Introducere

HPLC
1. High pressure liquid cromatpgraph
1. High performance liquid chromatograph

Introducere

Avantajele utilizarii HPLC

1. timpul mai scurt de analiza
2. rezolutie
3. reproductibilitate
4. precizie
5. automatizare

Introducere

Dezavantajele folosirii HPLC

1. pretul mult mai mare
2. complexitate
3. coelutie

Introducere

Separare pe o coloana cromatografica

Notiuni de baza in cromatografia de

lichide

Volum mort
Volumul de faza mobila necesar pentru
umplerea coloanei cromatografice

Volumul mort

VM 0.5Ld

2
c

VM = volum mort
L = lungime coloana (cm)
dc = diametru coloana (cm)

Volumul mort

In cazul unei coloane de 250mmx4,6mm,

volumul mort va fi 2,645 mL
Importanta: spalarea coloanelor, echilibrarea
coloanelor in cazul lucrului in gradient

Timpul mort

VM
to
F

t0 = timp mort
VM= volum mort
F = debit

Timpul mort

In cazul unei coloane cromatografice de

250mmx4,6mm, daca debitul este de 1
mL/min, timpul mort va fi de 2,645 min
Semnificatie: orice compus care elueaza intrun timp mai scurt de 2,645 min nu este
retinut de coloana

A
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

to

VM

Timp/Volum

VR

VR

Volum de retentie/timp de retentie

Volum de retentie/Timp de retentie

Volumul de faza mobila care a trecut prin
coloana de la momentul injectarii pana la cel
al detectiei peak-ului (aparitia apexului)
Volumul de retentie este asociat cu timpul de
retentie
VR = F tR

Rezolutie

Scopul cromatografiei separarea a cat mai multi

compusi dintr-un amestec

2(t2 t1 )
RS
w 2 w1

Rezolutie

Rezolutie

Retentie
VR VM t R t o
k

VM
to

K = factorul de retentie
VM = volumul mort
VR = volumul de retentie
t0 = timpul mort
tR = timpul de retentie

Selectivitate

Capacitatea fazei stationare de a face

diferenta dintre componentele amestecului

k2

k1

K1 = factorul de retentie al celui mai slab

retinut compus
K2 = factorul de retentie al celui mai bine
retinut compus

Eficienta
tR
tR

N = 16 5.54
w
w 0.5
2

tR = timp de retentie
W = laltimea peak-ului la nivelul liniei de baza
W0.5 = latimea peak-ului la jumatate din inaltime
Este definita ca numar de platouri teoretice

Partile componente ale HPLC

1.
2.
3.
4.
5.

POMPA
INJECTOR: AUTOMAT/MANUAL
CUPTOR COLOANE
DETECTOR
SOFTWARE

Partile componente ale HPLC

Amestec la presiune joasa

Amestec la presiune inalta

Conexiuni HPLC

Tubulatura, imbinarile dusmanul ascuns

Necesar pentru conectarea moduleleor HPLC: pompa, injector coloana detector.
Separarea cromatografica are loc stric la nivelul coloanei.
Zone putin critice: pompa injector.
Zone critice: injector-coloana.
Zona supra-critica: coloana detector.
Volumul tubulaturii dintre coloana-detector (ECDV) conduce la scaderea
dramatica a eficientei unei coloane
Tubulatura ascunsa: Volumul mort al coloanei (CDV), acesta creste pe masura ce
colana imbatraneste.
CDV se poate compensa prin sistemul de compresie adaptiva DYNAMAX.

Imbinari

Functia de baza: canal pentru faza

mobila.
Imbinarile critice sunt in zonele: injector,
coloana, detector.
O imbinare corecta este reprezentata in
diagrama A. Aici etansarea se face in
doua etaje, un etaj intre patul plat al
etansarii (stop) si tubul metalic si adoua
intre garnitura conica (ferrula) si patul
conic (seal). Aceasta etansare nu
conduce la un volum mort suplimentar.
Din cauza dispersiei parametrilor
tehnologici ai prelucrarilor mecanice dupa
deformarea plastica a ferulei aceastei
piese nu I se va schimba destinatia.
Cazul B implica o disfunctionalitate
Cazul C induce un volum mort de 101000 ori volumul fizic al spatiului
observabil

Pompe HPLC

Functia de baza: coordonarea fluxului fazei mobile.

