4.

METODE DE PRECONCENTRARE ȘI EXTRACȚIE ÎN ANALIZA ȘI CONTROLUL

MEDICAMENTELOR

4.1. SEPARAREA SUBSTANȚELOR PRIN SCHIMBĂRI DE STARE

Sunt cunoscute cele 3 stări fundamentale de existență ale materiei: solidă, lichidă și
gazoasă la care se poate adauga și a patra: plasma (inclusive fluidele supercritice).
Schimbările de stare sub acțiunea P si T servesc la separarea componenților din amestecuri
multiple care constitue o etapa foarte importantă de pregatire și pretratare a probelor date spre
analiză.

a) Diagrama de schimbare a fazelor

P 4
Pc C
2
1 B
PT T

A
3
TT T
T
C

Fiecare substanța are o diagramă proprie de stare, care este imparțita în 3 zone, prin trei
curbe ce se reunesc în punctul triplu. Cele trei curbe permit distrugerea echilibrelor de stare: S- L;
G- S; L- G. Curba de stare G- L este marginită și de punctul critic, coordonatele sale fiind Tc si
Pc. Pentru temperaturi și presiuni mai mari decât valorile critice între faza lichida și faza gazoasă
nu există nici o separare, iar mediul omogen care se formează are caracteristici ale unui fluid ca
și lichidele sau gazele, numindu-se fluid supercritic.Trebuie precizat că nu este posibila
coexistența simultană a celor trei stări de agregare decât la temperatura și presiunea punctului
triplu. În interiorul fiecărei zone, o substanța nu poate exista decât într-o singură stare de
agregare.
Spre exemplu, dacă o substanța B este în stare lichidă, ea poate trece și în fază gazoasă prin
micșorarea P și creșterea T, ceea ce permite separarea și purificarea sa prin distilare.

b) Sublimarea

Sublimarea este posibila atunci când se micșoreaza și mai mult P si creste T. Însă unii
compuși, în special organici, pot sublima la presiune normal: acidul benzoic, HgCl2 (anorg.) ceea
ce se poate realiza prin încălzirea substanței solide și culegerea vaporilor rezultați. Cel mai
adesea se utilizeaza totuși sublimarea la presiune redusă.
1
 c) Liofilizarea

Are mai multe aplicații în domeniul farmaceutic decât sublimarea, mai ales în cazul
analiților care se degradeaza la încălzire. Liofilizarea este un procedeu de ‘’uscare la rece’’ și
constă în înghețarea rapidă a probei după care se elimină solventul prin sublimare în vid înaintat,
când este transformat direct in vapori, eliminându-se complet. Liofilizarea este utilizată în special
pentru: păstrarea timp îndelungat a culturilor microbiene, a enzimelor a unor medicamente,
țesuturi sau probe biologice (ser, urină, etc); în toate aceste cazuri este asigurată integritatea
probelor.

d) Distilarea

Este o metodă de separare a componenților dintr-o probă pe baza diferenței dintre

volatilitățile lor, cee a ce permite transformarea succesivă a analiților în stare de vapori și
conducerea lor, putându-se colecta separat fiecare fracțiune de substanță. Distilarea simplă
conduce numai la o concentrare a unui distilat, nefiind posibilă izolarea substanței în stare pură.
Aceasta este însa posibilă prin distilarea fracționată (rectificare) și constă într-o succesiune de
evaporări și condensări: la început lichidul condensate este readus în întregime în balonul de
distilare (refluxare totală) având loc o circulație de lichid refluxat în contracurent cu vaporii ce se
ridică din balon permițând stabilirea unor echilibre de destilare. Atunci când coloana capătă un
regim stabil de funcționare se produce condensarea unei părți a vaporilor în capătul coloanei
caracteristici produsului cel mai volatile, menținându-se un reflux partial. Coloanele de distilare
fracționată (col. Vigreaux) au ,,platouri teoretice”. Înalțimea unui astfel de platou se calculează
cu relația h = L/N și caracterizează performanța coloanei. Astfel pentru o rectificare cât mai buna
h trebuie să fie cât mai mic, deci trebuie folosite coloane cu un numar mare de platouri teoretice.

4.2. CONCENTRAREA PRIN EXTRACȚIE

Multe probe de interes farmaceutic au o compoziție foarte complexă, iar acestea nu

pot fi analizate direct prin metode cromatografice sau spectroscopice. Prepararea probei este
necesară pentru a reduce complexitatea eșantionului și pentru a o face compatibilă cu metoda de
analiză.
Multe probe sunt amestecuri complexe de ingrediente diferite. În analiza farmaceutică
probele sunt în mod normal produse farmaceutice finite sau fluide biologice, cum ar fi sângele și
urina. În produsele farmaceutice finite substanţa activă farmaceutică este în mod normal
amestecată cu diferiți excipienți, iar acest lucru complică identificarea și analiza cantitativă a
acesteia. Sângele și urina sunt de asemenea, amestecuri complexe compuse din sute sau mii de
componente, iar substanța medicamentoasă de interes (analit) este prezentă într-o concentrație
foarte mică, cuprinsă între nivelul de µg/ml şi unul mai scăzut de pg/ml.
Analiza de medicamente în amestecuri complexe este o problema dificla din mai
multe motive:
- amestecurile complexe pot conține una sau mai multe substanțe care furnizează un
răspuns fals (interferă) în timpul măsurării analitice.

2
 - amestecurile complexe pot conține substanțe care pot polua sau chiar distruge
instrumentul de analiză.
- concentrația analitului poate fi atât de mică încât să nu poată fi detectată de către
instrumentul analitic.
- amestecurile complexe ale probei pot fi incompatibile cu instrumentul analitic.
Primele două probleme sunt tipice pentru controlul calităţii produselor farmaceutice
finite. Multi excipienti răspund măsuratorilor analitice iar răspunsul şi semnalul analitic nu pot fi
separate de răspunsul dat de substanţa activă. Astfel, excipienții care interferă au o contribuție
fals pozitivă masuratorii analitice iar acest lucru duce la erori grave, atât pentru identificarea cât și
pentru analiza cantitativă a produselor finite farmaceutice. Multe produse farmaceutice finite nu
sunt compatibile cu instrumentele analitice deoarece sunt solide sau semisolide. Un exemplu de
acest fel sunt tabletele, acestea trebuie să fie dizolvate pentru a fi compatibile cu majoritatea
instrumentelor analitice.
Toate motivele prezentate mai sus sunt tipice pentru analiza substanțelor
medicamentoase din probele biologice. Probele biologice au o compoziție complexa, și există
întotdeauna riscul ca o parte din componentele matricei sa dea un raspuns (interferență), care nu
poate fi separată de analit. În plus câteva substanţe din probele biologice pot deteriora
instrumentul de analiză, un astfel de exemplu este prezența proteinelor în probele de sânge care
pot înfunda coloanele cromatografice.
Concentratia multor medicamente este adesea prea mică pentru detectarea directă,
deoarece acestea sunt prezente sub limitele de cuantificare sau de detecție. Soluția pentru toate
aceste probleme dificile este pregatirea probei pentru analiză ţinând seama de proprietățile
analitului, de compoziția probei, și de concentrația analitului din probă, având ca principal scop
precipitarea proteinelor şi izolarea compuşilor de interes prin extracție lichid-lichid, extracție solid-
lichid sau extracția pe fază solidă.

