Metode analitice de detecție a intoxicației cu metanol

1.Introducere
Metanolul, utilizat pe scară largă în diferite procese pentru o lungă perioadă de
timp, după anii 1900, este un lichid ușor, volatil, incolor, inflamabil, cu un miros distinct,
foarte asemănător cu cel al etanolului (1). Metanolul există în mod natural în toate țesuturile
plantelor (frunze, tulpină, flori, rădăcină, etc.), dar concentrații mai ridicate se găsesc în
frunze și tulpini verzi. Acest alcool joacă mai multe roluri în fiziologia plantelor, deoarece
orice fel de stres poate crește producerea metanolului în ele. Conform standardelor actuale,
existența a 120-460 mg L-1 (cu o medie de 140 mg L -1) metanol în sucurile proaspete și în
cele conservate este permisă. (2)
Metanolul este toxic pentru om și cauzează intoxicație care poate fi asociată cu
diferite simptome. Primul caz de intoxicație profesională cu metanol, raportată în 1901, a
fost a unui bărbat care a devenit orb după expunerea periodică la lac dizolvat în metanol și
după utilizarea metanolului pentru curățarea feței și a brațelor (1,2). Intoxicația cu metanol
este o urgență medicală relativ rară, dar care poate duce la morbiditate și mortalitate
semnificativă dacă nu este tratată și prezintă provocări atât pentru clinicieni, cât și pentru
laboratoarele de toxicologie. Metanolul este folosit drept component solvent al unora solutii
antigel, vopsele, aditivi pentru benzina și etanol denaturanți. Intoxicația cu metanol poate fi
cauzată de consumul de băuturi alcoolice și pesticide, utilizarea greșită a medicamentelor
sau consumul de substanțe chimice care conțin metanol pentru sinucidere. Este o urgență
medicală în care administrarea rapidă a antidoturilor care împiedică formarea acidului
formic ca metabolit toxic al metanolului prin blocarea alcool dehidrogenazei (ADH) și
eliminarea sporită a metanolului şi formaldehidei sunt cruciale pentru un tratament eficient.
(3)
Metanolul este metabolizat la formaldehidă de către alcool dehidrogenază și apoi
este transformat în acid formic de către aldehida dehidrogenază, în ficat. Acidul formic este
principalul metabolit toxic care poate cauza probleme grave la concentrații mari (> 200
mg/L) ceea ce justifică tratamentul prin hemodializă (3). Efectele toxice ale formiatului pot
deteriora nervii optici și previn metabolismul energetic al mitocondriei, care în cele din
urmă distruge corpul viu. Doza de intoxicație și doza letală de metanol variază între indivizi
diferiți, dar în general, ingestia acută a 10 mL de metanol poate provoca orbire permanentă
iar 100–200 mL poate fi fatal pentru majoritatea adulților. Au fost raportate niveluri de
metanol din sânge de la 504 la 1286 µg/mL, prin expunerea prin inhalare, care au dus la
alterarea vederii. Pentru cazurile fatale de intoxicație cu metanol, concentrația din sânge a
prezentat o gamă largă de valori, de la 150 la 4820 µg/mL. Gestionarea intoxicațiilor severe
cu metanol include administrarea de etanol sau fomepizol și începerea timpurie a
hemodializei. Indicaţiile pentru administrarea de etanol includ niveluri de methanol > 20
mg/dL în caz de aport recent sau când se suspectează otrăvirea severă. Indicațiile generale
ale hemodializei includ concentrații serice ridicate de metanol (> 50 mg/dL), acidoză
metabolică, modificări vizuale și neurologice. În plus, în intoxicația cu metanol, acidul folic

1
este eficient pentru accelerarea metabolismului formataldehidei în dioxid de carbon și apă.
(4)
Stadiul inițial al intoxicației cu metanol este de obicei asimptomatic. În etapa
ulterioară (la 6–12 h după ingerare), pot apărea simptome grave cauzate de metanol și acid
formic. Simptomele specifice concentrațiilor serice mari de acid formic includ tulburări de
vedere, leziuni ale nervului optic, disconfort abdominal, greață și cefalee. Fără intervenție
medicală, concentrațiile mari de acid formic pot provoca insuficiență respiratorie și renală,
comă și în cele din urmă moartea. În faza târzie, semnul distinctiv de diagnostic al
intoxicației cu metanol este prezența unui decalaj osmolar și a acidozei metabolice. Acești
indicatori nu sunt, din păcate, specifici și pot fi cauzați de alte afecțiuni (3)
Doza letală DL50 pentru șobolani este de 5628 mg/kg. Adesea, istoricul cantității de metanol
ingerat de pacienții umani nu este de încredere. Au fost raportate cazuri de orbire toxică
cauzate de ingerarea a 4 mL de metanol și deces prin ingerarea a 30 mL de metanol,
precum și un caz de supraviețuire fără leziuni de organ după ingerarea a 500 mL metanol,
cu hemodializă în stadiu incipient. (5)

