Cromatografia

Cromatografia

 numele lui Mihail Ţvet este legat de analize din domeniul

botanicii dar şi de introducerea termenului de cromatografie.
 a folosit o coloană umplută cu carbonat de calciu pentru
separarea unor pigmenţi din plante
 in 1903, a eluat un extract din frunze prin acea coloană,
 a observat componenţii dispuşi sub formă de discuri colorate în
diferite zone ale coloanei
 a denumit tehnica „cromatografie” de la cuvântul grecesc
„chroma” – culoare
 ulterior s-a demonstrat faptul că principiul metodei nu are
legătură cu culoarea,
◦ formarea unor zone colorate în coloana lui Ţvet s-a datorat
culorilor pe care compuşii din extractul de frunze le au în
acel mediu.
 Cromatografia
Cromatografia

 o metodă de separare bazată pe repartiţia

diferenţiată a componenţilor unui amestec de
separat între două faze în contact şi care se
situează într-un raport de mişcare relativă una faţă
de cealaltă

 separarea cromatografică este rezultatul unor

procese repetate de sorbţie – desorbţie a
componenţilor probei între faza staţionară si faza
mobilă
Principiul cromatografiei
Principiul cromatografiei

Cs
K K
(i)m (i)s Cm
Clasificarea metodelor
Clasificarea metodelor cromatografice
cromatografice in
in functie
functie de
de
natura fazelor
natura fazelor

Faza Faza Denumire Simbol

mobilă staţionar
ă
gaz solid cromatografia de repartiţie CGS
gaz-solid
gaz lichid cromatografia de repartiţie CGL
gaz-lichid
lichid lichid cromatografia de repartiţie CLL
lichid-lichid
lichid solid cromatografia de repartiţie CLS
lichid-solid
fluid solid sau cromatografia de fluide în CFS
supercritic lichid stare supercritică
 Clasificarea tehnicilor
Clasificarea tehnicilor cromatografice
cromatografice
• După modul de dispunere a fazei staţionare
Cromatografie cu
Cromatografia Cromatografia
fluide în stare
gazoasă lichidă
supercritică
Coloane cu Coloane cu Hârtie (PC)
umplutură umplutură Strat subţire (TLC)
Coloană cu
Coloane capilare Coloane capilare
umplutură

• După scopul separarii

• preparativ: purificare, obtinerea unor intermediari sau produsi finiti
• analitic: obtinerea unor informatii referitoare la compozitia unor probe
 Clasificarea tehnicilor
Clasificarea tehnicilor cromatografice
cromatografice

 parametrii de operare (temperatura coloanei, debitul sau

compoziţia eluentului) :
◦ eluţia cu parametri de operare constanţi (temperatură,
presiune, compoziţia eluentului) – condiţii izocratice;
◦ eluţia cu parametri de operare variabili (cu gradient).

 presiunea de lucru şi performanţele de separare:

◦ cromatografia convenţională (clasică), la presiune
atmosferică sau 1-2 atm. peste aceasta;
◦ cromatografia de înaltă performanţă (înaltă presiune)
 cromatografia gazoasă de înaltă rezoluţie - HRGC
 cromatografia lichidă de înaltă presiune - HPLC
 cromatografia pe strat subţire de înaltă presiune - HPTLC
 Clasificarea tehnicilor
Clasificarea tehnicilor cromatografice
cromatografice

 raportul polar/nepolar al compoziţiei fazelor :

◦ cromatografia lichidă cu faze normale (NP-LC)

 faza staţionară este polară
 faza mobilă are polaritate mai redusă

◦ cromatografia lichidă cu faze inverse (reverse) (RP-LC)

 faza staţionară este nepolară
 faza mobilă are polaritate mai mare
Clasificarea tehnicilor
Clasificarea tehnicilor cromatografice
cromatografice
 Procesul cromatografic
Procesul cromatografic de
de separare
separare

 se realizează prin
alternarea succesivă a
stărilor de echilibru şi
neechilibru generate de
repartiţia analitului între
faze.