4.2.1. Precipitarea proteinelor

Precipitarea proteinelor (PP) este o metoda folosită frecvent pentru prepararea probei,
înainte de analizele HPLC, GC și LC-MS a fluidelor biologice, fiind un procedeu foarte simplu. PP
este utilizată atunci când probele conțin cantități mari de proteine, aşa cum sunt probele de
plasmă și ser, probe ce conțin aproximativ 8% (w/w) proteine. Probele de urină nu conțin cantități
mari de proteine şi nu necesită o etapă de prelucrare prin precipitarea proteinelor.
Procedura clasică PP implică pipetarea unui anumit volum de plasmă sau ser, de
obicei cuprins între 0,1 și 1,0 ml care este amestecat cu un anumit volum de acetonitril.
Acetonitrilul este miscibil cu plasma sau serul, ceea ce face un sistem monofazic dar acționează
ca un precipitant, reducând solubilitatea proteinelor care vor precipita. Amestecul se agită
puternic pentru o perioadă scurtă de timp pentru a facilita precipitarea, apoi este centrifugat iar
supernatantul limpede este colectat pentru injecție directă în HPLC / LC-MS.
PP este doar o metoda de preparare a probei, nu şi o metodă de extracție deoarece
analiții nu se transferă într-o altă fază in timpul procedurii. PP poate fi realizată cu alți solvenți
organici cum ar fi acetona și metanol mai puțin eficienti decât acetonitrilul, așa cum este ilustrat în
tabelul 4.1.
3
Eficiența de îndepartare a proteinelor creşte cu volumul de precipitant; la 1,0 ml plasmă ca
exemplu, 0,2 ml acetonitril asigură o eficiență de îndepărtare de doar 13%, lucru care se
îmbunătățește la aproximativ 97% daca volumul de acetonitril este mărit la 1,0 ml. Dacă volumul
este crescut la 2,0 ml îndepărtarea proteinei este aproape completă (99,1%). Așa cum reiese din
tabelul 4.1, diferiți acizi, cum ar fi acidul tricloroacetic sau acidul percloric sau anumiţi ioni metalici
pot fi de asemenea folositi ca precipitanţi, lucru ce permite procedurii PP să fie optimizată cu
atenţie. Cu toate acestea, acetonitrilul este de departe precipitantul cel mai frecvent utilizat pentru
PP.

Tabelul 4.1 Diferite abordări ale proteinelor prin precipitare

Precipitant Volumul de precipitant adăugat per volum de plasma

0.2 1,0 2.0
Eficienţa precipitării proteinelor (%)
Acetonitril 13,4 97,2 99,7
Acetonă 1,5 96,2 99,4
Metanol 17,6 73,4 98,7
CCI3COOH (10%) 99,7 99,5 99,8
HCIO4 (6%) 35,4 99,1 99,1
CuSO4 - Na2WO4 36,5 97,5 99,9
ZnSO4 - NaOH 41,1 94,2 99,3

PP este utilizată pentru probe de plasmă și ser care conțin proteine, cu scopul
principal de a scapa de proteine înaintea analizei HPLC. Acest lucru este important, deoarece
proteinele pot înfunda coloana cromatografică. Proba de plasma sau proba de ser este
amestecată cu acetonitril care face ca proteinele să precipite. Proba este centrifugată și
supernatantul este colectat pentru analiza finală. Supernatantul conține mai mulţi analiţi de
interes, dar este aproape lipsit de proteine.
O a doua tehnică frecvent utilizata pentru prepararea probei este extracția lichid-lichid
(LLE). Această tehnică este utilizată pentru fluide biologice cum ar fi sângele şi urina dar si pentru
multe produse farmaceutice cum ar fi soluţii orale şi unguente.
Proba apoasă este amestecată cu un solvent organic insolubil în apă, rezultând un
sistem bifazic. Acest sistem cu două faze se agită puternic o anumită perioadă de timp, atunci
când analiții sunt transferati din proba apoasă în faza organică, obţinându-se un extract. După
agitare, amestecul este centrifugat, și cele două faze se separă din nou. Extractul (faza organică)
care conține analitul este apoi colectat pentru analiza finală.
În cazul probelor solide, prepararea probei poate fi realizată prin extracția solid-lichid
(SLE). Aceasta se face de obicei în analiza tabletelor sau capsulelor. Peste proba solidă de
analizat sub formă de pulbere se adaugă un solvent organic sau un solvent apos. Amestecul se

4
agită pentru o anumita perioada de timp, iar analitul este dizolvat în solvent. Solventul care
conține analitul (extractul) este colectat pentru analiza finală.
Ultima metoda de preparare a probei discutată în acest capitol este extractia pe fază
solidă (SPE). În SPE este utilizat un cartuş de extracţie umplut cu o fază stationară, care se
aseamănă cu fazele staționare folosite pentru HPLC. Proba, care în mod normal este un fluid
biologic cum ar fi sângele sau urina, este trecută prin cartuş în prima etapă, numită încărcare, iar
analiții de interes sunt reținuti în cartuş prin diferite tipuri de interacțiuni cu faza staționară. În
etapa a doua, numită spălare, cartuşul este spălat pentru a îndepărta pe cât posibil cât mai multe
componente ale matricei, dar fără eluţia analiților. În cele din urmă, în etapa a treia, numită eluţie,
analiții sunt scoşi din cartuşul de extracţie cu un solvent care rupe interacţiile analit-faza
staționară, eluatul (extract) colectat fiind analizat în final.

4.2.2. Recuperarea și îmbogățirea

Înainte de a trece la alte tehnici, trebuie definiti termenii de recuperare și de

îmbogățire, care sunt parametri importanți pentru a caracteriza performanța și succesul metodei
de preparare a probei.
Recuperarea (R) exprimată ca procent este definita prin următoarea ecuație:

n E final
R= 100 % (4.1)
n S initial

Unde nE,final este cantitatea de analit colectată din extract pentru analiza finală si n S,initial este
cantitatea de analit prezent în probă, înainte de prepararea probei. Recuperarea reprezintă
procentul de analit colectat în timpul preparării probei, iar atunci când R este 100% toată
cantitatea de analit este transferată din probă în extract. Atunci când R este 25%, înseamnă că
un sfert din moleculele de analit au fost transferate în extract. În mod normal, este de dorit ca
recuperările sa fie apropiate de 100% pe cât posibil. Pentru aplicații practice, poate fi utilizată
următoarea ecuație pentru a calcula recuperările:

C E final V E
R= 100 % (4.2)
C S initial V S

unde CE,final este concentrația de analit prezentă în final în extract, V E este volumul extractului,
CS,initial este concentrația de analit prezentă inițial în probă și VS este volumul eșantionului.
Recuperările sunt folosite pentru a caracteriza o metoda de preparare a probei. Pentru metodele
analitice cantitative, care implică mai multe analize măsurate simultan, metoda trebuie să
specifice recuperarea exactă pentru fiecare analiză, deoarece diferiţi analiţi pot fi extraşi cu
randamente diferite. Recuperările sunt măsurate în timpul dezvoltării şi validării metodelor. În
plus, în cazul în care recuperarea pentru o anumită substanță analizată este mai mică de 100%,
recuperarea ar trebui măsurată de fiecare dată când metoda este calibrată cu standarde pentru

5
analize cantitative. Acest lucru este important pentru a corecta rezultatele analitice având în
vedere că extracția nu este completă.

Exemplu 4.1: Determinarea recuperării de extracție

Un medicament nou este extras din plasmă prin ELL iar extractul este analizat prin
HPLC. Deoarece metoda este noua trebuie să fie stabilită recuperarea pentru procedura ELL
după cum urmează:
1 ml de plasmă este extras cu 4 ml solvent organic. După extracție și separarea celor
două faze, faza organică este îndepărtată și se evaporă la sec. Reziduul se dizolvă în 0,25 ml
fază mobilă și se injectează 50 µL în sistemul HPLC. Este înregistrata suprafaţa de pic pentru
medicamentul analizat.
Pentru a măsura recuperarea se prepară următoarele soluții:
Soluția 1: într-o probă de plasmă liberă (fără medicament) se introduce o cantitate de
medicament pentru a se obține o concentrație de 1,0 pg/ml.
Soluția 2: o cantitate de medicament dizolvat în fază mobilă pentru a obtine o concentrație a de
4,0 µg / ml.
Soluția 1 este extrasă conform procedurii, iar extractul este analizat prin HPLC oferind
o suprafaţă de pic de 11.263. Soluția 2 este analizată direct prin HPLC, oferind o suprafaţă de pic
de 12.467. Concentrația soluției 2 este 4.0 µg/ml, iar din aceasta poate fi stabilită corelația dintre
suprafața picului și concentrație (12.467 corespunde la 4,0 µg/ml în concentrație). În primul rând
se calculeaza concentrația medicamentului în soluția 1, care este egala cu CEfinal în ecuația (4.2):

11.263
C E final= 4,0 μg /ml=3,6 μg /ml (4.3)
12.467

Apoi, recuperarea se calculează pe baza ecuației (4.2):

C E final V E 3,61 μg/ml x 0,25 ml

R= 100 %= x 100 %=90 % (4.4)
C S initial V S 1,0 μg/ml x 1,00 ml

Îmbogatirea (E) este definită prin următoarea ecuație:

C E final VS∙R
E= = (4.5)
C S initial V E ∙ 100 %

6
Îmbogățirea arată de cate ori analitul a fost pre-concentrat în timpul preparării probei. Îmbogățirea
este importanta atunci când se analizează medicamente la niveluri de concentrație foarte scăzute
(pg/ml sau de nivel scăzut ng/ml, pentru a se asigura că extractul conține o concentrație care
depășește limita de cuantificare a metodei analitice. Îmbogățirea este mai relevanta pentru
analiza fluidelor biologice, și în anumite condiții, proba se poate imbogati de până la 10-20 de ori.
Îmbogățirea nu este necesară, în mod normal, pentru analiza produselor farmaceutice finite,
deoarece concentrațiile substanţelor active sunt relativ ridicate. Exemplul 4.2 ilustrează modul de
calcul al îmbogățirii.