2. Metode de analiză utilizate pentru determinarea intoxicației cu metanol

Pentru detecția metanolului este cel mai adesea folosit sângele ca material
biologic. Cu toate acestea, există un interes din ce în ce mai mare pentru urină și saliva ca
specimene biologice, deoarece ambele sunt obținute într-un mod neinvaziv. De-a lungul
timpului au fost descrise numeroase metode chimice și enzimatice pentru determinarea
substanțelor volatile din materialele biologice, dar metodele cromatografice se remarcă cu
siguranță prin o precizie mai mare. (6)
În mod normal, metode bazate pe cromatografie de lichide de înaltă performanță
(HPLC), metoda enzimatică, spectrometria în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR),
cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă (GC-MS) și, de obicei,
cromatografia de gaze (GC) sunt cele mai utilizate metode pentru determinarea metanolului
(2)

2.1. Cromatografia de gaze (GC)

Cromatografia gazoasă este o metodă precisă și fiabilă pentru determinarea
alcoolilor cu greutate moleculară mică în sânge și alte lichide biologice și a devenit o
metodă de referință în toxicologia criminalistică și clinică. De-a lungul timpului au fost
folosite diferite tehnici de preparare a probelor, inclusiv injectarea directă, spațiul de cap
(headspace GC) static și dinamic sau injectarea spațiului de cap folosind microextracția în
fază solidă.”Headspace GC” este acum cea mai utilizată tehnică pentru detectarea
compușilor organici volatili în lichide biologice, în principal datorită capacității sale de a
detecta urme de lichide volatile fără necesitatea pregătirii complexe a probelor (3,7).
Metoda gaz cromatografică cu detector cu ionizare în flacără (FID) este
considerată „standard de aur” pentru determinarea cantitativă a metanolului din probele
biologice, în toxicologia clinică. Detecția concentrațiilor scăzute (< 0,1 g/L) de metanol în
sângele integral, este totuși însoțită de dificultăți de natură experimentală. (5)

2
Acidul formic este analizat în mod obișnuit după derivatizare cu metanol la formiat de metil
sau cu etanol la formiat de etil, în prezența unui acid. Există o lipsă de metode adecvate
pentru determinarea simultană a metanolului și a acidului formic. Măsurarea simultană a
acidului formic toxic împreună cu metanolul este de dorit atât pentru imbunătățirea
procesului clinic, cât și pentru un diagnostic corect. (3)
A fost realizat un studiu în care s-a încercat determinarea simultană, simplă și
rapidă a metanolului și acidului formic din probe biologice.prin headspace GC cu detectie
cu ionizare în flacără. Această abordare este potrivită pentru monitorizare tuturor
concentraţiile de analit într-o singură măsurătoare în timpul terapiei cu antidot (etanol) sau
al tratamentului prin hemodializă. Timpul complet de pregătire a probei a fost scurtat la
aproape 6 minute, iar rezultatele cantitative au fost disponibile în 30 de minute, ceea ce
corespunde cu timpul necesar administrării medicației de urgență. Pentru analiză au fost
utilizate probe de sânge integral și urină. Sângele integral a fost centrifugat la 10.000 rpm
timp de 30 s pentru a se obține proba de ser pentru analiză, urina a fost folosită fără nici un
pretratament.Probele au fost incubate în cuptor timp de 5 minute la 80 °C fără agitare.
Injectarea în spațiul de cap a fost efectuată cu o seringă etanșă de 2,5 ml care a fost încălzită
la 110 °C. Limita de detecție și de cuantificare au fost stabilite la 50 mg/L. În probele
biologice, ser și urină au fost adăugate un grup de substanțe organice volatile pentru
verificare selectivității acestei metode. A fost demonstrat că analiții adăugați nu prezintă
nicio interferență cu metanolul sau cu acidul formic. În timpul analizei s-au utilizat două
coloane capilare paralele diferite, cu diferite faze staționare, pentru confirmarea analiților
selectați. Metoda s-a dovedit a fi suficient de selectivă pentru a diferenția și a cuantifica în
mod fiabil metanolul și acidul formic.(3)
Alte studii realizate pe lichide biologice precum sange, urină sau salivă au arătat
că, pentru analiza metanolului, urina conduce la rezultatele cele mai precise la concentrații
medii de metanol, spre deosebire de sânge. O precizie ridicată s-a obținut și pentru salivă.
Având un conținut bogat de proteine, sângele are cu siguranță cea mai puternică matrice,
afectând substanța volatilă care urmează să fie analizată în sistemul headspace-GC. Un alt
dezavantaj al metodei apare din cauza greutății moleculare scăzute și a punctului de fierbere
scăzut (65 °C) al metanolului ceea ce determină suprapunerea timpului de retenţie cu alţi
compuşi organici volatili care apar la începutul analizei(6).

