1/22/23

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTĂ

PERFORMANȚĂ
(HPLC)

Catedra Chimie famaceutică şi toxicologică

2023

DEFINIȚIE
n Cromatografia de lichide de înaltă performanță ( engl. HPLC - High Perform ance Liquid
Chrom atography ) cunoscută în literatură şi sub denumirea de crom atografie de înaltă presiune
(High Pressure Liquid Chrom atography) este metoda cromatografică cea mai performantă şi este
folosită în separarea şi identificarea calitativă şi cantitativă a substanțelor din amestecuri
lichide.
n folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute în vedere următoarele:Separări şi analize
de substanțe imposibul de realizat prin alte metode pot fi realizate uşor prin HPLC, pentru care
este nevoie de o experiență practică bogată dar şi de cunostiințe stiințifice fundamentale. Avînd în
vedere că atît în cromatografia de gaze (GC) cît şi in cromatografia de lichide HPLC starea de
agregare inițială a probelor este cea lichidă trebuie luată decizia asupra metodei cromatografice

n HPLC – metoda analitică utilizată în scopul separării, identificării și dozării substanțelor organice și
anorganice aflate într-un amestec.
ANALIZE:
n Aplicații practice: farm aceutice
clinice
ü Separarea com ponenților;
toxicologice
ü Identificarea;
de m ediu
ü Dozarea; industriale
ü Puritatea substanței. alim entare

Clasificarea HPLC:

• Cromatografia de adsorbtie :

F faza stationara - adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice

F principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-desorbtie
F Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

F Interactiuni polare (dipol-dipol) – faza normala

• Cromatografia de schimb ionic :
F suprafata fazei stationare este incarcata ionic, de semn contrar ionilor
analitului

F specifica analitilor ionici/ionizabili

F Interactiuni ionice
• Cromatografia de excluziune sterică SEC (GPC) :

F umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

F proba este separata functie de marimea ionului solvatat

1
 1/22/23

(HPLC)
- În cromatografia de gaze proba trebuie adusă în stare gazoasă prin încălzire fără ca această
operație să ducă la distrugere integrității moleculare a speciei anlizate , dar in practică numai
cca 20 % din speciile moleculare îndeplinesc această condiție.
- În cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare şi au limite de detecție mai bune
decît la cromatografia de lichide
- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare cromatografică
necorespunzătoare în gazcromatografie ca urmare analiza lor trebuie făcută in cromatografie
lichidă
- în cromatografia de gaze există numai o singură fază staționară care poate interacționa cu
moleculele probei, faza solidă sau faza lichidă, cu aceasta fază poate absorbi proba gazoasă în
orice raport
- în HPLC atît faza staționară cît şi cea mobilă pot interacționa mai selectiv cu proba . M ultitudinea
acestor interacțiuni selective face cromatografia HPLC multilaterală față de cromatografia de
gaze cu ea putînt fi rezolvate probleme de separare avansată deosebit de complexe.
- În situațiile în care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru gazcromatografie
aceste analize au sensibilitate mai mare şi sînt mai rapide, iar dacă este vorba de determinări
curente la anumite clase de compuşi trebuie avut in vdere că un gazcromatograf este sensibil mai
ieftin decît un cromatograf pentru HPLC.

(HPLC)

n În cromatografia HPLC faza mobilă purtătoare denumită "Eluent" împreună cu substanțele lichide de
analizat este pompată cu ajutorul unei pompe printr-o coloană cromatografică de separare ce
conține faza staționară. În mod obişnuit înaintea coloanei de separare propriu zise se cuplează o
pre - coloană de separare pentru reținerea impurităților, coloană care este sensibil mai ieftină
decît coloana de bază. O coloană de separare într-un cromatograf HPLC are lungimea cuprinsă între 5
şi 30 cm iar debitul de fază mobilă este cuprins între 1-5 ml/min.

n La ora actuală există următoarele metode de cromatografie de lichide :

- cromatografie prin absorbție
- cromatografie prin repartiție
- cromatografie prin schimb ionic
- cromatografie de excludere cromatografie prin gel

