Cromatografia de lichide de înaltă performanţă HPLC

Introducere
Cromatografia de lichide de înaltă performanță notată prescurtat HPLC ( high
performance liquid chromatography) este în prezent mult utilizată deoarece permite analiza
substanțelor moleculare organice, organo-metalice și anorganice , inclusiv a compușilor cu masă
moleculară ridicată naturali sau sintetici.
Eficacitatea coloanelor in HPLC este mai mică decat cea din cromatografia de gaze. În
schimb, in cazul HPLC se poate modifica atat faza stationara cat si cea mobila ceea ce face
posibila separarea unor compusi imposibil de separat prin alte tehnici.

Această tehnică este cel mai mult aplicată dintre tehnicile cromatografice fiind folosită în
analiza chimică, biomedicală, farmaceutică , analiza alimentelor etc. HPLC este utilizată pentru
separarea şi detecţia unor compuşi biologic activi (hormoni, vitamine, proteine , lipide) , instabili
termic

Solventi

Pompe

Injector

Coloana

Detector

Calculator
pentru înregistrarea și prelucrarea semnalului

Figura 1. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

Parţile componente ale unui cromatograf de înaltă performanţă sunt următoarele:
–rezervoare pentru lichide ( eluenţi);
-pompe pentru lichide (una sau două);
-sistem de introducere a probei (seringă de injecţie);
-coloana de separare;
-detector ;
- înregistrator.

Pompele preiau eluentul din rezervorul de solvenţi. Cu ajutorul sistemului de introducere

a probei, acesta este introdusă în coloana cromatografică. La ieşirea din coloana, eluentul cu
componenţii separaţi din probă trece prin detectorul 5 .
În detector, sunt identificaţi componenţii probei datorită variaţiei unei proprietăţi , de
exemplu absorbţia în UV , în VIS sau fluorescenţa.
Înregistratorul trasează cromatograma , care este proprietatea dată de detector în funcţie
de timp. De exemplu , în cazul de detectorului UV se traseaza absorbanţa în UV funcţie de timp
sau semnalul electric dat de detector ( de exemplu tensiunea, masurată în milivolti sau
microvolti). Înregistratorul a fost înlocuit pentru aparatele HPLC moderne de calculatoare care
preiau semnalul și îl prelucrează folosind diferite programe si soft-uri de prelucrare a datelor.

Figura 2. Schema unui HPLC

Pompa pentru HPLC

Pompa este considerata una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece
permite realizarea unui debit constant al eluentului prin întregul sistem al cromatografului
de lichide: injector, coloană, detector. Pompa permite creșterea apreciabilă a vitezei de
separare prin întregul aparat HPLC: injector, coloană, detectror . Cromatograful de lichide este
dotat cu una sau mai multe pompe. Fiecare din acestea furnizeaza o presiune de până la circa
20000 kPa(aproximativ 200 atm; 1Pa=1N/m2; 1atm =101,325 kPa ). Această presiune ridicată
este necesară pentru a învinge rezistența la curgere opusă de umplutura cu finețe mare. În absența
presiunii aplicate , debitul efluentului ar fi foarte mic, iar separarea cormatografică ar dura prea
mult.
Pompele cu care sunt dotate cromatografele de lichide HPLC sunt de două tipuri:
 pompe cu presiune constantă ( având debitul variabil);
 pompe cu debit constant.
Pompele cu presiune constantă sunt simple , relativ ieftine și nu prezintă pulsații în
funcționare. Pulsațiile sunt nedorite deoarece împiedică obținerea unei linii de bază netede a
cromatogramelor.
Dar, pompele cu presiune constantă au ca dezavantaj faptul că debitul trebuie modificat
frecvent pentru a se menține cât mai constant. În cazul separărilor de lungă durată apar
probleme deoarece în cursul funcționării cromatografului, are loc obturarea coloanelor ceea ce
duce la scăderea debitului. Orice modificare de debit, datorită vâscozității sau temperaturii
eluentului și a structurii umpluturii afectează timpul de retenție, și totodată semnalul detectorilor,
care sunt în majoritate sensibili la concentrație.
Pompele cu debit constant se fabrică în următoarele variante constructive:
 pompe cu piston;

 pompe de tip seringă (cu deplasare pozitivă).