2.2. Spectrometria în infraroșu (IR)

Metodele bazate pe spectroscopie în infraroșu sunt foarte utile pentru analiza
metanolului datorită versatilității acestora, eficienței și rentabilității, precum și datorită
rapidității și a faptului ca sunt neinvazive. Deoarece spectrometria IR oferă informații
specifice ale profilurilor moleculare, corespunzătoare anumitor grupuri funcționale metoda
este fiabilă pentru detecția rapidă a metanolului. (8,9)

2.3. Cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă (GC-MS)

Analiza prin cromatografie gazoasă cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS) ar
putea fi o alternativă posibilă pentru detecția metanolului. Cu toate acestea, greutatea
moleculară a metanolului este similară cu cea a oxigenului, iar “sângerarea” coloanei poate
3
apărea din cauza umidității din volumul injectat de probă. Pentru a rezolva acest dezavantaj
metanolul poate fi derivatizat în probă și analizat folosind GC-MS. Tehnici convenționale
de pretratament pentru analiza instrumentală includ metode de extracție cu solvenți, cum ar
fi extracția lichid-lichid și extracția în fază solidă.
Analiza (GC-MS) permite identificarea substanțelor chimice prin interpretarea
spectrului de masă (4,10). Pentru analiză poate fi utilizat un cromatograf de gaze prevăzut
cu injector automat cuplat cu un spectrometru de masă. Faza mobilă, heliul, se utilizează cu
un debit de 1 mL/minut, iar drept fază staţionară se pot utiliza diverse coloane
cromatografice. Într-un studiu realizat pentru determinarea metanolului prin GC-MS
probele de sânge și fragmentele de organe au fost prelucrate prin distilarea unei cantităţi de
5 ml sânge sau 5 g ţesut cu un volum de 45 ml acid succinic 5%, obținându-se un volum de
25 mL distilat. Apoi, distiatul obţinut s-a concentrat prin redistilare la un volum de 15 mL
distilat. S-a injectat un volum de 0,1 μl distilat cu o rată de splitare 1/50. Temperatura în
compartimentul coloanei a fost menţinută constantă timp de 20 minute la 50 C, apoi
temperatura a crescut cu 10 C/min până la 250 C unde a fost menţinută constantă încă 5
minute. După înregistrarea spectrelor de masă, metanolul a fost identificat prin compararea
timpilor de retenţie ai picurilor corespunzătoare din cromatogramele distilatelor, respectiv
cromatograma unei probe etalon ce conţinea metanol (10).

2.4 Cromatografie de lichide de înaltă performanță (HPLC)

Metoda HPLC are un avantaj față de alte metode, deoarece se poate folosi apă
pură ca faza mobila. Folosind această metodă, a fost elucidată distribuția metanolului în
țesut. Metoda HPLC poate fi utilizată și pentru analiza probelor biologice post-mortem
precum: plămâni, ficat, splină, rinichi, creier și inimă omogenate, sânge, urină și conținutul
gastric în cazuri de intoxicație cu metanol. Într-o analiza efectuată pe probe de țesuturi,
post-mortem, sa observat că, concentrația de metanol este în ordinea: urină > sânge >
conținut gastric > ficat > rinichi > inimă > creier (11).