Ø În cromatografia schimbătoare de ioni faza stationară este este o răşină schimbătoare de ioni iar
gradul de separare este dat de intensitatea interacțiunilor intre ionii probei şi grupele
schimbătoare de ioni din răşină .
Ø In crom atografia de excludere ca fază staționară este folosit un gel cu pori mari care poate
separa moleculele după mărime şi formă, la acest tip de cromatografie moleculele mari
traversează cel mai rapid sistemul cromatografic. Cromatografia cu lichide supracritice

(HPLC)
n Dacă în timpul separarii cromatografice compoziția substanței de analizat rămîne constantă
tehnica de cromatografică este denumită eluție izocratică. Dacă compoziția fazei analizate este
schimbată în timpul procesului de separare după o modalitate prestabilită, tehnica poartă
denumirea de eluție de gradient .Cea din urmă tehnică este folosită atunci cînd domeniul timpilor de
retenție a moleculelor din probă este atît de mare încît acetes nu pot fi eluate într-un timp
rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solvenți.
n Detectorii folosiți în HPLC lînt detectori selectivi, ceea ce înseamnă că ei nu răspund la toate
moleculele existente înt-un amestec ci numai la anumite molecule sau clase de compuşi. In
cromatografia de lichide încă nu există un detector universal şi de inaltă sensibilitate aşa cum este
de exemplu detectorul de ionizare cu flacără FID din cadrul cromatografiei de lichide, în schimb
detectoarele din cromatografia de lichide acoperă un număr mult mai mare de substanțe decît cele
din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe sînt greu de detectat în HPLC şi trebuiesc
aduse după părăsirea coloanei cromatografice într-o formă detectabilă tehnică denumită
derivatizare după coloană

2
 1/22/23

(HPLC)
n Ca şi la alte cromatografii în condiții tehnice date pentru analiza calitativă este definitoriu
timpul necesar unei molecule din probă pentru a traversa sistemul cromatografic şi a ajunge la
detector, timp denumit timp de retenție. Dat fiind numărul extrem de mare de substanțe
organice unele substanțe au timpi de retenție identici situație în care peak-urile se suprapun
putînd da naştere la erori importante de interpretare. Pentru înlăturarea acestui neajuns cele mai
importante detectoare pentru HPLC sînt spectrometrele. Tot mai des ieşirile din coloanele
cromatografice se cuplează la spectrometre clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de masă
(MS) situația clasică fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinații de aparate au
sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automată prin compararea
electronică a spectrului oricărei specii moleculare, în momentul sosirii ei din coloana cromatografică
la spectrometru, cu spectrele etalon din bibliotecă electronică de spectre.
n

(HPLC)
n Aparatura folosită în crom atografia HPLC
Cromatografele de lichide de înaltă performanță sînt formate dint-un sistem de vase cu
solvenți, o pompă de înaltă presiune, o coloană cromatografică, unul sau mai mulți
detectori, şi un sistem de prelucrare a datelor, ele mai sînt completate cu elemente de reglare
automată a debitului , a presiunii şi a temperaturii. In figura de mai jos este reprezentată schema de
principiu a unui cromatograf de lichide.

Fig. S chem a de principiu a unui crom atograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil înaltă presiune, 3-m anom etru înaltă presiune, 4-reductor de
presiune, 5- m anom etru de joasă presiune, 6- sistem distribuitor şi dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- distribuitor, 10 ,11-filtru, 12-sistem
de injecție probă, 13-purjă , 14-pom pă de în altă pres iune , 15- precoloană, 16-filtru, 17-distribuitor, 18-coloana crom atografică, 19-incintă
de term ostatare coloa nă, 20-detec to r, 21- am plificator electronic, 2 2-sistem de achiziție şi prelucrare date, 23-sistem de calcul, 24-im prim antă