Schema unui cromatograf:

1–sursa de eluent; 2-regulator de debit (sau presiune);
3–sistem de injecţie; 4–coloană; 5–detector; 6–termostat,
7–calculator cu soft specializat; 8–imprimantă
 Faza mobilă
Faza mobilă (eluentul)
(eluentul)

 Faza mobila:
◦ transporta proba prin coloana cromatografică
◦ asigură mediul de repartiţie diferenţiată

 Regulatorul de debit:
◦ controleaza debitul eluentului, gazos sau lichid, în
regim izobar sau cu gradient

◦ debitmetru - GC
◦ pompă - LC
 Sistemul de
Sistemul de injecţie
injecţie
 permite introducerea manuală (seringă) sau automată
(injector) a probei
 asigură reproductibilitatea cantităţii de probă introduse în
coloană
 injectoarele sunt dispozitive cu construcţie diferită pentru
CG si CL
 eficienţa separării şi calitatea rezultatelor depind în mare
măsură de etapa de introducere a probei
 Coloana cromatografică
Coloana cromatografică
 sediul fazei staţionare
 conţine, la un moment dat, cele două faze cromatografice şi
amestecul de compuşi
 se realizează separarea componentelor probei
 din cauza interacţiunii moleculelor amestecului cu faza
staţionară componenţii din probă rămân în urma eluentului, în
funcţie de diferenţele care există între constantele lor de
echilibru de repartiţie, între cele două faze: K1 ≠ K2
 se produce o diferenţiere a vitezelor lor de migrare şi, în final,
separarea
 Detectorul
Detectorul
 pune în evidenţă componenţii care părăsesc coloana
cromatografică antrenaţi de faza mobilă
 este capabil să perceapă o anumită proprietate specifică
componenţilor probei
◦ nespecifica eluentului
 termica
 electrica
 electromagnetica
 optica
 radiometrica
 există două categorii de detectori:
◦ universali: pot evidenţia un număr mare de componenţi
◦ specifici: pot detecta numai anumiţi componenţi
 Detectorul
Detectorul
 transformă „informaţia” despre proprietatea percepută într-un
semnal electric
◦ astfel încât să poată fi reprodus sub formă grafică
 este piesa cea mai importantă a unui cromatograf după coloana
cromatografică

 diferenţiali
◦ măsoară concentraţia instantanee sau debitul de masă al
solutului care iese din coloana cromatografică
 integrali
◦ acumulează răspunsul datorat componenţilor probei
◦ semnalul înregistrat dă informaţii despre cantitatea totală de
compuşi care au ieşit din coloana cromatografică la un anumit
moment
 termostatul asigură temperatura uniformă a întregului sistem
prin care circulă proba.
 Calculatorul
Calculatorul
 este conectat sistemului cromatografic printr-un
program (soft) specializat

 are un dublu rol

◦ asigură comanda operaţiilor cromatografice
(automatizare):
 startul şi sfărşitul eluţiei,
 operarea în condiţii izocratice sau de gradient,
 volumul şi ordinea probelor de injecţie etc.
◦ preia semnalele amplificate de la detector,
◦ stochează şi prelucrează rezultatele separării sub
formă de tabele de valori şi-sau cromatograme
 Picul cromatografic
Picul cromatografic sisi cromatograma
cromatograma
 compusii sunt purtati de faza mobila de-a lungul fazei
stationare cu viteze diferite de parcurs
◦ ceea ce duce la separarea lor

 compuşi sunt separaţi dintr-o probă complexă sub formă de

zone distincte cu o distribuţie de tip Gauss a concentraţiei lor in
faza stationara
 picul cromatografic este reprezentarea grafică a acestei
concentraţii Gaussiene
◦ maximul picului corespunde zonei de concentratie maxima a
compusului

 cromatograma este reprezentarea grafica a separarii

amestecului de compusi
 Cromatograma
Cromatograma
 reprezintă rezultatul unei separări cromatografice
 este generată de procesul de detecţie a analiţilor, în ordinea
eluţiei acestora
 procesul de detecţie constă în măsurarea continuă, în timp, a
unei proprietăţi care caracterizează, după caz, totalitatea sau
numai anumite specii de analiţi separate în procesul
cromatografic
4
2
0 – start; 5
1 – pic de sistem; 3 6
2 – pic frontal;
3 – pic simetric; 1
0
4-5 – picuri suprapuse,
substante neseparate);
6 – pic cu coada Timp
Reperele picului
Reperele picului cromatografic
cromatografic
- lărgimea picului la punctul de
inflexiune (Wi);
- lărgimea picului la jumătate din
înălţimea lui (W0,5);
- lărgimea picului la bază –
determinată între punctele în care
tangenta la curbă prin punctul de
inflexiune intersectează abscisa
(Wb);
- înălţimea picului (H);
- înălţimea picului la punctul de
inflexiune (Hi/H0,61);
- înălţimea picului la jumătatea lui
(H0,5)
- deviaţia standard la punctul de
wi = 2σ inflexiune a curbei Gauss ( )


wh = 2,354σ wb = 4σ
 Picul cromatografic
Picul cromatografic

 dă informaţii despre două tipuri de parametri:

