CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metod de analiz care se bazeaz pe separarea n zone spaiale distinct a componenilor unui amestec la trecerea acestuia printr-un mediu n care componenii se deplaseaz cu viteze diferite. Termenul de cromatografie provine de la cuvntul grecesc chroma care nseamn culoare. n cromatografie se disting dou faze: faza staionar (faza fix) i faza mobil (eluentul). Faza staionar este reprezentat de materialul prin care circul proba i care asigur separarea componenilor din amestec iar faza mobil este fluidul (lichid sau gazos) care transport proba la suprafaa fazei staionare.

Clasificarea metodelor cromatografice Dup mecanismul de separare, metodele cromatografice pot fi mprite astfel: cromatografie de adsorbie, cromatografie de partiie, cromatografie de schimb ionic, cromatografie de excludere molecular i cromatografie de afinitate. Dac se ine seama de starea de agregare a celor dou faze, metodele cromatografiece sunt clasificate n: metode cromatografice de tip solid-lichid, lichid-lichid, lichid-gaz. Cromatografia de adsorbie se bazeaz pe adsorbia difereniat a componenilor unui amestec pe un suport adsorbant i deplasarea acestora, sub aciunea fazei mobile, cu viteze invers proporionale cu tria forelor de

adsorbie. ntre suportul adsorbant i substanele care se deplaseaz peste faza staionar se stabilesc interacii intermoleculare de tipul: dipol-dipol, van der Waals, legturi de hydrogen care conduc la o adsorbie fizic, reversibil. n cazul n care s-ar forma legturi chimice, procesul s-ar numi chemoasorbie; deoarece chemoasorbia este un process ireversibil nu prezint interes pentru cromatografie. Cromatografia de partiie are ca punct de referin coeficienii de repartiie diferii ai componenilor unui amestec ntre dou faze nemiscibile sau parial miscibile: apa sau alt solvent polar (faza staionar) sau un solvent organic (faza mobil) Coeficienii de repartiie sunt dependeni de structura chimic i de solubilitatea substanelor n cele dou faze, substanele de analizat dizolvndu-se preferenial n faza staionar i faza mobil. Componentul cu solubilitate mai mare n faza mobil va avea o vitez de deplasare superioar, comparative cu componentul cu solubilitate mai mare n faza staionar care se va deplasa cu o vitez sczut. Cromatografia de schimb ionic utilizeaz ca faz staionar schimbtorii de ioni. Schimbtorii de ioni sunt substane de natur organic sau anorganic care au proprietatea de a schimba un ion propriu cu un alt ion din mediul lichid cu care se afl n contact. Cromatografia de excludere molecular numit i gel filtrare, utilizeaz ca faz staionar anumite substane cu structur tridimensional (dextran, poliacrilamid) care prezint proprietatea ca n contact cu apa sau cu soluii saline s se imbibe rapid, formnd geluri de diferite poroziti.

Aceast metod permite separarea componenilor unui amestec lichid pe baza diferenelor de mrime molecular. Sub aciunea fazei mobile ( eluentul) moleculele cu dimensiuni mari vor fi excluse de structura gelului i se vor deplasa o dat cu eluentul; moleculele cu dimensiuni mici vor penetra gelul ptrunznd n lichidul din interiorul porilor avnd o vitez de deplasare prin coloan invers proporional cu dimensiunea pe care o prezint. Cromatografia de afinitate reperzint o tehnic de separare aproteinelor, acizilor nucleic, hormonilor, celulelor, pe baza proprietilor lor de legare specific, prin fore necovalente, de moleculele complementare numite ligand. n cadrul acestei metode cromatografice faza staionar este constituit de o matrice polimeric poroas (dextran, agaroz, poliacrilamid) de care se leag covalent ligandul. Ligandul are proprietatea de recunoate i lega reversibil i selectiv, dintr-un amestec multicomponent, numai componentul care prezint o structur complementar cu a sa. Cromatografia de gaze este foarte utilizat deoarece poate fi aplicat oricrui amestec de componente lichide cu temperature joase de fierbere.

CROMATOGRAFIA N STRAT SUBIRE A FOSFOLIPIDELOR Cromatografia n strat subire (CSS) este o tehnic cromatografic de importan major, simpl i expeditiv, utilizat n analiza calitativ.