(HPLC)
n Trebuie avut în vedere că în HPLC se folosesc solvenți organici puternici sau soluâii tampon
care pot ataca chimic orice componentă ce se găseşte în traseul lor de la recipientele de stocare
pină la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest traseu trebuie să prezinte o
rezistență chimică corespunzătoare. O altă recomandare este aceea ca volumul mort , denumit şi
volum extracolumnar, între introducerea probei şi traversarea detectorului să fie menținut cît mai mic
posibil prin aceasta evitîndu-se o lățire de bandă (vezi şi cap). Reducerea volumului mort se
realizează în primul rînd prin măsuri constructive ale furnizorului de cromatograf şi prin de alegerea
corespunzătoare a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rînd elementele
componente ale unui cromatograf de tip HPLC
n Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator. În esenta, un
cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai prezentat colectorul de
fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemanarea cu GC
singura deosebire majora constituind-o sursa de eluent – pompa.

3
 1/22/23

Principalele componente ale cromatografului de lichide

sunt:

n - sistemul de alimentare cu fază mobilă

n - dispozitivul pentru introducerea probei
n - una sau două pompe
n - coloana
n - detectorul
n - sistemul de prelucrare a datelor

10

Dispozitivul pentru degazare

Este necesar pentru îndepărtarea din solvenți a gazelor
dizolvate, mai ales a oxigenului, care în timpul trecerii prin
coloana ar putea reacționa cu faza stationară, sau ar
putea forma bule de gaz cu o influență nefavorabilă atât
asupra separării cât mai ales a detecției, ținând cont de
volumul foarte mic al celulelor detectoarelor moderne.

11

Dispozitivul pentru alimentarea cu solvenți:

poate fi foarte diferit ca complexitate, de la un simplu rezervor de solvenți în
cazul eluției izocratice , până la un programator de eluent pentru doi sau trei
solventi: pentru eluțiile de gradient.

Elutie izocratica, cu un singur eluent sau cu un amestec de eluenți de compoziție

constanta;

Elutie cu gradient, utilizând un amestec de doi solvenți a cărui compoziție este

modificataă continuu în timpul eluției.

12

4
 1/22/23

Eluția componentelor
Eluția izocratică
Eluția izocratică este recomandată mai ales atunci când se urmarește
separarea unui component nepolar dintr-un amestec de componenți mai polari.
În acest caz se folosește un eluent cu polaritate apropiată de cea a componentei
urmarite, care va elua doar compusul respectiv, ceilalți compusi, mai polari,
rămânând adsorbiți în partea superioara a coloanei.

Eluarea cu gradient
Eluarea cu gradient este utilizată atunci când se urmărește schimbarea
compoziției eluentului într-o maniera constantă și uniformă. Acest tip de eluție se poate
realiza utilizând două rezervoare, unul conținând solventul mai polar iar celalalt pe cel
nepolar. Solventul mai polar trece, cu debitul F1, într-o camera de amestecare în care
se găsește solventul mai puțin polar. Din aceasta camera, are loc trecerea amestecului
de solvenți în coloană, cu debitul F2. Se pot genera diferiți gradienți prin variația celor
doua debite. Prin utilizare eluției cu gradient, se pot separa într-o singura analiza
compuși cu polarități mult diferite.

13

Injectarea probei
Valvele de injecție permit introducerea reproductibilă a probelor în coloanele cromatografice
aflate sub presiune, fără întreruperea curgerii fazei mobile. Proba este încarcată la presiune
atmosferică într-o bucla exterioară a valvei de injecție si este apoi introdusă în faza mobilă printr-
o simplă rotire a valvei. Volumul de probă introdusă variază între 2μl și mai mult de 100 μl și
poate fi modificat prin schimbarea buclei de injecție sau folosind valve speciale cu volum variabil
de probă.

14

Injectarea probei

n Introducerea probelor poate fi realizată în două moduri: prin injecție cu

ajutorul unei seringi sau prin folosirea unei valve (robinet) de injecție cu mai
multe canale.

15

5
 1/22/23

Injectarea probei

16

Injectarea probei
Pentru analize în serie se recomandă
folosirea unor dispozitive de introducere
automată a probelor.