Pompele cu piston, numite și pompe alternative sunt cele mai utilizate. Mișcarea
oscilatorie ( du-te-vino) a pistoanelor și a supapelor permit o funcționare continuă, dar necesită
dotarea cu dispozitive cu rol de atenuare a pulsațiilor care să elimine variațiile de debit de mică
amploare numite acumulatoare hidraulice. Cu ajutorul acestor dispozitive se menține un debit și
o presiune constantă fiind alcătuite din mai multe rezistențe hidraulice, de exemplu tuburi subțiri
sau incinte cu pereți elastici.
Pompele utilizate în HPLC funcționează într-un mediu coroziv (vehiculează solvenți) la
presiuni ridicate. De aceea solvenții sunt degazați , iar pompele sunt construite din materiale
rezistente la coroziune (teflon sau aliaje speciale).

Sisteme de introducere a probei

În cromatografia de lichide de înaltă performanță injecția probei trebuie facută foarte rapid,
pentru a nu perturba regimul dinamic al eluentului prin coloană și detector având în vedere
presiunea ridicată la care se lucrează.
Cel mai utilizat sistem de introducere a probei este ventilul cu 6 căi, numit și ventil și de
introducere a probei, prevazut cu bucle interschimbabile (fig. 3).
 Etapa 2 Etapa 1

Figura 3.
Ventilul pentru introducerea probei (cu 6 căi) lucrează în două etape: 1 (dreapta) — alimentarea
buclei cu proba; 2 (stânga imaginii)— după o rotire cu 60 ° în sensul acelor de ceasornic, are loc
antrenarea probei din buclă în coloană.

Ventilul cu 6 căi funcționează în 2 etape:

-etapa 1: introducerea probei în ventil ( mai precis într-o buclă a ventilului);
-etape 2: comutarea ventilului pe analiză când are loc rotirea cu 60 ° și antrenarea probei din
buclă în coloană.
Eluentul aderă la pereți și de aceea , pentru completa îndepărtare a sa în momentul
alimentării buclei cu probă , este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel puțin 3 ori
volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză.
Volumul probelor pentru colonele obișnuite cu dimensiuni de 25 cm x4,6 mm ( lungime
x diametrul coloanei) este de 10-50 µL ( microlitri).
Pentru fabricarea ventilelor se utilizează materiale rezistente la coroziune și la solvenți
(oțel inoxidabil, tantal, teflon etc.).

Alta schema a sistemului de introducere a probei în coloana este prezentată în Fig. 4.

 Figura 4.
Cele 2 etape prin care proba injectată este incorporată în buclă: a) Incărcarea buclei;b) injecția în
coloană Model schematic al valvei Rheodine . Majoritatea sistemelor de injectare a probei în
coloana sunt în prezent automatizate

Colonele cromatografice în cromatografia de lichide

Coloana cromatografică este spațiul în care are loc separarea componenților probei fiind
considerată cea mai importantă componentă a cromatografului de lichide. În funcție de calitatea
coloanei și a umpluturii se mărește sau se micșorează raportul semnal /zgomot.
Coloana cromatografică este formată din:
 corpul coloanei;
 umplutura coloanei.
Corpul coloanei este alcătuit dintr-un material care asigură rezistența mecanică necesară a
putea funcționa la presiunile ridicate la care se operează în HPLC (20 000 kPa) și rezistența la
coroziune având în vedere că faza mobilă este constituită din diferiți solvenți sau amestecuri ale
acestora.
Materialele utilizate pentru confecționarea colonelor în HPLC sunt următoarele:
-oțel inoxidabil lucios;
-materiale compozite formate din sticlă sau material plastic în interior și oțel inoxidabil sau
material plastic în exterior.