Exemplu 4.2. : Determinarea îmbogățirii

În exemplul 4.1. recuperarea a fost calculată pentru o nouă metodă de extracție. Pe baza datelor
din acest experiment, îmbogățirea se calculează pe baza ecuației (4.5):

C E final 3,61 μg /ml

E= = =3,61 (4.6)
C S initial 1,00 μg/ml

Această valoare arată o concentrație de medicament în extractul final de 3,61 ori mai mare decât
în proba originală.

4.3. EXTRACŢIA LICHID-LICHID

4.3.1. Principiul extracţiei lichid-lichid

Extracția lichid-lichid (LLE) este o tehnică populară de preparare a probelor de fluide

biologice (sânge, urină) fiind utilizată pentru multe produse farmaceutice apoase (cum ar fi
soluțiile orale). Pentru LLE din fluidele biologice, volumul probei este limitat, iar procedura clasică
începe cu pipetarea unui volum mic de probă apoasa într-un tub de centrifugă. În special pentru
plasmă și ser, este de dorit să se utilizeze mai puțin de 1 ml de lichid biologic. Pentru LLE a
produselor farmaceutice finite sunt analizate în mod obișnuit probe cuprinse între 10 şi 100 ml şi
în astfel de cazuri extracţia este realizata într-o pâlnie de separare. De asemenea, pH-ul este
ajustat în probă pentru a asigura o extracţie eficientă a analitului. Acest lucru se realizează prin
adăugarea unei soluții tampon în probă, sau soluții ale unui acid sau o bază tare. Solventul de
extracție adăugat la probă trebuie să fie nemiscibil cu apa, pentru a forma un sistem bifazic cu
proba. Apoi, tubul de centrifugare sau pâlnia de separare se agită pentru o anumită perioadă de
timp, pentru a asigura o amestecare eficientă a celor două faze, analitul este astfel transferat din
probă apoasă în solventul organic. După aceasta, tubul de centrifugare sau pâlnia de separare
sunt lăsate în repaus un timp suficient pentru ca cele două faze să se separe din nou. La fluidele
biologice, această separare a fazelor poate fi dificilă, dar este obţinută prin centrifugarea
amestecului. După centrifugare, faza organică poate fi colectată sub forma unui extract care
conține analitul fiind pregătită pentru măsurarea analitică finală.

7
 Extracția este influențată de polaritatea și bazicitatea solventului de pH, de formarea
precipitatelor sau a combinațiilor complexe, etc. Considerând o soluție ce conține o singură
substanță dizolvată în mediul apos, prin adăugarea unui solvent organic nemiscibil cu apa,
substanța se repartizează între cei doi solvenți intr-o proporție dependent de solubilitățile
substanței în cei doi solvenți.
A aq ⇔ Ao (4.7)

La echilibru se poate define coeficientul de repartiție care este egal cu raportul

concentrațiilor molare ale substanței în cei 2 solvenți:

[ A ]o C Ao
K D= = (4.8)
[ A ]aq C Aaq

Coeficientul de repartiție este caracteristic pentru o substanță dată și un cuplu de

solvenți. În cazul în care substanța se află în soluție în mai multe forme, se calculează coeficientul
de repartiție condițional care este raportul dintre sumele concentrațiilor tuturor speciilor în cei doi
solvenți:

D=
∑ C Ao
(4.9)
∑ C Aaq

De exemplu, fenolul se poate extrage din soluție apoasă cu CH2Cl2, caz în care se
calculează coeficientul de repartiție KD.

[ C6 H 5 OH ]CH 2Cl 2
K D= (4.10)
[C 6 H 5 OH ]H 2 O

Dacă se adaugă în faza apoasă o bază tare, o parte din moleculele de fenol se
transformă în fenoxid mai solubil în apă. În acest caz se calculează coeficientul de repartiție
condițional.

[C 6 H 5 OH ] CH 2Cl2
D= (4.11)
[ C6 H 5 OH ]H 2O +[C 6 H 5 ONa ] H 2O

Pentru analiza și controlul medicamentului este importantă extracția medicamentelor

cu caracter slab acid sau slab bazic. În acest caz trebuie să se țină seama că o mica parte din
substanță este disociată neputând fi extrasă în solvenți nepolari hidrofobi. Prin adaugarea în
soluție a unui acid tare sau bază tare are loc deplasarea echilibrului de disociere spre stânga, în
soluție existând numai molecule nedisociate ce pot fi extrase.

Considerând un medicament slab acid care disociază în soluție:

+ −
HA+ H 2 O⇔ H 3 O + A
8
 (4.12)
+ −
[ H O ][ A ]
K a= 3 (4.13)
[ HA ]
Prin acidularea cu HCl echilibrul este deplasat spre stânga practice total.
În cazul în care soluția nu este acidulată, pentru aprecierea extracției se calculează
coeficientul de repartiție condiţional.

[ HA ]o [ HA ] o
D= =
−
[ HA ]aq +[ A ]aq Ka (4.14)
[ HA ]aq +( 1+ )
[ H 3 O+ ]aq

şi logaritmând expresia, se obţine:

Ka
log D=log K D−log (1+ )
[ H 3 O+ ]aq (4.15)

În funcţie de valoarea raportului Kc/H3O+ se pot face 2 aproximaţii:

- la un pH scăzut, inferior cu cel puţin două unităţi faţă de pK a raportul Kc/H3O+ < 0,001
fiind neglijabil se poate spucă log D≈ logKD iar influența pH-ului este nulă;

- dacă pH-ul este mai mare cu 2 unităţi decât pK a raportul Kc/H3O+ > 1, iar log D ≈ log K D
- log Kc/H3O+

În practica ELL pentru a obține o recuperare cât mai mare posibil, se încearcă să
maximizeze valorile pentru coeficientul de repartiţie condiţional (D). Parametrii care afectează
valoarea lui D și, prin urmare, recuperarea extracției sunt: coeficientul de partiție, pH-ul soluţiei
apoasă şi valoarea pKa a analitului.
Pentru un analit neutru, fără grupe funcționale acide sau bazice, recuperarea de
extracție este independentă de pH-ul din proba apoasă, și nu este necesară nici o ajustare a pH-
ului. Pentru analiții neutri recuperarea este determinată numai de coeficientul de partiție. Un
coeficient mare de partiție oferă o recuperare ridicată. Pentru analiții acizi și bazici pH-ul din proba
joacă un rol important, iar ajustarea pH-ului este obligatorie înainte de extracție. Pentru extracția
eficientă a acizilor, aşa cum am arătat pH-ul ar trebui să fie scazut prin menținerea unor condiții
acide în probă. În condiții acide, coeficientul de distribuţie este foarte aproape de coeficientul de
partiție. Figura 4.1 prezintă modul în care coeficientul de distribuţie variază în funcție de pH. Din
această figură reiese clar că cea mai mare distribuție în faza organică se obține la valori ale pH-
9
ului cu cel puțin două unități sub pK a, valoare pentru analitul acid. Figura 4.2 prezintă o
reprezentare grafică similară pentru un analit cu funcţie de bază. În acest caz, cea mai mare
distribuție în faza organică se obține la un pH cu cel puțin două unități mai mare decât valoarea
pKa. Cu alte cuvinte, pentru a extrage în mod eficient compușii bazici în solvenți organici, trebuie
asigurate condiții alcaline pentru proba apoasă, deoarece ionizarea analitului este redusă și, prin
urmare, este favorizată extracția în solvent organic.

