factorului de retenţie Rf

29
29
 Detecţia prin fotodensitometrie
– permite obţinerea unei fotodensitograme
30
30
Absorbanţă

Fotodensitogramă

Rf 31
31
Aspecte calitative şi cantitative în CSS
Identificarea
 Identificarea compuşilor dintr-o probă se face pe baza
corespondenţei Rf a spotului separat din soluţia probă cu cel din
soluţia de referinţă.
Determinarea cantitativă
 Metoda directă – se măsoară absorbanţa A a spoturilor
soluţiilor etalon prin fotodensitometrie, se construieşte curba de
calibrare A în funcţie de concentraţia c şi concentraţia probei se
determină prin raportare la curba de calibrare.
 Metoda indirectă (eluţiei) – se răzuiesc spoturile aplicate în
bandă corespunzătoare soluţiilor etalon şi probă, se dizolvă analitul
din pulberea răzuită, soluţiile se filtrează şi se analizează prin
metode spectrale, electrochimice etc. Se construieşte curba de
calibrare semnal măsurat (de exemplu, absorbanţă) în funcţie de
concentraţie.
Determinarea semicantitativă
 Aria spotului este direct proporţională cu log c. Se
procedează ca la determinarea cantitativă folosindu-se aria
spoturilor măsurate manual.
32
32
 Aplicaţii
Numeroase, în aproape toate
domeniile:
- Analiză de laborator
-Teste rapide de laborator

Test de sarcină Teste pentru 33

33
verificarea glicemiei
Separarea prin CSS a unor
coloranţi alimentari 34
34
 CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ
PERFORMANŢĂ (HPLC)
 CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ =
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
 Principiu
 Faze staţionare, faze mobile, echipament
 Mărimi caracteristice
 Mod de lucru
 Aspecte calitative şi cantitative în HPLC

Aprofundarea noţiunilor:
Capitolul 2.8 din cartea Analiza medicamentului. Ghid practic, autori Muntean D.L.,
Imre S., (2007) 35
35
 Faza staţionară
 Solidă

 Introdusă într-un tub metalic (coloană)

 Faza mobilă – amestec de lichide miscibile

Faza mobilă este vehiculată sub presiune în coloana

cromatografică
 HPLC clasică – presiunea în coloană – 400-450 bari

 UPLC Upper Pressure Liquid Chromatography –

presiunea în coloană – până la 1000 de bari
Compuşii separaţi ies pe rând din coloana cromatografică
şi intră într-un modul numit detector care, de regulă,
măsoară o proprietate fizico-chimică (absorbanţa,
fluorescenţa, potenţialul electrochimic, conductivitatea
etc.)

36
36
Schema generală a unui sistem
HPLC

37
37
 Analiza calitativă

A. METODE
CROMATOGRAFICE

38
38
 Analiza calitativă
Soluţie standard

Sem
nal

Soluţie probă

Timp

Identificare pe baza timpului de retenţie

39
39
 Analiza calitativă

Se
mn
al

Soluţii probă
cu adaus
standard
Soluţia
probă iniţială

Timp

Metoda adausului standard

40
40
 Analiza calitativă
Metoda retenţiei relative

Retenţia relativă r se defineşte în funcţie de o substanţă standard.

Dacă (V’R)S şi (t’R)S sunt volumul, respectiv, timpul de retenţie
corectat pentru substanţa aleasă ca standard şi V’R şi t’R, ale
componentului de identificat, atunci:

r = V’R/(V’R)S = t’R/(t’R)S

r depinde de temperatură, faza staţionară şi faza mobilă.

Identificarea se face prin compararea lui r între compuşii etalon şi
compuşii probei de analizat.

41
41
 Analiza calitativă
B. METODE SPECTRALE
Cromatograful de lichide poate fi în prezent
cuplat cu toate tipurile de spectrometre:
UV-VIS, IR cu transformată Fourier,
spectrometru de masă, spectrometru de
rezonanţă magnetică nucleară, etc. Prin
aceste cuplaje se pot obţine spectre
caracteristice, pe baza cărora se poate
face identificarea.
42
42
 Analiza cantitativă
 Etapele
determinării cantitative constau
în măsurarea:
 Ariei picului:
 metode manuale
 metode electronice

 Concentraţiei probei:
 metoda normării ariilor
 calibrare cu standard extern

 metoda standardului intern

 metoda adausului standard

43
43
B. 1. Determinarea ariei picului
Metode manuale de măsurare a ariei picului:
- metoda produsului înălţimii cu lăţimea picului: aria picului se calculează
determinând înălţimea picului h şi lăţimea lui măsurată la jumătatea înălţimii w1/2:
A = h  w1/2
Se recomandă utilizarea acestei metode la picurile simetrice. În cazul picurilor
foarte ascuţite este indicat să se măsoare lăţimea lui la 1/4 sau chiar la1/10 din
înălţimea lui.
- metoda triunghiului: constă în trasarea tangentelor la pic prin punctele de
inflexiune iar măsurarea lăţimii picului la bază wb se face între punctele de
intersecţie ale celor două tangente cu linia de zero. Dacă înălţimea triunghiului
format de cele două tangente cu linia de bază este h, atunci:
A = h  wb / 2
Se recomandă aplicarea acestei metode în cazul picurilor late când h/w1/2  1.
Metoda integrării electronice:
- se utilizează un sistem de integrare cu achiziţie de date, estimarea ariei picului
realizându-se prin însumarea fâşiilor ce reprezintă aria semnal / timp de-a latul
picului.