Stratificarea adsorbantului const n depunerea unui strat de adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu etc.) de aproximativ 250 grosime pe o plac inert de sticl, aluminiu sau pe filme rigide de plastic de dimensiuni variabile. Pentru prepararea stratului adsorbant se realizeaz o suspensie apoas format din adsorbant care se depune uniform pe placa cromatografic. Dup evaporarea apei, pe plac rmne un strat subire de suport. Deoarece centrii de adsorbie au capacitatea de a reine puternic moleculele de ap este necesar ca dup uscare s se efectueze activarea suportului prin nclzire la o anumit temperatur. Procesul de activare (ndeprtarea apei) trebuie reglat i controlat deoarece temperature i timpul de uscare nainte de utilizare determin numrul de poziii active, tipul cromatografiei (de adsorbie sau de partiie) i n concluzie eficacitatea separrii. O temperatur de uscare prea nalt i un timp de uscare prea ndelungat pot genera transformri chimice, care vor determina modificarea proprietilor adsorbante. Aplicarea probelor se efectueaz n spoturi discrete cu ajutorul capilarelor sau a micropipetelor n volume cuprinse ntre 1 i 100L. Pentru o separare cu un grad nalt de rezoluie este necesar ca spoturile aplicate s fie ct mai mici i mai bine definite. Pentru aceasta, proba este dizolvat ntr-un solvent volatile. Dac probele sunt foarte diluate aplicarea probei este repetat, pn la depunerea cantitii dorite, aplicarea

fiind efectuat cu mult grij astfel nct s se obin un spot mic i bine definit. Developarea (irigarea) se efectueaz dup aplicarea i uscarea spoturilor; placa cromatografic este introdus ntr-o camer de developare (tank cromatografic), sub un unghi de aproximativ 45, care conine un strat de 0,5-1,0 cm de solvent n care se imerseaz un capt al plcii, efectunduse o irigare de tip ascendant. Pentru realizarea unei separri corespunztoare atmosfera din camera de developare trebuie s fie saturat cu faza mobil. Pentru a asigura condiiile de saturaie, interiorul camerelor se tapeteaz cu hrtie de filtru umectat n solventul de developare. Pentru ca developarea s fie reproductibil este necesar meninerea acelorai valori de temperatur, concentraie i timp de nclzire i developare, grosimea adsorbantului, ntruct orice modificare a gradului de saturaie va influena gradul de adsorbie. Vizualizarea (revelarea) fraciilor separate se poate efectua prin pulverizarea cromatogramei cu un reactive de culoare sau prin iluminarea cromatogramei cu o lamp cu lumin ultraviolet. Evaluarea calitativ (identificarea spoturilor) se efectueaz prin compararea vitezei de migrare a spoturilor corespunztoare fraciunilor separate cu cele corespunztoare culorii spoturilor. Cea mai frecvent metod de identificarea const n compararea valorilor Rf ale spoturilor corespunztoare fraciunilor separate cu valorile Rf ale standardelor. Valoarea Rf este o mrime care reflect deplasarea compusului urmrit comparativ cu cea a solventului ( faza mobil).

Rf

Distana de la punctul de start pn n centrul spotului

Distana parcurs de solvent din punctul de start

CROMATOGRAFIA PE HRTIE Cromatografia pe hrtie utilizeaz ca support pentru separarea componenilor unui amestec o hrtie de filtru special, fabricat din puf de bumbac care conine 2000- 3600 de resturi de -glucoz, cu un numr mare de legturi de hidrogen ntre catenele poliglucidice. Mecanismul separrii componenilor se bazeaz pe coeficienii de repartiie diferii ai acestora ntre dou faze nemiscibile sau parial miscibile: faza staionar reprezentat de lichidul polar care mbib hrtia de filtru i faza mobil reprezentat de solventul organic care se deplaseaz dea lungul porilor hrtiei de filtru. Componenii cu solubilitate mai mare n faza staionar se vor deplasa cu vitez sczut, n timp ce componenii cu solubilitate mai mare n solventul organic vor prezenta o vitez de migrare mai mare. n funcie de direcia de deplasare a solventului i componenilor pe hrtia de filtru se disting urmtoarele tipuri de cromatografie pe hrtie: Cromatografia ascendent- deplasarea se face de jos n sus; Cromatografia descendent- deplasarea se efectueaz de sus n jos;

Cromatografia circular- deplasarea se efectueaz din centrul hrtiei spre exterior (radial).

Tipuri de cromatografie pe hrtie

cromatografie cromatografie ascendent

cromatografie

descendent

circular