17

Coloana cromatografică
Umpluturile folosite in cromatografia de lichide moderna au dimensiuni mici, sunt rigide si uniforme. Ele pot
fi clasificate în urmatoarele categorii:
- Particule polimerice pe baza de silicagel care sunt mai eficiente si mai stabile mecanic.
- Particule superficial poroase (peliculare), cu diametrul cuprins între 30-55 μm, care constau dintr-un
învelis subtire (1-3 μm) de silicagel, dispus pe un nucleu dintr-un material inert, de exemplu granule
sferice de sticla. Asemenea umpluturi peliculare se mai folosesc în anumite aplicatii de cromatografie
de schimb ionic, însa utilizarea lor a înregistrat un puternic regres odata cu dezvoltarea umputurilor total
poroase.
- Particule total poroase de silicagel, cu diametre mai mici decât 10 μm care sunt cele mai folosite la
ora actuala pentru coloanele analitice HPLC. Comparativ cu umpluturile peliculare, ele ofera o serie de
avantaje în ce priveste eficienta coloanei, capacitatea de încarcare cu proba si viteza analizei.

18

6
 1/22/23

Coloana cromatografica
n Pentru creșterea duratei de utilizare a unei coloane de
analiza HPLC se recomanda introducerea unei coloane
de protecție (pre-coloană, guard column). Aceasta este o
coloana mica ce se amplaseaza între injector si coloana
analitica și previne pierderea eficientei coloanei analitice
datorită prezenței anumitor impurități prezente în proba
sau solvent, de exemplu a celor care se adsorb foarte
puternic.

19

Coloana cromatografica

20

Cromatografie cu faza normala

• faza stationara – puternic polara (silicagel)

• faza mobila – nepolara

21

7
 1/22/23

Cromatografie cu faza inversa

•faza mobila – polara (faza organica - CH3OH,

CH3CN, THF si/sau apa, cu/fara sol. tampon)

• faza stationara – nepolara, lanturi

hidrocarbonate hidrofobe legate de silice :

22

Eluția componentelor
Eluția izocratică
Eluția izocratică este recomandată mai ales atunci când se urmarește
separarea unui component nepolar dintr-un amestec de componenți mai polari. În acest
caz se folosește un eluent cu polaritate apropiată de cea a componentei urmarite, care va
elua doar compusul respectiv, ceilalți compusi, mai polari, rămânând adsorbiți în partea
superioara a coloanei.

Eluarea cu gradient
Eluarea cu gradient este utilizată atunci când se urmărește schimbarea compoziției
eluentului într-o maniera constantă și uniformă. Acest tip de eluție se poate realiza
utilizând două rezervoare, unul conținând solventul mai polar iar celalalt pe cel nepolar.
Solventul mai polar trece, cu debitul F1, într-o camera de amestecare în care se găsește
solventul mai puțin polar. Din aceasta camera, are loc trecerea amestecului de solvenți în
coloană, cu debitul F2. Se pot genera diferiți gradienți prin variația celor doua debite.
Prin utilizare eluției cu gradient, se pot separa într-o singura analiza compuși cu polarități
mult diferite.

23

HPLC. Detectori utilizati in crom atografia de lichide de înalta perform anta (HPLC)

n Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii în cromatografie sunt
instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o coloana si care pot înregistra continuu
substantele separate de catre aceasta. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa
se observe modul cum decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar
semnalul lor.
n Întrucât coloanele de separare performante au capacitati de încarcare mici, sistemul de detectie trebuie sa fie
unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca în LC volumul de proba este de ordinul microlitrilor (8-10µl), volumul
detectorilor trebuie sa fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza în mod continuu picul cromatografic.
n În calitate de instrumente se poate utiliza, în principiu, oricare dispozitiv de analiza chimica cunoscut, pentru
probe lichide, precum si orice combinatii de instrumente fizice. De exemplu, în ultimul timp, combinatia dintre
un detector refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace în analiza polimerilor în
amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar
n posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica în urma adaugarii, cu un debit controlat, a
unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate practica chiar înainte de introducerea probei
în coloana, dar si dupa iesirea din coloana a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pâna în prezent
în special legata de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza
unor amestecuri de compusi numerosi având aceleasi functiuni reactive (de exemplu aminoacizi).
n Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente analitice si oarecum similare cu
cele descrise la metoda GC.