Ibuprofen

Figura 4.1 Coeficientul de repartiţie functie de pH pentru un analit acid

Amitriptilina

Figura 4.2 Coeficientul de repartiţie functie de pH pentru un analit bazic.

În plus față de pH-ul probei, solventul organic este foarte important în ELL. Pentru a
obține coeficienţi mari de partiție și recuperări de extracție ridicate, ar trebui selectat un solvent
adecvat pentru analit. Pentru analiți foarte nepolari cu catene hidrocarbonate cu puține grupări
funcționale, cei mai buni solvenți sunt solvenții nepolari. Solvenți tipici de extracție sunt
hidrocarburi alifatice ca n-heptan sau ciclohexan, asa cum sunt menționati în tabelul 4.2. Pentru
analiți cu polaritate scăzută, dar cu caracter aromatic, se folosesc solvenţi aromatici cum ar fi
toluenul sau p-xilenul. Pentru analiți mai polari, ar trebui selectat un solvent mai polar dar nu
foarte polar, deoarece solventul nu trebuie sa fie nemiscibil cu apa pentru a putea forma un
sistem bifazic. Pentru analitii polari, foarte eficienti sunt solventii cu momente de dipol mari.
Exemple de solvenți cu proprietăți de dipol bune sunt diclormetanul și acetat de etil. Pentru
extracția analiților cu caracter bazic, care se caracterizează prin tendința de a accepta protoni,

10
aşa cum sunt aminele, se pot utiliza solvenți cu proprietăți donoare de protoni aşa cum este
cloroformul.

Tabel 4.2 Exemple de solvenţi folosiţi pentru ELL şi proprietăţile lor

Solvent Polaritate Punct de Vâscozitate Solubilitate în Densitate

fierbere (⁰C) apă (% v/v) (g/ml)
Solvenţi nepolari
n-hexan 0,1 69 0,30 0,014 0,65
ciclohexan 0,2 81 1,0 <0,1 0,77
n-heptan 0,1 98 0,42 0,01 0,68
Solvenţi aromatici
toluen 2,4 111 0,59 0,05 0,867
p-xilen 2,5 138 0,81 Insolubil 0,861
Solvenţi dipolari
diclormetan 3,1 40 0,44 0,9 1,327
acetat de etil 4,4 77 0,43 8,7 0,894
Solvenţi donori de protoni
cloroform 4,1 61 0,53 0,8 1,498
Solvenţi acceptori de
protoni
metil-terţbutileter 2,5 55 0,27 5,1 0,74
dietileter 2,9 35 0,24 7,5 0,713

Pentru analiți acizi, care se caracterizează prin tendinta de a ceda protoni, se preferă
solvenți care accepta protoni, exemple tipice fiind dietileterul și metil-terțbutil eterul.
Așa cum am precizat mai sus, analiții polari trebuie să fie extraşi cu solvenți organici
relativ polari iar analiții nepolari cu solvenți nepolari. Polaritatea solvenților poate fi cuantificată
prin indicele de polaritate, așa cum este arătat în tabelul 4.2. Pentru majoritatea hidrocarburilor
alifatice nepolare, indicele de polaritate este foarte aproape de valoarea 0. Pe măsură ce crește
polaritatea, indicele de polaritate crește, apa având un indice de polaritate de 10,2. Solvenții cu
indice de polaritate sub 4 sau 5 sunt în mod normal nemiscibili cu apa și pot forma un sistem
bifazic cu probele apoase, în timp ce solvenții cu un indice de polaritate mai mare decât 5 sunt
total miscibili cu apă și nu pot fi folosiţi pentru ELL.
Alegerea solventului pentru ELL nu se concentrează numai pe solubilitatea substanței
analizate. Alte proprietăţi ale solvenților ca densitatea și vâscozitatea au o mare importanţă
pentru punerea în practică a metodei de extracție. Sunt preferaţi solvenții cu vâscozitate scăzută
deoarece „se sparg” mai ușor în picături mici și amestecându-se cu proba apoasă în timpul
extracției, lucru benefic pentru transferul analitului în faza organică. Solvenții cu o densitate mai
mică decât apa vor pluti pe suprafata probei apoase dupa extracție, acesta fiind un avantaj în

11
cazul în care extractul organic urmează a fii colectat după extracție cu o pipetă. Exemple de
solvenți cu densitate mai mică decât a apei sunt hexanul si toluenul.
Volatilitatea solventului are de asemenea o importanță majoră. Orice evaporare a
solventului după extracție este mult mai rapida cu un solvent cu un punct de fierbere scăzut, fiind
preferaţi solvenții volatili, în cazul în care trebuie să fie evaporati după extracție. In final, pentru
solventul selectat pentru extracție, solubilitatea în apă trebuie să fie mică, pentru a evita prezenţa
unor cantități de substanța în proba apoasa. Așa cum se vede în tabelul 4.2, solubilitatea în apă a
solvenților poate fi diferită; solventul nepolar hexan are o solubilitate în apă neglijabila, în timp ce
acetatul de etil se dizolvă în apă în cantitate substanțială.

Medicamentele, metaboliţii şi compuşii endogeni prezintă funcţii acide sau bazice. La

pH-ul fiziologic de 7,4, în ser, acestea se găsesc într-un anumit procent în stare ionizată (procent
ce se calculează cu ecuaţia Henderson-Hasselbalch) fiind parţial solubile în faza apoasă. Pentru
a fi extrase într-un solvent organic este necesară transformarea lor într-o formă neionizată (acid
sau bază). Pentru aceasta trebuie cunoscute valorile pKa.

O schemă generală pentru extracţia medicamentelor cu funcţie bazică din fluide

biologice este prezentată în figura 4.3 [1-3]:

Ser, plasmă Adăugarea stan- Aducerea probei la Adăugarea solventului

sau urină dardului intern pH bazic de extracţie

Concentrare prin
evaporare în curent Centrifugare
de azot

Analiză

Figura 4.3 Schema generală de extracţie a medicamentelor cu funcţie bazică din fluide
biologice.

iar pentru medicamentele cu funcţie acidă, shema generală de extracţie este prezentată
în figura 4.4 [4]:

Ser sau Adăugarea stan - Aducerea probei la Adăugarea solventului

urină dardului intern pH acid de extracţie

Concentrare prin
evaporare în curent Centrifugare
12de azot
Figura 4.4 Schema generală de extracţie a medicamentelor cu funcţie acidă din fluide biologice.

Pentru o mai bună separare a compuşilor de interes din fluide biologice de restul
compuşilor, se utilizează aşa numita “back-extraction”. În cazul compuşilor cu funcţie bazică,
după aducerea probei (ser sau urină) la pH-ul bazic necesar transformării în formă neionizată,
urmează extracţia într-un solvent adecvat, centrifugarea şi separarea fazelor. Faza organică se
spală cu o soluţie acidă (acid clorhidric), pentru transformarea bazelor libere în formă ionizată şi
trecerea acestora înapoi în faza apoasă, se îndepărtează stratul organic, stratul apos se
alcalinizează, extrăgându-se bazele libere în solventul iniţial.

O altă posibilitate de extracţie a compuşilor bazici este următoarea: proba de ser sau
urină este adusă la pH acid, compuşii acizi sau neutri fiind extraşi într-un solvent adecvat. Faza
apoasă în care rămân compuşii bazici în forma ionizată este alcalinizată, aceştia extrăgându-se
apoi într-un solvent adecvat.