◦ calitativi (identificare):
 timpul de retenţie absolut; volumul de retenţie absolut;
 timpul de retenţie relativ; volumul de retenţie relativ;
 retentia
 factorul de capacitate

◦ cantitativi (dozare):
 aria
 înălţimea picului cromatografic (pt picuri f inguste).
 Timpul de
Timpul de retenţie
retenţie absolut
absolut

 tR
◦ reprezintă timpul scurs de la injectarea probei în
sistemul cromatografic, până în momentul detecţiei
unui răspuns maxim (eluţia uneia din speciile
separate)

◦ dacă două specii nu prezintă constante de echilibru

de repartiţie diferite, ele co-eluează (ies sub acelaşi
pic) şi au acelaşi tR

◦ între 0 şi tR1
 Timpul de
Timpul de retenţie
retenţie relativ
relativ
 timp de retenţie ajustat, timp de sorbţie (tR’)

◦ corespunde timpului pe care o specie de analit îl

petrece în faza staţionară

◦ diferenţa dintre timpul de retenţie absolut şi timpul

de retenţie relativ corespunde perioadei de timp pe
care solutul a petrecut-o doar în faza mobilă

◦ între tel şi tR1

 Timpul mort
Timpul mort

 timpul de desorbţie (tM)

◦ timpul necesar frontului de fază mobilă pentru a
parcurge coloana cromatografică
 definiţie alternativă
◦ timpul de retenţie absolut al unui compus care nu
interacţionează deloc cu faza staţionară şi iese din
coloană odată cu eluentul (constanta sa de distribuţie K
fiind nulă)

◦ intre 0 si tel

◦ tR = tR’+ tM
 Volumul mort
Volumul mort

 volumul de faza mobila necesar pentru umplerea coloanei

cromatografice

VM  0.5Ld 2
c
 VM = volum mort
 L = lungime coloana (cm)

 d = diametru coloana (cm)

 in cazul
c
unei coloane de 250mmx4,6mm, volumul mort va fi
2,645 mL
 importanta: spalarea coloanelor, echilibrarea coloanelor in
cazul lucrului in gradient
 Timpul mort
Timpul mort

 in cazul unei coloane cromatografice de

250mmx4,6mm, daca debitul este de 1 mL/min,
timpul mort va fi de 2,645 min

 semnificatie: orice compus care elueaza intr-un

timp mai scurt de 2,645 min nu este retinut de
coloana
VM
 t0 = timp mort to 
 VM= volum mort F
 F = debit
 Retenţia
Retenţia
◦ definitie:
 viteza relativă de migrare a moleculelor unui compus
faţă de cele ale eluentului

◦ reprezintă capacitatea fazei mobile de a reţine moleculele

componenţilor amestecului
V
R
Vel
 volumele de retenţie sunt direct proporţionale cu timpii de
retenţie, având ca factor de proporţionalitate debitul fazei
mobile

VR  D t R
 Factorul de
Factorul de capacitate
capacitate

 raport al numărului de moli ai aceluiaşi compus

repartizaţi la echilibru între cele două faze
nS
k
nM
 mărimea care indică de câte ori timpul de repartiţie
a speciei de analit în faza staţionară este mai mare
decât timpul cât acesta se găseşte în faza mobilă
t 'R t R  t M
k'  
tM tM
 Evaluarea performanţelor
Evaluarea performanţelor procesului
procesului
cromatografic
cromatografic
 selectivitatea, prin:
◦ parametri de retenţie (R, tR, VR,)
◦ factorul de capacitate (k)
◦ factorul de selectivitate (α);
 eficienţa, prin:
◦ numărul de talere teoretice (N)
 numărul de echilibre de repartiţie între cele două
faze, care se realizează pe toată durata procesului de
separare
◦ înălţimea echivalentă a talerului teoretic (H);
 separabilitatea, prin:
◦ largirea zonei (2) – dispersia zonei
◦ rezoluţie (Rs)
 Selectivitatea
Selectivitatea