Figura 5.
Coloane HPLC de diferite dimensiuni

(http://www.directindustry.it/prod/agilent-technologies-life-sciences-and-chemical/colonne-hplc-
32598-250400.html; http://www.chimicare.org/blog/metodi-e-approcci/che-cose-la-
cromatografia/)
 Figura 6.
Umplutura unei coloane cromatografice (SiO2 avand grefate catene hidrocarbonate liniare cu
grupari fenil)

Coloanele în cromatografia de lichide sunt de formă cilindrică. Dimensiunile lor depind

de dimensiunea granulelor și de porozitatea umpluturii. Diametrul coloanelor variază între 0,3-5
cm, iar lungimea este situată în domeniul 3-25 cm.
Pentru scopuri preparative, se utilizează diametre mai mari de 5 cm.
Cu cât umplutura este mai fină, cu atât se recomandă a se lucra cu o coloană mai scurtă.
Pentru a se reține eventualele impurități sau componenți care nu pot părăsi coloana deoarece sunt
reținuți ireversibil, se pot utiliza așa numitele “precoloane” care au același diametru ca și
coloanele, dar lungimi mai mici situate între 0, 4 și 1 cm. Precoloanele se pot înlocui mai des,
evitând astfel scoaterea din funcție a coloanei principale.
Coloana cromatografică este prevăzută la cele două capete cu două discuri metalice
poroase care au rolul de a reține fază staționară care ar putea fi antrenată de faza mobilă în zona
poroasă cu porii având diametrul de 0,5-10 µm.
De asemenea, pentru a nu se lărgi prea mult prin coloană zona cromatografică (datorită
diluării care are loc simultan), tot volumul mort al coloanei ( goluri în coloană, tuburi de
aducțiune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie redus la minimum.

Mecanisme de separare în cromatografia de lichide

Se cunosc mai multe mecanisme de separare care depind de faza mobilă și staționară din
coloana și de natura fenomenului fizico-chimic prin care are loc separarea cromatografică:
Pe baza mecanismului de separare, metodele cromatografice din cromatografia de lichide
se clasifică în:
-cromatografia de adsorbție;
-cromatografia de repartiție;
- cromatografia ionică;
-cromatografia de excluxiune sterică.
 În funcție de compușii care urmează să fie separați prin CL, tipul de mecanism se alege
cu ajutorul schemei din figura 7.
Cromatografia de repartiție se poate realiza în două variante de lucru:
a) cromatografia de repartiție directă ( sau cu faze normale, clasică);
b) cromatografia de repratiție cu faze inversate.
În cazul cromatografiei de repartiție directă, faza staționară este formată dintr-un lichid
polar, iar faza mobilă dintr-un solvent organic nepolar.
În cazul cromatografiei de repartiție cu fază inversată, situația se inversează: lichidul
impobil este nepolar, iar faza mobilă este un amestec de solvenți polari.
 Cromatografie
Substanță ionică (CI)

Solubilă în apă ionică

Cromatografie cu
perechi de ioni
Substanță
covalentă
M< 2000
Substanță Cromatografie
polară - cu faza inversa;
Solubilă - cu faza polară
în solvenți legată;
organici - lichid solid (CLS);
- de excluziune
sterică
Proba
CLS
Substanță
CI
nepolară
Cromatografie de
excluziune sterică

Solubilă în apă Cromatografie de

excluziune sterică
M> 2000
Schimb ionic
Solubilă în solvenți
organici
Interacțiuni
hidrofobe

Figura 7. Mecanisme de separare cunoscute pentru CL

Faza staționară în HPLC

Silicagelul, SiO2, este cel mai mult utlizat material pentru faza staționară. Silicagelul s-a
obținut sub formă granulară neregulată, iar apoi prin perfecționarea procedeelor de obținere, în
formă sferică.
Obținerea silicagelului sferic se face plecând de la soluții care conțin silicat de sodiu pur
sau alți compuși ai siliciului care dau reacții de hidroliză: tetraclorura de siliciu, silicat de etil
etc. Compușii siliciului anterior menționați sunt supuși reacției cu apa, urmată de pulverizare și
apoi de sinterizare (aglomerare a pulberilor) , iar in final se obțin granule cu aspect sferic (figura
8). Operațiile prin care se obține silicagelul sunt prezentate in figura 9. Granulatia silicagelului
treuie sa fie uniforma. Parte fina se elimina din produs. In acest fel curgerea eluentului este mult
imbunatatita.
Figura 8. Aspectul granulelor de silicagel sferic care se utilizează frecvent la umplerea
coloanelor in HPLC