Aplicatiile cromatografice actuale necesita debite in intervalul 0.01-10mL/min si
la presiuni de pana la 500atm.
Factorii de merit ai unei pompe:

Acuratetea si reproductibilitatea debitului;

Acuratetea si reproductibilitatea gradientului;

Timpul de schimbare efectiva al gradientului;

Lipsa pulsatiilor;

Compensarea dinamica a compresibilitatii solventilor;

Conservarea starii de agregare a solventilor si a impuritatilor dizolvate in

acestea;

Admisia probei in sistemul LC

Utilizarea Autosamplerelor

Automatizarea admisiei de probe

Moduri diferite de injectie (partial loop
fiil)
Conditionarea probei.
Adaugarea de reactivi.
Stabilizarea factorilor de mediu.
Stabilizarea coloanei.

Secventa de injectie cu
autosampler

Secventa de injectie cu
autosampler

Detectori folositi in HPLC

Detector UV-VIS/Diode array

Detector fluorescenta
Detector RI
Detector de conductivitate
Detector electrochimic
Detector LSD/ELSD
Spectrometru de masa

Moduri de separare HPLC

Separare
Separare
Separare
Separare

in faza normala
in faza inversata
prin schimb de ioni
dimensionala

Separarea in faza normala

Este caracterizata de folosirea de faze stationare polare si de faza mobila

slab polara sau nepolara
Faza stationara este uzual silicagelul. Gruparile polare sunt silanol, sau alte
grupari functionale CN, -NH2
Moleculele polare sunt retinute mai mult sau mai putin in functie de taria
interactiunii lor cu gruparile polare din faza stationara.
Uzual compusii nepolari elueaza primii urmati de cei polari in ordinea
polaritatii acestora.

Separarea in faza inversata

Este caracterizata de folosirea de

faze stationare nepolare si faza
mobila polara.
Cea mai des intalnita tehnica HPLC.
Majoritatea aplicatiilorutilizeza faza
stationara tip C18 cu grupari
octadecyl (C18H37) legate la
suprafata. Exista si variante cu octyl
sau phenyl.
Substantele ionice se pot separa cu
aceasta metoda prin adaugarea de
substante organice cu ioni de
polaritate opusa cu analitul (ion
pairing).

Nota: aceste substante trebuie sa fie

volatile, ex: TFA, HFBA, TEA

Separarea prin schimb de ioni

Se utilizeza pentru separarea substantelor ionice

Faza stationara a coloanelor destinate acestei tehnici se obtine prin legarea de
suportul mecanic (silcagel sau polimer poros) a unor centri ionici activi.
Centrii ionici cu exces de sarcina negativa cation exchange
Centrii ionici cu exces de sarcina pozitiva anion exchange

Separarea dimensionala

Difera de celelalte tehnici de separare prin lipsa interactiilor de natura fizico-chimica.

Interactiunile utilizate sunt de natura mecanica.
Separarea se bazeaza pe porozitatea fazei stationare.
Moleculele mari care nu pot patrunde in pori sunt antrenate de faza mobila foarte usor
si elueaza primele.
Moleculele mici patrund in porozitati, si sunt antrenate lent de faza mobila.
Ordinea de elutie este de la molecule mari la mici
Faza mobila are o importanta secundara si se alege nu din punct de vedere al timpilor
de retentie ci din punct de vedere al caracteristicilor de solubilitate sau alte propietati
fizica chimice.

Aplicatii

Des utilizata in procesul

de pregatire al probei
(extractie, curatare)
In exemplul alaturat
acest tip de separare a
fost utilizat pentru
extractia sarurilor dintro proba ce urmeaza a
stabili continutul de
proteine si peptide.

Gradientul fazei mobile

Functie: Asigurarea unor conditii

bune de separare pentru toti
compusii, mentinand timpul de lucru
la valori uzuale. Focalizarea benzilor
de injectie.
In exemplul din figura:

FM tip A: ST 1,2 nu sunt

rezolvate

FM tip B: ST 1,2 sunt rezolvate,

ST3 are un timp de elutie foarte
mare

FM trece de la A la B (gradient).
Toate ST sunt rezolvate

Coloana comatografica

Realizeza secventa principala de separare.

Clasificare:

Preparative

Garda (precoloane)

Analitice

Clasice

Cu diametru redus (micro bore, capillary)

Dupa dimensiunile fizice

Dupa tipul umpluturii

Debitul optim este functie de diametrul coloanei (proportional cu D2 )
Deoarece solventul se elimina inainte de analiza in spectrometrul de masa coloanele de
diametru mic sunt preferate in fata celor clasice.
Deaorece imbinarile nu se pot scala in aceeasi proportie cu debitul eluentului coloanele cu
diametru redus sunt puternic afectate de ECDV
Ingustarea picurilor cromatografice cu diametrul coloanei conduce la probleme in alegerea
parametrilor spectrali si la folosirea unui detector secundar.