Câteva consideraţii asupra extracţiei lichid-lichid:

1. Solventul capabil de a extrage medicamentul trebuie să aibă o polaritate scăzută

pentru a putea reduce posibilitatea coextracţiei compuşilor endogeni. Exemple de
asemenea solvenţi sunt: hidrocarburi (hexan, toluen), compuşi cloruraţi, dietileterul
şi alţi eteri. Alcoolii cu număr mic de atomi de carbon sunt miscibili cu apa într-o
măsură mai mare sau mai mică, prin urmare neputând fi folosiţi ca solvenţi.
2. Multe medicamente liposolubile, chiar şi în stare ionizată, pot fi extrase în solvenţi
nepolari. De exemplu propranololul, cu pKa  9,5, la pH 7,4 este mai mult de 99%
ionizat. Întrucât coeficientul de repartiţie între n-octanol şi soluţia tampon cu pH =
7,4 la 37oC este 20,2, rezultă că medicamentul ionizat este uşor solubil în n-octanol.
3. Multe procedee de extracţie folosesc un rapot solvent:fază apoasă supraunitar, în
scopul reducerii posibilităţii de formare a emulsiilor la agitare. Totuşi, este de
preferat folosirea unor cantităţi mici de solvent, formarea emulsiilor putând fi redusă
prin saturarea fazei apoase cu clorură de sodiu, înainte de extracţie.
4. Recuperările pot fi mărite prin folosirea amestecurilor de solvenţi: hexan:butanol
(9:1) sau hexan:alcool izoamilic (97:3). Astfel de solvenţi sunt utili pentru extracţia
medicamentelor polare.
5. Un mod de optimizare a extracţiei constă în diluarea probei de aproximativ 10 ori.

4.3.2. Back-extracția lichid-lichid

13
 Așa cum s-a discutat până acum ELL se bazeaza pe faptul că analiții sunt transferati
din proba apoasă într-un solvent organic (extracție unică). Ulterior, solventul organic sau extractul
organic este folosit pentru analiza chimică finală. În cazul probelor foarte complexe, care conțin
mai multe componente ale matricei în concentrație ridicată, o singură extracție poate să nu fie
suficientă pentru ca unii dintre compușii matrice sa poata fi extrasi în solventul organic. Aceste
componente ale matricei pot fi diferite substanțe biologice din lichidele biologice, sau pot fi
excipienți din preparatele farmaceutice cu solubilitate scăzută în apă. În astfel de cazuri, poate fi
un avantaj o a doua etapă de extracție, numita back-extracție, într-o nouă fază apoasă, care este
utilizată pentru analiza chimică finală. Astfel, extractul organic din prima extracție este el însuși
extras cu o nouă fază apoasă, într-o a doua etapă. Avantajele unei back-extracții sunt
reprezentate atât de curățarea probei, cât și de faptul că extractul final este apos fiind compatibil
cu anumite instrumente analitice.

4.3.3. Extracţia prin perechi de ioni

Această metodă constă în formarea unei perechi de ioni, medicament (M) şi contraion
(C), care formează un aduct neutru, aceasta fiind extrasă într-un solvent nepolar:
± ±
M aq +C aq →[ MC ]org (4.16)

Această metodă se aplică medicamentelor foarte polare care nu pot fi extrase direct într-
un solvent organic, fiind o metodă selectivă de extracţie.
Fiind foarte selectivă, metoda a fost aplicată şi pentru extracţia medicamentelor nepolare
care sunt uşor solubile în solvenţi organici. Astfel, alprenololul şi metabolitul său 4-hidroxi-
alprenolol au fost extraşi într-un amestec ciclohexan/pentanol utilizând ionul perclorat ca şi
contraion. Un avantaj al acestei metode constă în aceea că derivatizarea medicamentului se
poate efectua pe parcursul extracţiei. De exemplu: clioquinolul, având un caracter amfoter, poate
fi extras în clorură de metilen folosind ca şi contraion cationul tetrahexilamoniu.

Cl Cl

+
+ [N(C 6H13 )4]+ + HO- . N(C 6H13 )4
I I N
N
OH O-

Metilarea grupei –OH fenolic a fost efectuată în timpul extracţiei cu o soluţie de iodură de
metil în clorură de metilen.
Cl Cl

+ - +
. N(C 6H13 )4
CH 3I
+ I N(C 6H13 )4
I CH 2Cl 2 I N
N
O- OCH 3
14
 Faza organică este apoi îndepărtată prin evaporare iar reziduul dizolvat în hexan. La
aceasta se adaugă o soluţie de acid percloric 5 M şi o soluţie saturată de fosfat trisodic, urmând o
nouă extracţie în hexan.

Desigur că nu toate perechile de ioni sunt extractibile în solvenţi organici ci în general

numai acelea care conţin cel puţin un ion (cation sau anion) voluminos şi hidrofob. Principalele
tipuri de anioni şi cationi care au un pronunţat caracter hidrofob putând fi folosit ca şi contraioni
sunt: a) anioni:- sulfaţii acizi de alcoil: dodecilsulfatul de sodiu (lauril sulfatul de sodiu) şi
dioetilsulfosuccinatul de Na, tetrafenilboratul, unele fluoresceine: eozina sau tetrabromfluresceina

b) cationi:de amoniu cuaternar cu lanţuri lungi, derivaţi de amine terţiare ciclice: alcaloizi,
fenotiazinele, complecşi chelaţi cationici: complexul Fe 2+ cu o-fenantrolina.

4.4. Extracţia solid-lichid

Extracția solid-lichid este abreviata ESL şi este utilizata pentru a extrage analiți din probe
solide cu un solvent de extracție. În laboratorul farmaceutic ESL este folosită mai ales pentru
extracția de substanţe active farmaceutice din forme farmaceutice solide, cum ar fi tablete și
capsule, fiind o metodă de extracție similară cu ELL, deoarece analitul este transferat dintr-o faza
în alta: în acest caz dintr-o probă solidă într-un lichid. Considerațiile teoretice discutate pentru
ELL se aplică si metodei ESL.
Procedeul de ESL începe cu triturarea probei solide care urmează să fie analizată.
Acest lucru este important pentru a îmbunătăti eficiența extracției sau recuperarea. Deoarece
proba este dezintegrata în particule mici, moleculele de analit incluse în proba solidă devin mult
mai accesibile pentru solvent. După triturarea probei, o anumită cantitate de probă este
transferată în vasul de extracție, apoi se adaugă solventul de extracție, iar întregul sistem se agită
manual sau este introdus într-o baie ultrasonică pentru o anumită perioadă de timp. Agitarea sau
ultrasonarea este importantă pentru a accelera extracția. În timpul extracției, moleculele de analit
sunt eliberate din probă solidă și se dizolvă în solventul de extracție. După extracție, conținutul
vasului este filtrat pentru a separa reziduurile probei solide din solventul de extracție. Filtratul este
utilizat în final pentru analiza chimică.
ESL diferă de LLE prin două aspecte. În primul rând, este mult mai dificil de extras anali ți
dintr-o probă solidă, de aceea ESL este realizată prin extracții multiple, cu noi porțiuni de solvent
care sunt combinate în extractul final. În al doilea rând, în ESL se pot utiliza solvenți miscibili cu
apa, atâta timp cât constituenții majoritari ai matricei nu se dizolvă în apă. Acest lucru înseamnă
că metanolul, etanolul și acetonitrilul pot fi utilizați ca solvenți de extracție în ESL. Apa se poate
folosi ca solvent de extracție, în special ca soluții apoase de bază tare sau acid tare. Soluțiile
apoase de baze tari sunt utilizate pentru a extrage analiții acizi, în timp ce soluțiile apoase ale
acizilor tari sunt folosite pentru a extrage analiții bazici.

15
4.5. EXTRACŢIA PE FAZĂ SOLIDĂ

Extracţia lichid-lichid prezintă anumite inconveniente şi anume:

- formarea emulsiilor la centrifugare;

- folosirea doar a solvenţilor nemiscibili cu apa, pentru probele în care solventul este
apa (ser, urină);
În ultimii 10 ani s-a utilizat foarte mult extracţia pe fază solidă [5,6]. Avantajele acestei
metode sunt: o separare mai bună a analiţilor de restul compuşilor şi o concentrare a acestora în
vederea detecţiei.

Proba lichidă sau proba solidă, dizolvată într-un solvent, este introdusă într-un cartuş de
extracţie pe fază solidă şi forţată apoi să acopere întreaga suprafaţă a cartuşului cu ajutorul
presiunii sau vidului. Această metodă de extracţie a fost concepută pentru reţinerea analiţilor care
prezintă interes precum şi a componenţilor probei, asemănători cu aceştia.