Figura 9. Schema operatiilor prin care se obtine silicagelul pentru HPLC

Obținerea silicagelului sferic se face pornind de la soluții ale silicatului de sodiu, dar și de la alți
compuși hidrolizabili al siliciului ( tetraclorura de siliciu, silicat de etil etc.) . Prin reacția acestor
compuși se obtine acidul silicic si apoi dioxidul de siliciu ( silicagel) parțial polimerizat. Soluția
de silicagel rezultată este pulverizată pentru a rezulta granule de silicagel care sunt supuse
procesului de sinterizare. (figura 9). În acst fel se obțin granule cu aspect sferic.
Substanțele folosite la prepararea silicagelului trebuie sa aibă o puritate avansată pentru o bună
funcționare a colanelor cromatografice. Prezența unor ioni metalic ( ca impurități) modifică
structura silicagelului și determină apariția unor centre de adsorbție puternice , iar
cromatogramele rezultate vor prezenta “cozi” ale picurilor.

Silicagelul are o stuctură tridimensională cu o rețea de bază tridimensională, formată din legături
Si-O-Si. Pe suprafața porilor și pe cea exterioară prezintă grupe silanol, ≡Si-OH. Punțile de
oxigen (legăturile Si-O-Si) apar între atomii de siliciu, în cursul polimerizării acidului silicic,
Si(OH)4 sau H4SiO4
Silicagelul este considerat un adsorbant puternic polar. Alti adsorbenti sunt: alumina, oxidul de
zirconiu, carbunele macroporos, polimerii porosi, cum este spuma poliuretanică.
 Figura. 10. Aspectul schematic al unei granule sferice cu fază stationara chimic legata de
suprafata suportului

Faze staţionare normale şi inverse în HPLC prin adsorbtie si repartitie

În funcţie de umplutura coloanelor se disting doua variante de lucru pentru
separarea prin HPLC:

Cu fază normală (HPLC-FN);

Cu faza inversă (HPLC-FI) , în engleză reverse phase.

Pentru umplutura coloanelor cu fază normală se folosesc următoarele

substanţe:
 Silicagel;
 Alumină,
 Celuloză;
 Ca(OH)2;
 MgCO3

Pentru umplutura coloanelor cu fază inversă se folosesc următoarele

substanţe cu proprietăţi de adsorbţie:

Cărbune activ;
Silicagel modificat chimic prin legarea de grupe octadecil, sau de octil rezultând
astfel octadecilsilan C18 sau octasilan C8.

Mecanismul pe baza căruia are loc separarea în cele două cazuri este diferit.
În cazul sistemelor HPLC –FN , separarea are loc datorită proceselor de adsorbţie,
iar în sistemele HPLC-FI , procesul de separare se bazează pe repartiţia
componentelor între faza staţionară nepolară şi eluentul poar.

Faze mobile în HPLC

Tipul fazei mobile (a eluentului) depinde de natura fazei staţionare. Astfel în

sistemele HPLC-FN , unde faza staţionară este polară, se folosesc eluenţi nepolari
(eter de petrol, hexan pur sau în amestec cu acetona 1-15%), iar când faza
staţionară este nepolară (HPLC-FI) se folosesc amestecuri de solvenţi nepolari cum
sunt acetonitril, metanol, acetat de etil, etc.
În funcţie de tipul probei de analizat se va alege unul din aceste două sisteme:

 Daca probă este preponderent nepolară se recomandă utilizarea sistemului

HPLC –FN unde coloana conţine fază staţionară polară cu afinitate diferită

Detectia
Detectia in HPLC se realizeaza prin mai multe metode:

Detectia refractometrica:
Detectia bazata pe difuzia luminii;
Detectia conductometrica;
Detectia spectrofotometrica;
Detectia fluorimetrica.
Detectia electrochimica (amperometrica)
Detectia bazata pe spectrometria de masa.
In unele cazuri se adauga reactivi care permit detectia cu ajutorul unui anumit
instrument , de exemplu cu spectrofotometru sau fluorimetru. Acest procedeu se
numeste derivatizare.