44
B. 2. Determinarea concentraţiei probei
Metoda normării ariilor este frecvent utilizată la estimarea cantităţilor relativ mici de
impurităţi sau compuşi de degradare în proba de analizat
Metoda se aplică la determinarea concentraţiei procentuale a componenţilor probei de
analizat şi se utilizează în cazul în care toţi componenţii probei sunt separaţi şi detectaţi.
Concentraţia procentuală a componentului i va fi dată de ecuaţia:
 n 
c i  A i /  A j  /100 %

 j 1 


unde A1, A2, …, An sunt ariile picurilor individuale sau înălţimile respective.
În acest caz s-a presupus că factorul de răspuns este pentru fiecare component identic.
Metoda este recomandată a fi utilizată atunci când sunt folosiţi detectori cu proprietate
de volum, cum ar fi detectorul de indice de refracţie care dă răspunsuri similare pentru
mulţi compuşi neînrudiţi.
Ecuaţia de mai sus se poate corecta cu ajutorul factorului de răspuns:

 n 
c i   A i fi /  A j f j  / 100 %
aria(inaltimea) standard
f 
concentratia standard  

 j 1 
45
Calibrare cu standard extern
Este o metodă generală pentru determinarea concentraţiei unui component din probă şi
constă în elaborarea unei drepte de calibrare folosind soluţii standard ale
componentului. Pentru proba de concentraţie necunoscută, după separarea şi
integrarea picului corespunzător, se obţine aria acestuia care va permite determinarea
concentraţiei cu ajutorul curbei de calibrare.
O altă metodă pentru determinarea concentraţiei constă în utilizarea factorului de
răspuns f al analitului de interes, numit şi factor de sensibilitate:

Conc. probei = Aria (înălţimea) picului componentului în probă / f

Dacă f variază cu concentraţia, acesta se determină la nivelul de concentraţie aşteptat

în probă, folosind o soluţie standard cu concentraţia corespunzătoare.

Metoda standardului intern

Constă în adăugarea unui compus numit standard intern (SI) la proba de analizat.
Standardul intern trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
să fie bine separat de compuşii de interes
să nu fie prezent în probă
să aibă un factor de retenţie k similar cu al compuşilor de separat
să aibă puritate înaltă
să fie stabil şi să nu reacţioneze cu proba sau cu faza mobilă
să aibă un răspuns similar la detecţie cu proba, pentru concentraţiile utilizate
46
Standardul intern este adăugat aşa încât să realizeze o concentraţie fixă şi
cunoscută în soluţiile standard de calibrare ale componentului de interes. După
obţinerea cromatogramelor se va realiza curba de calibrare:

Aria componentului / Aria SI = f (conc. componentului / conc. SI)

Ac /ASI = f(cc/cSI)

La soluţia probă se adaugă o cantitate de SI aşa încât să se realizeze aceeaşi

concentraţie de SI ca şi în soluţiile standard de calibrare. După cromatografiere,
se determină de pe cromatogramă raportul (Ac/ASI)x şi apoi din curba de
calibrare, raportul cc/cSI şi cunoscând concentraţia SI se determină concentraţia
componentului de interes.

47
Metoda adausului standard
Se foloseşte în cazul analizei de urme sau atunci când realizarea curbei de calibrare
constituie o problemă. Metoda constă în adăugarea la proba iniţială a unor cantităţi
cunoscute din componentul a cărui concentraţie dorim să o determinăm. După
efectuarea separărilor şi integrarea picurilor se va construi un grafic pe baza căruia se
poate determina concentraţia originală a componentului.
Din punct de vedere analitic se procedează astfel: pe baza datelor experimentale se
calculează dreapta cea mai probabilă:
y1 = a + b x
unde y1 reprezintă valorile ariilor picurilor pentru cantităţile adăugate x. Se stabileşte
apoi dreapta care trece prin origine şi este paralelă cu cea experimentală:
y2 = b x
b reprezintă panta celor două drepte şi, respectiv, factorul de răspuns f a componentului
de determinat. Se pun condiţiile:
(y1)x = 0 = a şi y2 = (y1)x =0
de unde:
x0 = a/b = a/f = conc. originală

48