O metodă de extracţie pe fază solidă aplicată corect va reduce la minim cantitatea de

compuşi nedoriţi din probă. Componenţii probei care au fost slab reţinuţi sunt eluaţi apoi cu
ajutorul unui solvent. În final, analiţii de interes sunt eluaţi de pe fază cu un alt solvent. Acest
solvent este colectat în vederea analizei sau a unei prelucrări suplimentare. În alte cazuri, analiţii
de interes trec de la un capăt la altul al cartuşului fără a fi reţinuţi, fiind colectaţi la ieşire.
Componenţii din probă care produc interferenţe sunt reţinuţi şi astfel sunt izolaţi compuşii ce
prezintă interes analitic. În majoritatea cazurilor, reţinerea analiţilor pe cartuş conduce la o
purificare mai bună a probei.

Un cartuş de extracţie pe fază solidă este alcătuit din trei părţi principale (figura 4.5):

1. corp tubular;

2. frite;

3. faza legată chimic sau adsorbent.

Corpul cartuşului este tubular, asemănător unei seringi şi este fabricat din material
polipropilenic. Tubul are diferite capacităţi (1ml, 3ml, 6ml), corespunzătoare diferitelor cantităţi de
fază introdusă în cartuşul de extracţie.Frita are rolul de a menţine umplutura în tub şi acţionează
ca un filtru special, cel mai utilizat material pentru confecţionarea fritei fiind polietilena. În scopuri
speciale se foloseşte teflonul sau oţelul inoxidabil.

Tub din
polipropilenă

Frite din 16
polipropilenă
 Fază/adsorbent

Figura 4.5 Cartuşul de extracţie pe fază solidă.

Fazele legate chimic sunt obţinute prin fixarea de grupările Si-OH din silice a unor
radicali organici. Ele sunt comercializate sub denumirile Zorbax sau Accubond, structurile chimice
fiind prezentate în tabelul 4.3 [7]:

Tabelul 4.3 Tipuri de faze staţionare legate chimic.

Nr.Crt Denumire şi structură Mecanism de retenţie

1. Zorbax C 18 sau Accubond C 18 - nepolar
- polar
Si O Si (CH2) 17 CH3 - schimb cationic
O
Si O H

C 18 octadecilsilan (ODS)
2. Zorbax C 18 EC - nepolar

Si O Si (CH2) 17 CH3
O
Si O Si (CH3) 3

C 18 octadecilsilan şi trimetilsilil
3. Zorbax C 8 sau Accubond C 8 - polar
- nepolar
Si O Si (CH2) 7 CH3 - schimb cationic
O
Si OH

C 8 octilsilan
4. Zorbax Silica - polar
- schimb cationic
Si O H
O
Si O H

5. Accubond Ethyl - polar

- nepolar
- schimb cationic

17
 Si O Si CH2 CH3
O
Si O H

6. Accubond Phenyl - polar

- nepolar
Si O Si C6H5 - schimb cationic
O
Si O H

7. Accubond cyano - polar

- nepolar
Si O Si (CH2) 3 CN - schimb cationic
O
Si O H

8. Accubond diol - polar

- nepolar
Si O Si (CH2) 3 O CH2 CH CH2 - schimb cationic
O
Si O H OH OH

9. Accubond amino - polar

- schimb anionic
Si O Si (CH2) 3 NH 2
O
Si O H

10. Accubond Ion exchange - schimb anionic puternic

Si O Si (CH2) 3 N+(CH2) 3Cl

O
Si O H

11. Accubond Ion exchange - schimb cationic puternic

Si O Si (CH2) 2 SO3 H+
O
Si O H

Acestea prezintă grupări Si-OH în structură sau grupări Si-OH reziduale care ionizează
în funcţie de pH.Ca adsorbenţi sunt utilizaţi: silicea şi polimerii poroşi de tip Porapak sau
Chromosorb din seria 100 [8]. Alegerea fazei sau adsorbentului adecvat este determinată de
solventul probei şi de compuşii de interes. În cazul fluidelor biologice unde solventul este apa,
adsorbentul sau faza trebuie să fie hidrofobe. În cazul fazelor hidrofile, apa este puternic reţinută
împiedicând reţinerea analiţilor. Când solventul probei este un compus organic, adsorbentul sau
faza trebuie să fie hidrofile. Faza reţine compuşii polari iar cei nepolari pot fi eluaţi cu uşurinţă.
Pentru fluide biologice cei mai buni adsorbenţi sunt polimerii poroşi care sunt complet hidrofobi.
18
 La alegerea fazei/adsorbentului trebuie avute în vedere natura legăturilor intermoleculare
(şi tăria acestora) care se formează între analiţi şi acestea.

Etapele procesului de separare pe fază solidă sunt următoarele:

1. Condiţionarea fazei/adsorbentului.
Fazele legate chimic sau polimerii poroşi sunt spălaţi cu solvenţi organici ca metanolul
sau acetonitrilul, pentru eliminarea compuşilor organici reţinuţi de fază/adsorbent.

2. Aducerea fazei/adsorbentului la pH-ul probei cu soluţie tampon sau cu soluţii de acid

respectiv bază.
3. Introducerea probei pe fază/adsorbent. În acest scop se utilizează un vid uşor
pentru ca proba să acopere întreaga suprafaţă a cartuşului.
4. Eluţia compuşilor nedoriţi în vederea purificării probei. Această etapă este foarte
importantă deoarece prin acest pas se poate pierde o parte din analiţi. Dacă analiţii
sunt baze organice acestea sunt total sau parţial solubile în solvenţi organici. În
cazul în care eluţia se face cu apă, o parte din aceştia trec la pH-ul apei, în stare
ionizată fiind eluaţi [8]. La fel şi în cazul compuşilor cu funcţie acidă. Spre exemplu
pentru separarea unor medicamente anestezice cu structură de tip amino-amidă
(mepivacaină, lidocaină, bupivacaină, ropivacaina) spălarea cartuşului se face cu o
soluţie tampon cu pH bazic, analiţii acizi şi neutri fiind astfel eluaţi de pe cartuş.
5. Eluţia analiţilor de interes de pe cartuş cu un solvent sau amestec de solvenţi.
Esenţial pentru o bună separare este ca:

- adsorbentul să nu se usuce între etape;

- debitul de trecere al solvenţilor prin cartuş să fie constant şi mic;
- solvenţii folosiţi să fie miscibili între ei.

4.5.1. Extracţia compuşilor cu funcţie bazică din fluide biologice

Proba de sânge (ser sau plasmă) este adusă la un pH la care compuşii bazici să fie în
stare neionizată. Acest pH se calculează cu relaţia Henderson-Hasselbalch, ţinând cont de
valorile Ka ale bazelor organice. Solventul probei fiind apa, faza/adsorbentul trebuie să fie
hidrofobe.

Probele de urină în care medicamentele şi metaboliţii sunt conjugaţi trebuie supuse unei
hidrolize. Pentru studii de toxicologie în cazul fenproporexului, s-a făcut o hidroliză acidă [9].
Astfel la 5 ml urină s-au adăugat 1,5 ml HCl 37,5 %, proba fiind refluxată timp de 15 minute. În
alte studii de metabolism s-a făcut o hidroliză enzimatică: 5 ml urină adusă la pH = 5,2 cu acid
acetic a fost apoi incubată la 38oC timp de 12 ore cu 100 l glucuronidază şi arilsulfatază.
Benzodiazepinele sunt eliminate ca glucuronide [5]. Înainte de extracţia pe fază solidă este
necesară hidroliza enzimatică cu glucuronidază la 56oC timp de 60 minute. După hidroliza acidă
sau enzimatică proba a fost adusă la pH bazic.

19
 După alegerea fazei/adsorbentului şi pregătirea probei sunt necesari următorii paşi:

- condiţionarea cartuşului prin spălări repetate cu solvenţi organici miscibili cu

solventul probei (apa): metanol, acetonitril;
- aducerea fazei/adsorbentului la pH-ul probei cu soluţie tampon alcalin sau soluţie
bazică;
- introducerea probei pe cartuş;
- eluţia compuşilor interferenţi cu un solvent care să nu extragă şi analiţii. Cum nu se
găseşte un astfel de solvent se recomandă folosirea de soluţie tampon bazic cu
acelaşi pH ca al probei;
- eluţia compuşilor bazici cu un solvent adecvat.