Detectorul spectrofotometric în UV-VIS

Acest detector (Fig.11. este cel mai utilizat în HPLC. Pentru a putea fi utilizat
acest tip de detector, compuşii separaţi cromatografic trebuie să fie coloraţi, adică
să absoarbă lumina pe domeniul lungimii de undă al detectorului, iar eluentul
trebuie să fie practic transparent pentru acelaşi domeniu spectral.
Un mare avantaj al detectorului este insensibilitatea la micile variaţii de debit şi
temperatură. Celula de detecţie face parte dintr-un spectrofotometru şi are un
volum extrem de mic (8-10μl), un diametru interior de 1mm la o lungime a celulei
de 10 mm.

Fig. 11. Detectorul spectrofotometric

Detectorul conductometric
Se utilizează cu precădere în cromatografia cu schimbători de ioni. Acești detectori
sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici.
Sunt detectori specifici.
Sunt suficient de sensibili (500pg-1ng).
Principiul de funcţionare este prezentat schematic în fig.12. Tehnic, este vorba de o
celulă miniaturizată asemănătoare cu o celulă conductometrică.

In absența compușilor eluați din coloana cromatografică, conductivitatea electrică

are o valoare scăzută. Când compușii reținuți pe coloana cromatografică sunt eluați
și ajung in celula de conductivitate , crește conductivitatea, proportional cu
concentrația compușilor separați.

Fig. 12. Detector conductometric

Detectorul refractometric, se bazează pe legile refracţiei luminii, de transmitere a
luminii prin medii transparente. Un fascicul luminos trece printr-o celulă cu două
compartimente unul conţinând doar eluentul pur iar celălalt faza mobilă care
părăseşte coloana (Fig. 13). Diferenţa dintre indicii de refracţie pentru soluţiile
aflate în cele două compartimente vor fi practic nule, atâta timp cât din coloană
iese doar eluentul pur, dar diferită de zero atunci când în eluent mai apare un
component separat în coloană și antrenat de către eluent.

Detectoarele refractometrice sunt universale, semnalând prezenţa oricărei

specii chimice. Aceste detectoare nu se utilizează când se aplică eluţia cu gradienți
(concentraţie, pH, temperatură, viteză de curgere, etc). În acest caz se folosesc
sisteme diferenţiale, comparându-se două curente de efluent, dintre care numai
unul în amestec cu componenţii separaţi. Detectorii refractometrici diferenţiali pot
fi cu deflexie când variaţia indicelui de refracţie al lichidului din celula
detectorului provoacă modificarea unghiului de refracţie, figura 14. Raza de
lumină care trece prin celulele de referinţă şi măsură va fi deplasată cu un unghi
proporţional cu diferenţa dintre indicii de refracţie ai celor două lichide.

Fig. 13. Schema de principiu a unui detector refractometric cu deflexie

Detectorul de florescență utilizat în HPLC (Fig 14) are un design similar cu

fluorimetrele sau spectrofotmetrele. Acest tip de detector utilizează sursa de xenon,
iar monocromatorul izolează radiațiile fluorescente, are sensibilitate bună, dar e
nevoie de derivatizare. Se utilizează la detecția componenților care prezintă
fluorescență sau au fost transformați prin derivatizare în compuși fluorescenți.

Fig 14. Schema unui detector de florescență

Detectorul amperometric (Fig 15) se utilizează pentru compușii oxidabili

sau reductibili.