• reprezintă capacitatea sistemului cromatografic de a separa

doi analiţi cu proprietăţi asemănătoare eluaţi consecutiv
• este determinată de afinitatea diferenţiată a celor doi analiţi
faţă de cele două faze

• k: factorul de capacitate (de retentie)

1<k<10

ns CsVs
k 
nm CmVm
 Selectivitatea
Selectivitatea
Factorul de selectivitate (de separare) - α

α = K 2 / K 1 = k2 / k 1

 dacă α=1, adică cei doi analiţi au acelaşi coeficient

de distribuţie, ei nu pot fi separaţi şi sistemul
analitic trebuie modificat

 > 1,05

 α se calculează din informaţiile date de

cromatogramă
'
t
α R2
'
t R1
 Eficienţa
Eficienţa
• capacitatea sistemului cromatografic de a elua analiţii supuşi separării
cu o dispersie cât mai mică în coloană

t 2R t 2R t 2R t 2R
N  2  16 2  5,545 2  4 2
σ wb w 0,5 wi
N: numar de talere teoretice (marime adimensionala)
σ2: dispersie

• zona din coloana cromatografică în care se realizează un proces

elementar de repartiţie la echilibru
• lungimea de coloană în care este atinsă o singură stare de echilibru
poartă denumirea de înălţime echivalentă a talerului teoretic

H = L/N
 Rezolutia
Rezolutia
t R 2  t R1
Rs 
2(σ1  σ 2 )
 este o măsură mai explicită a gradului de separare a doi compuşi
◦ Rs: rezolutia
◦ tR2 – tR1: diferenta timpilor de retentie a doi compusi separati consecutiv
◦ σ1 + σ2: suma abaterilor lor
 este mărimea care caracterizează global calitatea separării, fiind măsurabilă prin
parametri care definesc picul cromatografic

Rs 1 R s  1,2
 Analiza calitativă
Analiza calitativă (identificarea)
(identificarea)
 metode indirecte, informatia fiind obtinuta prin comparare cu
alte sisteme
1. compararea parametrilor de retentie (tR, VR, k)
2. compararea rezultatelor obţinute în acelaşi sistem
cromatografic dar cu sisteme diferite de detectie
3. compararea informaţiilor obţinute prin cromatografie cu cele
obţinute prin tehnici complementare
 metoda directa:
◦ doparea soluţiei probă (se adaugă soluţiei probă compuşii
bănuiţi a fi existenţi)
 creşterea semnalului picului corespunzător compusului de
dopaj confirmă existenţa lui în probă (indentificarea)
◦ utilizarea detectorilor UV cu lungimi de unda multiple sau cu
retea de diode (DAD)
 permit ridicarea spectrelor compuşilor analizaţi
◦ identificarea compusilor pe baza spectrelor UV
 Identificarea prin
Identificarea prin compararea
compararea parametrilor
parametrilor de
de
retentie
retentie

 se compara parametrii de retentie ai componenţilor

analizati
◦ tR, (VR), k
◦ cu cei similari ai unor etaloane cunoscute
◦ din literatura de specialitate
◦ baze de date
◦ sau din rulaje proprii
◦ obtinute în aceleaşi condiţii cromatografice
 Identificarea prin
Identificarea prin compararea
compararea alte
alte sisteme
sisteme de
de
detectie
detectie
 se compara rezultatelor obţinute în acelaşi sistem
cromatografic
◦ dar cu sisteme diferite de detectie
◦ detectori specifici anumitor grupuri de compuşi

Cromatogramele
comparative
confirma
prezenta CH4
(identificare)
 Identificarea prin
Identificarea prin compararea
compararea cu
cu tehnici
tehnici
complementare
complementare
 se compara informaţiile obţinute prin cromatografie cu cele
obţinute prin tehnici complementare:

◦ alte tehnici analitice (AAS, ICP, UV, IR, MS)