24

8
 1/22/23

HPLC. Detectori spectrofotom etrici în UV-VIS

n Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pâna în prezent, atât în LC, cât si în HPLC. Pentru a
putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie colorati - adica sa absoarba lumina pe
domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent
pentru acelasi domeniu spectral.
n Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert- Beer (A=elC). Deci
unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita de detectie sau zgomotul de fond se
prezinta în cazul acestor detectori în AUFS (prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de
absorbanta raportate la întreaga scala, l. engl.). Astfel în cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de
0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1% .
n Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele substante organice, anume
cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti,
absorb lumina în UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor
hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH 2). Între acestea se includ si
numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc.Un mare avantaj al acestor detectori
este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct
proporționala cu coeficientul de extincție si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului
ar trebui mărita lungimea celulei dar aceasta este restricționata. Sensibilitatea este de ordinul 5x10 -
8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.

25

HPLC

n Se pot distinge si în cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.

1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza doar la o lungime
de unda. Modelul cel mai raspândit se compune dintr-o sursa luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de
mercur, un monocromator care separa un domeniu îngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un
detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentata în figura de mai jos.

Fig. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric

26

HPLC
I = I0·e-kb (1)
unde k este o constantă. Ecuația precedentă reprezintă una din formele legii lui Lambert - Beer.
Prin convenție, se numește transmitanță fracția transmisă, I a intensității, raportată la I0, prin cuva
cu soluție, T, adică:

T = I/I0 (2)
iar legea Lambert - Beer mai poate fi scrisă și:
ln(I/I0) = -kb sau ln(I0/I) = kb (3)
Numim absorbanță, notată A, logaritmul natural, cu semn schimbat al transmitanței:
A = -ln(T) (4)

27

9
 1/22/23

HPLC

1. Detectorii policromatici mai frecvent utilizați în cromatografele HPLC moderne permit si selectarea
lungimii de unda la care se lucrează, dar chiar pot înregistra electronic absorbanta celulei la mai
multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai mare siguranța analizei, în sensul
ca permite stabilirea purității, adică daca picul constituie un sem nal dat de o singura
substanța sau de un amestec (ceea ce se cunoaşte sub numele de stabilirea purității picului).
n Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentată în figura. Detectorul este format
dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1µl-10µl care este intersectata de coloana cu eluent.
Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treacă prin celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada
pe fotoelement (6). Semnalul de la fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta măreşte
intensitatea semnalului) si apoi la sistemul de achiziție, prelucrare si afişare a datelor obținute
(8); rezultatul este o cromatograma (9) ale cărui picuri va oferi informații calitativa si
cantitative despre substanțele din soluția analizata.
n

28

HPLC. Detectori refractometrici

Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii.
ü Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de transmitere a luminii prin medii
transparente având un indicele de refractie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece
printr-o celula cu doua compartimente unul continând doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste
coloana , (vezi figura)
3 8

1 M
5 6

9 7
6’
C
I

2 10
t

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce separa cele 2 incinte, prin
amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6’ iar o
parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt diferite, motorul
primeşte un semnal de corecție, in scopul egalizării tensiunilor, astfel are loc compensarea modificării
indicilor de refracție. In urma deplasarii şurubului 8 , sistemul înregistrator 9 va înregistra datele sub forma
unei cromatograme.