4.5.2. Extracţia compuşilor cu funcţie acidă din fluide biologice

Proba de sânge (ser sau plasmă) este adusă la pH acid, în timp ce proba de urină este
supusă mai intâi unei hidrolize acide sau enzimatice. Etapele extracţiei sunt următoarele:

- condiţionarea adsorbentului prin spălare de mai multe ori cu solvenţi organici

miscibili cu apa;
- aducerea adsorbentului la pH-ul probei;
- introducerea probei pe cartuş;
- eluţia compuşilor interferenţi cu soluţie tampon cu pH acid. La pH acid compuşii
bazici trec în fază ionizată şi sunt eluaţi de pe cartuş;
- eluţia compuşilor acizi cu un solvent adecvat sau cu un amestec de solvenţi.
Capacitatea de extracţie a unei faze solide depinde de analiţii respectivi, de concentraţia
acestora şi de natura probei. Cantitatea de fază este aproximativ 100, 200, 300 mg, la
concentraţii mici fiind necesare cantităţi mici de fază. Probele impurificate în mod semnificativ sau
cele concentrate necesită cantităţi mai mari de fază pentru a putea fi aduse într-o stare suficient
de pură.

Dacă este necesară evaporarea solventului din ultima etapă a extracţiei, în vederea
concentrării analiţilor, aceasta se va face imediat după extracţie, în flux de azot la temperaturi
scăzute (cel mult 50oC) pentru a împiedica descompunerea analiţilor.

4.5.3. SPE cu fază inversă

Faza inversă în SPE este utilizata pentru extracţia analiților relativi nepolari din soluții
apoase de probă. Extracția se bazează pe interacțiuni hidrofobe între analit și faza staționară.
Acest lucru înseamnă că retenţia creşte cu creșterea hidrofobicităţii analitului. Interacțiunile se
bazează pe forţele van der Waals dintre legăturile hidrogen-carbon din faza staţionară şi
legăturile hidrogen-carbon din moleculele de analit. Interacțiunile hidrofobice sunt formate în
mediul apos sau polar, şi se desfac în medii organice sau nepolare.

20
 Pentru analize pe fază inversă SPE sunt disponibile mai multe faze staționare, așa cum
este prezentat în figura 4.6, bazate pe particule de siliciu. Aceste faze staționare au diferite
marimi ale grupelor hidrofobe. Coloanele C18 sunt foarte populare, fiind cele mai folosite coloane
cu fază inversă hidrofobă. Din cauza hidrofobicităţii mari, coloanele C 18 prezintă retenție puternică
pentru mulți compuși și pot fi folosite pentru multe aplicații.

Octadecil C18
creşte caracterul hidrofob
Octil C8

Etil

Ciclohexil

Fenil

Cianopropil

Figura 4.6 Diferite fazei stationare folosite ca fază inversă SPE

Cu toate că această fază staţionară poate extrage o gamă largă de compuși, nu are cea
mai bună selectivitate. Pentru a crește selectivitatea, se pot utiliza faze mai puțin hidrofobe, cum
ar fi coloanele C8, care sunt de asemenea foarte folosite. În plus față de coloanele SPE bazate pe
siliciu, se pot utiliza, coloanele pe bază de polimeri. Un exemplu de polimer utilizat ca fază
staționară în SPE este ilustrat în figura 4.7.

Figura 4.7 Fază staţionară SPE polimerică

Acesta este defapt un co-polimeri alcatuit din doi monomeri diferiți, și anume un
monomer hidrofob, divinilbenzenul și unul mai polar N-vinilpirolidona. Fragmentele de
divinilbenzen dau hidrofobicitatea fazei staționare și acestea sunt responsabile pentru
interacțiunile hidrofobe cu analiții. În contrast, fragmentele de N-vinilpirolidonă conferă un caracter
hidrofil şi pot reține compușii mai polari. Un avantaj important al fazelor staționare pe bază de
21
polimeri este faptul că acestea nu îşi schimbă proprietățile chimice, chiar dacă se usucă în timpul
procedurii, iar etapa inițială de condiționare poat fi evitată.
După cum s-a menționat mai sus, interacțiunile hidrofobe se formează în mediu apos
sau polar, în timp ce acestea sunt desfăcute în medii organice sau nepolare. Acest lucru
înseamnă că un medicament relativ nepolar prezent într-un fluid biologic apos poate fi reţinut pe o
faza inversă SPE prin interacțiuni hidrofobe.
Pentru analiți acizi sau bazici, retenția poate este mai bună daca compușii sunt prezenți
în probă în formă neionizată. Acest lucru înseamnă că pentru analiți bazici, retenția în coloana
SPE este îmbunătățită prin aducerea probei la pH alcalin, de obicei prin diluarea probei cu un
tampon bazic.
Pentru spălarea coloanelor sunt utilizate de obicei soluții apoase sau apă pură, pentru a
elimina componentele matricei din coloana SPE. În această etapă se îndepărtează compușii
solubili în apă care nu au nici o afinitate pentru faza staționară, adică substanţele polare. În unele
cazuri pot fi utilizate soluții apoase de spălare conținând 10 sau 20% metanol sau alți solvenți
organici, dar trebuie avut grijă să nu producă eluarea analiților din coloana. Introducerea unor
cantități mici de metanol în soluția de spălare asigură obţinerea unor extracte mai curate. Pentru
eluaţia finală a analiților de pe faza staţionară se foloseşte de obicei metanol 100% sau
amestecuri de metanol și apă. Metanolul pur asigură un mediu organic 100%, în coloană, iar
interacțiunile hidrofobe sunt eliminate complet, motiv pentru care se utilizează cantități mici de
eluent evitând diluarea eluatului. Dacă analiții sunt compuși bazici sau acizi, poate fi ajustat pH-ul
eluantului pentru a produce ionizarea analiților, reducând astfel interacțiunile hidrofobe.

4.5.4. SPE cu schimb de ioni

Analiții care conțin grupări ionice, cum ar fi acizi și baze, pot fi extrase din probe apoase
prin SPE cu schimb de ioni. Principalul tip de interacțiuni în SPE cu schimb ionic este
interacțiunea ionica între grupele ionice de pe faza staționară și grupele ionice ale analiților.
Analiții cationici sunt încărcati pozitiv fiind extraşi cu schimbători de cationi încărcati negativ.
Multe substanţe active farmaceutice sunt amine și pot fi extrase cu schimbătorii de cationi. Într-un
mod similar, analiții anionici încărcaţi negativ, aşa cum sunt acizii carboxilici pot fi extraşi cu
schimbători de anioni, care sunt încărcaţi pozitiv.
Fazele staționare sunt caracterizate ca schimbători puternici de ioni sau schimbători
slabi de ioni. Un schimbător de ioni puternic este ionizat în întregul interval de pH, și va acționa ca
schimbător de ioni, indiferent de pH-ul din coloana SPE în timp ce un schimbător de ioni slab este
ionizat la anumite valori ale pH-ului.

22
 Sulfonilpropil Schimbător cationic puternic

Carboximetil Schimbător cationic slab

Trimetilaminopropil Schimbător anionic puternic

Dietilaminopropil Schimbător anionic slab

Figura 4.8 Exemple de faze stationare pentru SPE prin schimb ionic
Schimbătorii de cationi puternici folosesc în mod normal ca grupare ionică un acid
sulfonic funcționalizat. Acizii sulfonici au valori foarte mici pKa fiind acizi puternici şi funcționează
ca schimbători de ioni în întreg domeniul de pH. Schimbătorii de cationi slabi conţin grupe
carboxil, acestea fiind acizi slabi cu valori pKa în jurul valorii de 4,5-5,0. Astfel de schimbători sunt
ionizaţi la valori ale pH-ului mai mari decât 3.
De asemenea, schimbătorii de anioni pot fi tari și slabi. Schimbătorii de anioni tari conțin
o grupare de amoniu cuaternar ca grupare funcțională fiind ionizate pe intreaga gama de pH.
Schimbătorii de anioni slabi conțin în mod normal o amină secundară sau terțiară ca grupă
funcțională, cu valori pKa in apropiere de 10. Aceştia ionizează la valori ale pH-ului cu mult sub
10. Figura 4.9 ilustrează retenția de amfetamină ca substanța analizata pe o coloană SPE de
schimb puternic cationică.