◦ alte sisteme cromatografice (HPLC cu IC)
◦ alta metoda de separare (CE)
◦ utilizarea detectorilor UV cu lungimi de unda multiple sau
cu retea de diode (DAD)
 permit ridicarea spectrelor compuşilor analizaţi
 identificarea compusilor pe baza spectrelor UV
◦ tehnici cuplate
 GC-MS, GC-ICP, HPLC-MS, LC-AAS, CE-MS
 Analiza cantitativă
Analiza cantitativă (determinare
(determinare cantitativa)
cantitativa)

 constă în determinarea concentraţiei (sau a cantităţii)

analiţilor separaţi

 presupune patru etape:

◦ separarea compuşilor (obţinerea cromatogramei);
◦ identificarea compuşilor corespunzători picurilor
individuale;
◦ determinarea înălţimii sau ariei picurilor;
◦ corelarea înălţimii/ariei picurilor cu concentraţia
componentului

 se utilizează:
◦ înălţimea picurilor – pentru picuri înguste
◦ aria picurilor – pentru picuri mai largi
 Analiza cantitativă
Analiza cantitativă

 suprafaţa integrată a unui pic este direct

proporţională cu cantitatea de solut eluat

 măsurarea suprafeţei se face prin:

 metoda triunghiului,
 metoda planimetrării,
 metoda decupării şi cântăririi,
 integrarea electronică.
 Metode de
Metode de calcul
calcul
1. normalizare internă
2. metoda curbei de calibrare
3. metoda standardului extern
4. metoda standardului intern
5. metoda adaosului standard

1. Metoda de normalizare
 compoziţia procentuală este determinată prin
măsurarea ariei fiecărui pic şi împărţirea ariilor
individuale la aria totală
 aceasta metoda presupune
◦ că au fost eluati toti compusii probei
◦ că răspunsul detectorului este acelaşi pentru
fiecare compus
 rezultatul este dat sub forma concentratiei
procentuale
 Metoda curbei
Metoda curbei de
de calibrare
calibrare
Etape:
1. trasarea unei curbe de calibrare, obtinuta cu solutii
standard, pentru fiecare compus identificat
2. determinarea ecuaţiei dreptei celei mai probabile
3. determinarea ariei picului din cromatograma probei si
determinarea concentraţiei analitului

Arie □

pic
a. ○ b.
Eroarea de
○ deterninare
cantitativă
○
○

Conc

Curba de calibrare: a. cu mai multe soluţii standard (○); b. cu o singură soluţie

standard (□) şi eroarea de determinare cantitativă
 Metoda standardului
Metoda standardului extern
extern
 presupune utilizarea curbei de calibrare si a ariei picului cromatogramei
unui standard de concentraţie cunoscută, pentru determinarea concentraţiei
analitului din probă
 metoda nu diferă în principiu de metoda curbei de calibrare
◦ diferenta: se realizează o singură determinare cu standardul extern care
trebuie să aibă o concentraţie cat mai apropiată de concentraţia analitului
din probă

A i Cs
Ci 
C , C – concentraţia compusului de
i s analizat,
A s respectiv a standardului extern
Ai, As – aria corespunzătoare picului compusului de analizat, respectiv a picului
standardului extern
 Metoda standardului
Metoda standardului intern
intern
 constă în adăugarea la proba de analizat (înainte de a fi
analizată), a unei cantităţi cunoscute dintr-o substanţă
standard
 substanţa utilizata ca standard intern trebuie să
îndeplinească următoarele condiţii:
◦ să nu fie unul din compusii din proba de analizat
◦ să poată fi separată complet de ceilalţi componenţi ai
probei
◦ să aibă o concentraţie comparabila cu cea a analiţilor
de determinat
Aifi
Ci  Cs
Asfs
Ci, Cs – concentraţia compusului de analizat, respectiv a standardului
intern
Ai, As – aria corespunzătoare picului compusului de analizat, respectiv a
picului standard
fi, fs – factorul de răspuns al detectorului pentru cei doi compusi
 Metoda adaosului
Metoda adaosului standard
standard

 Etape:
◦ se determină aria picului corespunzător analitului,
Ai, din cromatogramă
◦ se adaugă o cantitate cunoscută din analit
(adaosului standard), de concentraţie Cs în probă
◦ se obţine o nouă cromatogramă, din care se
determină aria A (A = Ai + As)
◦ diferenţa dintre suprafeţele celor două picuri
cromatografice (A - Ai = As) reprezinta aria
suprafetei unui pic care ar corespunde doar
adaosului standard, de concentratie Cs
Cs A i
Ci 
A  Ai