Fig 15. Principiul de funcționare a detectorului amperometric

Detecția prin spectrometrie de masă

Detectorul utilizat pentru spectrometria de masă necesită coloane capilare,
pulverizare, fiind destul de scump.
Cromatograful de lichide cuplat cu spectrometrul de masă și spectrometrul cuplat
inductiv (HPLC-ICP-SM), este prezenatat în figura 16. Aparatul prezintă mai
multe avantaje, atât faza staționară cât și faza mobilă pot fi modificate pentru a
obține separarea mai bună, separările pot fi îmbunătățite suplimentar prin
adăugarea de aditivi (aditivi chirali, surfactanți) în faza mobilă, separările pot fi
îmbunătățite prin schimbarea fazei mobile în timpul analizei.
 Fig 16. Schema unei instalații HPLC-ICP-SM

Aplicații ale HPLC la analiza alimentelor

Extinerea posibilităților de analiză prin HPLC este datorată fazelor legate de
particulele de adsorbant (silicagelul silanizat). Analiza mono și oligozaharidelor se
realizează prin cromatografie cu schimbători de ioni (cu faza normală sau inversă)
și detecție prin metode electrochimice (variația de conductivitate), detecție
refractometrică sau analiza postcoloană, analiza vitaminei E (cu faza normală sau
inversă). Detecția se realizează electrochimic, cu fluoresență sau UV.
Analiza amino-acizilor se face prin cromatografia de schimb ionic, în fază
inversă. Pentru detecție se face o derivativare înainte sau după coloana de separare
(pre sau post derivatizare cu reactivi specifici care se atașează de grupele amino
formând compuși fluorescenți).
Determinarea compoziției în aminoacizi și a proporţiei aminoacizilor
esenţiali din proteine (după hidroliză) este importantă pentru evaluarea calităţilor
nutriţionale ale proteinelor din diverse alimente. Prin HPLC se poate determina
compoziția lipidelor, respectiv natura și concentrația acizilor grași saturați și
nesaturați din uleiuri și grăsimi de origine animală. De asemenea prin HPLC se pot
determina componenţii minori şi metaboliţii din alimente: coloranţii din sucurile de
fructe sau vin, diacetilul din unt, flavonoidele din sucurile de fructe, antioxidanţii
din vegetale etc.
 Fig 17.Cromatograma morcovilor proaspeți (a) și
conservați (b) obținută prin HPLC

Pesticidele din alimente sunt analizate pe fază normală sau inversată, și detectate
prin UV, fluorescență sau spectrometrie de masă. În cazul micotoxinelor, separarea
se realizează prin cromatografică de afinitate. În acest caz, procesul de separare se
bazează pe interacțiunea specifică și reversibilă dintre moleculele alfate în faza
mobilă (micotoxine) și un ligand imobilizat pe suprafața fazei staționare.
Se observă modificarea compoziției prin conservare din analiza
cromatografică aplicată la extractele de morcovi proaspeți și conservați. Astfel
cromatograma obținută (fig 17) prin HPLC cu fază inversă la analiza izomerilor de
structură ai carotenilor din morcovii proaspeți și cei conservați indică modificarea
compoziției de caroteni prin conservare; picul 7 corespunde la α caroten, iar picul 9
la β caroten, în timp ce picurile 1-6, 8 și 10 sunt date de alți izomeri de structură ai
carotenilor.
Curcumina, este un colorant alimentar și antioxidant natural, de culoare
galbenă, iar puritatea și concentrația de component activ și de compuși înrudiți se
poate analiza prin HPLC pe o coloana cu silicagel modificat C18, cu detecție în
vizibil (la λ=420 nm), eluție izocratică cu amestec 4:6 tetrahidrofuran: soluție
apoasă de acid citric 1 g/L. Cromatograma este prezentată în figura 18 .
 Fig. 18. Cromatograma unui extract alcoolic de curcumină

Avantajele metodelor HPLC sunt date de rapiditatea analizelor, faptul că

sunt disponibile comercial faze staționare cu diferite caracteristici care permit
separări complexe, rezoluția foarte bună, sensibilitate ridicată. Proba se poate
recupera, este nevoie de un volum mic de eluent.