Analit

Interacţie ionică

Particulă de
silicagel
Sulfonilpropil

Figura 4.9 Retenţia amfetaminei pe un schimbător cationic puternic

În momentul introducerii probei este important ca atât schimbătorul de ioni cât și analitul
să poată adopta o structură ionică fiind reţinut. Utilizând un schimbător de cationi puternic acesta
este ionizat pe tot domeniul de pH. În schimb amfetamina pentru a trece în forma sa ionizată pH-
ul trebuie ajustat cu cel puţin două unităţi sub valoarea sa pK a (10,1). Aceasta înseamnă că pH-ul
în proba nu trebuie să depășească 8,0.
După încărcare, coloana SPE este spălată pentru a îndepărta cât mai mult posibil
componentele matricei folosind de preferință soluţii tampon fără a afecta ionizarea analiţilor
23
reţinuţi pe faza schimbătoare. Spălarea se poate face cu metanol, care nu afectează interacțiunile
ionice între analit și faza staționară, în plus asigură îndepărtarea compușilor neutri din matrice cu
polaritate scăzută.
În etapa finală, analitul este elutat din coloana SPE. În cazul amfetaminei, aceasta se
poate elua la un pH = 12, la care analitului se găseşte în formă neionizată. Adăugarea de metanol
la eluent este un avantaj deoarece amfetamina poate avea o anumită interacțiune hidrofobă cu
catenele hidrocarbonate ale schimbătorului de ioni, iar metanolul va crește solubilitatea
amfetaminei în eluent.
În mod obişnuit schimbătorul de anioni este condiţionat prin spălare cu o soluţie tampon
0,01-0,1 M, la pH-ul probei. Tamponul trebuie să conţină ioni care sunt uşor de înlocuit de pe
suprafaţa fazei schimbătoare, cum ar fi: OH-, C2H5COO-, CH3COO- sau F-. Ioni ca Br-, Cl-, NO3-,
HSO4- sau citrat nu pot fi înlocuiţi uşor. În proba care conţine compuşi acizi se adaugă un
amestec tampon 0,1 M având pH-ul cu 1 sau 2 unităţi peste valoarea pKa. De exemplu pentru
meticilină se foloseşte un tampon cu pH 3,8-4,8, putând fi extrasă pe un schimbător de anioni
puternic sau slab, deoarece aceasta are un caracter acid destul de pronunţat. Adsorbentul poate
fi spălat cu amestec tampon, apă deionizată sau cu un solvent organic, urmând ca meticilina să
fie eluată apoi cu o soluţie tampon care să conţină un contraion într-o concentraţie mare, spre
exemplu cu o soluţie de clorură de sodiu sau citrat de sodiu 1M. Mulţi compuşi organici au o
afinitate ridicată pentru suprafaţa lipofilică a mediului, în acest caz în tamponul de eluţie fiind
indicat să se introducă metanol. Compuşii pot fi eluaţi prin anularea ionizării, astfel meticilina
poate fi eluată la un pH scăzut cu un amestec HCl 1 M/metanol, acest lucru nefiind recomandat în
acest caz datorită instabilităţii penicilinelor la pH redus.

Coloanele cu schimbători de cationi sunt condiţionate prin spălare cu un amestec

tampon 0,01-0,1 M la pH-ul probei. Tamponul ar trebui să conţină ioni K +, Na+ sau NH4+ care sunt
uşor de înlocuit din gel de către cationii organici. Ionii bivalenţi precum Ca 2+ sau Mg2+ sunt dificil
de înlocuit de pe suprafaţa schimbătorului. Proba este apoi tratată cu un tampon 0,1 M la un pH
cu 1-2 unităţi sub valoarea pKa. De exemplu la extracţia adrenalinei ar trebui utilizată o soluţie
tampon de NH4Cl (pH = 8,3). Adsorbentul poate fi spălat apoi cu o soluţie tampon, cu apă sau cu
un solvent organic, cum ar fi metanolul. Eluţia se realizează cu un tampon care conţine un
contraion la o concentraţie ridicată, de exemplu o soluţie de NH4Cl 1 M. În situaţia în care proba
are o solubilitate limitată în apă, în solvenţi cum ar metanolul sau etanolul trebuie adăugat un
tampon cu tărie ionică mare.

În figura 4.10 sunt prezentate procesele de schimb ionic ale meticilinei şi adrenalinei pe
faze schimbătoare de ioni.

CH3O

S NH CO
Schimbator
anionic puternic N CH3O
-OOC
O
O
O Si N+(CH 3)3

O 24 CH3O

S NH CO
Schimbator
 O
+
O Si NH3

OH
O CH 3NH 2CH 2CH OH
Schimbator +
O Si
cationic puternic OH
O -
SO3

OH
CH 3NH 2CH 2CH OH
+
Schimbator O
OH
COO -
cationic slab
O Si

Figura 4.10 Procesele de schimb ionic ale meticilinei şi adrenalinei

4.6. MICROEXTRACŢIA PE FAZĂ SOLIDĂ

Microextracţia pe fază solidă propusă de către J. Pauliszyn [11,12] a fost mai întâi
dezvoltată pentru compuşii volatili analizaţi prin cromatografie în fază gazoasă. Extracţia analiţilor
este realizată pe fibre de silice topită acoperite cu faze staţionare (Carbowax, polidimetilsiloxani,
etc) sau cu faze staţionare amestecate cu adsorbenţi solizi precum polimerii de tip divinilbenzen,
răşini sau cărbune poros. Metoda a fost extinsă şi la cromatografia de lichide printr-o interfaţă sub
forma unui ventil cu 6 căi.

Fibra este ataşată unui piston de oţel inoxidabil într-un suport de protecţie.

Etapele microextracţiei pe fază solidă sunt simple [7]:

- se trece acul cu fibra retrasă prin septumul flaconului cu probă;

25
 - se apasă pistonul în vederea punerii fibrei în contact cu proba. Fibra poate fi
imersată în proba lichidă sau plasată deasupra probei. Analiţii sunt adsorbiţi pe faza
fibrei în 2 până la 30 minute;
- se retrage fibra în ac şi se îndepărtează din flaconul cu probă.
Analiza prin cromatografie de gaze:
- se introduce acul în portul injectorului CG;
- se apasă pistonul expunând fibra în zona încălzită a injectorului pentru a desorbi
analiţii;
- se analizează proba.
Analiza prin cromatografie de lichide:
- se introduce acul în camera de desorbţie a interfeţei cu ventilul de injecţie în poziţia
"încărcat";
- se expune fibra şi se închide clapeta de etanşare;
- se comută ventilul de injecţie în poziţia "injecţie". Faza mobilă trece prin cameră,
desoarbe analiţii şi îi transportă în coloană. Există două metode de desorbţie: statică
şi dinamică. În cazul desorbţiei statice, fibra este expusă fazei mobile în camera de
desorbţie pentru o anumită perioadă de timp, înainte ca proba să fie injectată în
coloană. În desorbţia dinamică, ventilul este comutat pe injecţie imediat ce clapeta
de etanşare este închisă;
- se comută ventilul de injecţie pe poziţia de încărcare, se retrage fibra şi se scoate
acul.
Alegerea tipului de fibră se face în funcţie de masa moleculară şi polaritatea analiţilor.
Compuşii cu masă moleculară redusă sau cei volatili necesită, în mod obişnuit, o fibră acoperită
cu un strat de 100 μm polidimetilsiloxan, în timp ce compuşii cu masă moleculară mare sau
semivolatili se extrag mai bine pe o fibră de 7 μm acoperită cu polidimetilsiloxan. O fibră de 30 μm
cu polidimetilsiloxan extrage şi eliberează compuşi semivolatili cu masă moleculară mai mare
decât cea de 100 μm şi oferă o retenţie mai mare a compuşilor semivolatili nepolari decât fibra de
7 μm.Pentru a extrage analiţi cu polaritate ridicată din probe polare, se utilizează o fibră de 85 μm
acoperită cu poliacrilat. Analiţii mai volatili, precum alcoolii sau aminele, sunt adsorbiţi mai eficient
şi eliberaţi mai rapid cu o fibră de 65 μm acoperită cu polidimetilsiloxan/ divinilbenzen. Fibra de 65
μm polidimetilsiloxan/divinilbenzen este cea mai folosită în aplicaţii generale prin CL. Compuşii
tensioactivi sunt extraşi eficient cu o fibră acoperită cu Cabowax/răşină.
Pentru analiza compuşilor volatili la nivel de urme se recomandă utilizarea unei fibre de
75 μm polidimetilsiloxan /cărbune.

26