3. Concluzii
Intoxicaţiile metanolice se produc în mod frecvent prin confuzie cu alcoolul etilic,
sau prin consumul de băuturi alcoolice ce au o concentraţie metanolică peste limita admisă
(1g/100 mL etanol anhidru). Metanolul se metabolizează prin oxidare în ficat sub acţiunea
alcool dehidrogenazei, în formaldehidă (lent) şi respectiv la acid formic (rapid) şi metil
formiat. Simptomele caracteristice intoxicaţiilor metanolice sunt tulburările de vedere care
apar la 10–15 ore de la ingestie şi acidoza metabolică (10).
Analiza sângelui prin cromatografia gazoasă “headspace“, cu detecție cu ionizare
în flacără (GC-FID) este o analiză de rutină efectuată în laboratoarele criminalistice pentru
determinarea intoxicației cu metanol. Diagnosticul precoce este esențial pentru tratamentul
cu succes al intoxicației (7).
Cu toate acestea, timpul de retenție al metanolului se poate suprapune cu al altor
compuși volatili ceea ce poate duce la confuzie. Analiza alternativă a metanolului folosind
cromatografie gazoasă/spectrometrie de masă are, de asemenea, limitări datorită greutății
sale moleculare similare cu oxigenul și punctul de fierbere scăzut. (4,10)
4
4. Bibliografie
1. Kang CW, Kim H, Shin K, Ryu J, Jung-Choi K, Lim KH, Kim J-H. Toxic Effects of Methanol among
Illegally Dispatched Workers at Aluminum CNC Cutting Process in Small-Scale, Third-Tier Subcontractor
Factories of Smartphone Manufacturers in the Republic of Korea. Int. J. Environ. Res. Public Heal.
2018Jun.25;15(7):1332. doi: 10.3390/ijerph15071332
2. Saadat F, Rafizadeh A. Rapid determination of methanol in herbaceous distillates for their safety evaluation
by a new modified chromotropic acid method. Vols. 18, Iran J Pharm Res. 2019. pp. 696–703. doi:
10.22037/IJPR.2019.1100661
3. Bursová M, Hložek T, Čabala R. Simultaneous Determination of Methanol, Ethanol and Formic Acid in
Serum and Urine by Headspace GC-FID. J. Anal. Toxicol. 2015Jul.14;39(9):741–745. doi:
10.1093/jat/bkv075
4. Lee J-B, Jeong YA, Ahn DJ, Bang IS. SPME-GC/MS Analysis of Methanol in Biospecimen by
Derivatization with Pyran Compound. Mol. 2019Dec.20;25(1):41. doi: 10.3390/molecules25010041
5. Bonchev GD, Zlateva SZ, Yovcheva MI. Toxicological Chemical Analysis of Methanol in Blood of
Patients with Acute Ethanol Intoxication for Determining Detectable Quantities of Methanol and Analysis of
the Correlation Between Ingested Alcohol. J. Biomed. Clin. Res. 2016Sep.1;9(1):48–54. doi: 10.1515/jbcr-
2016-0007
6. Görkem Mergen, Emrah Dural, Vugar Aliyev, Tülin Söylemezoglu, Zeliha Kayaalti, Serap Yalçin, Seda
Kaya . Simultaneous Headspace-GC–FID Analysis for Methanol and Ethanol in Blood, Saliva and Urine:
Validation of Method and Comparison of Specimens. CGC Europe-06-01-2011. 2011;6:292–298.
7. Westland JL, Dorman F. Comparison of SPME and static headspace analysis of blood alcohol
concentration utilizing two novel chromatographic stationary phases. Forensic Sci. Int.
2013Sep.1;231(1):e50–e56. doi: 10.1016/j.forsciint.2013.05.007
8. Anjos O, Dos Santos AA, Estevinho MLMF, Caldeira I. FTIR–ATR spectroscopy applied to quality control
of grape-derived spirits. Food Chem. 2016Aug.1;205:28–35. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.02.128
9. Xia Q, Yuan L-M, Chen X, Meng L, Huang G. Analysis of Methanol Gasoline by ATR-FT-IR
Spectroscopy. Appl. Sci. 2019Dec.6;9(24):5336. doi: 10.3390/app9245336
10. Doina Moaleş, A. F. Şpac, Carmen Gavriliu, M. Bădără, Dorina Iftimie, Elena Butnaru
DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI METANOLULUI PRIN GC-MS ÎNTR-UN CAZ DE
INTOXICAŢIE LETALĂ. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi – 2011 – vol. 115, nr. 4.
11. Sharma V, Jadhav R, Rao G, Saraf A, Chandra H. High performance liquid chromatographic
determination of alcohols with reference to body distribution of methanol. Forensic Sci. Int.
1991Sep.30;50(2):255–261. doi: 10.1016/0379-0738(91)90156-d