29

HPLC. Detectori refractometrici

n Diferenta dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate în cele doua compartimente vor fi practic
nule, atâta timp cât din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita în momentul în care în eluent mai
apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. În momentul iesirii unui
component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din detector - deplasare care este
proportionala cu concentratia si sesizata de catre detector.
n În cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face necesara aducerea
liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lânga sensibilitatea relativ coborâta (10-5mol·L-1),
constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat în cromatografia cu
gradienti deoarece, în acest caz, compozitia eluentului la intrarea în coloana difera de cea de la
iesire si se modifica continuu, neexistând o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte
sensibil la temperatura (±0.0001°C) fiind necesara termostatarea, atât a detectorului cât si a
coloanei.

30

10
 1/22/23

Detectorii electrochim ici

n Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si cantitativa la amestecuri
de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv reduce. Intru-cat marea majoritate a
substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor
au devenit foarte performante momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta
metoda analiza si identificare a substantelor.
n Exista doua tipuri de detectori electrochimici:
- Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti
-P rincipiul de functionare al detectorului conductom etric. 1- generator
de inalta frecventa, 2- celula conductom etrica, 3- electrozi de platina,
4- sustanta de analizat ce vine de la coloana crom atografica, 5-
substanta iese din celula conductom etrica, 6- am plifica to r, 7-
sis tem de ach iziție , p relucrare si afişare a datelo r, 8-
crom atogram a in coordonate conductivitate si tim p

- Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la substantele

organice; P rincipiul de functionare al detectorului electrochim ic
am perom etric. 1- substantele ce vin de la coloana
crom atografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar
4- celula electrochim ica,5- tub capilar p rin care circula
substa nța de analiz at, 6- electrodul de referinta, 7-
substanta iese din tubul capilar, 8- am plificator, 9- sistem de
achiziție, preluc ra re si a fişa re a datelor,10 -
crom atog ram a in coo rdonate intensitatea cinetica si tim p

31

HPLC Alti detectori

n Detectorii de fluorescenta
n Detectoare Diode Array
n Alti detectori:

T a b . A lti d e te c to ri u tiliz a ti în L C

Detectori LC Limita de Caracteristici Disponibilitateco

detectie merciala
Fluorimetrici 1-10pg Este necesara uneori derivatizarea Da
Sensibilitate 10-10M
Electrochimici 10pg = 1ng Sensibilitate 10-10M Da
(Amperometrici) Compusi oxidabili sau reductibili
Bazati pe 100pg - Necesare coloane Da
Spectrometria 1ng capilareNecesara
de Masa (MS) pulverizarea Pret de
cost ridicat
FT-IR 1µg Pret de cost ridicat Da

Difuzia luminii 10µg Adecvati pentru macromolecule Da

Activitate optica 1ng Pentru substante optic active Nu
Electrozi ion 10ng Doar pentru ioni sau Nu
selectivi compusiionizabili

Fotoionizare 1pg- 1ng - Nu

32

Detectoare cromatografice
RI UV/VIS Fluorescent MS
a
Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv
Sensibilitate 4 5 3 1
microgra nanogra picograme picogram
me me
Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la DA NU NU NU
temperatura

33

11
 1/22/23

Aspectul unui HPLC

34

Aspectul unui HPLC

35

Factorii care influențează separarea cromatografică

• Coloana: dimensiuni (L,d), T D im ensiunea Tim pul de P resiunea

• Faza stationara: natura, diametrul particulelor retentie (bar)
(m in)
particulelor (μ m )
5 30 19
• Faza mobila: tipul de elutie, debitul,
3 18 87
solventii 1,5 9 700
• Analitul: polaritate, masa
moleculară, concentrație

Faza mobila
• compatibila cu elementele instrumentului si cu faza
staționară
• puritate avansată
• compresibilitate si vascozitate scazute
• lipsită de gaze dizolvate (aer) – rezultatul UV si
probleme de compresibilitate

36

12
 1/22/23

Principalele avantaje HPLC:

n avantaje HPLC:
1. Capacitate înaltă de separare

2. Viteza optimă a separării

3. Posibilitatea monitorizarii continue a efluentului coloanei

4. Realizarea unor analize repetate și reproductibile utilizând

aceeași coloană

5. Automatizarea procedurii analitice și a prelucrării datelor.

37

HPLC

Întrebări

38

13