GC - introducere

Clasificarea tehnicilor cromatografice

c.p. c.a.
c.p. c.a. c.p. c.a.

c.a. - cromatografie de adsorbţie

c.p. - cromatografie de partiţie p.2 - Bazele teoretice ale cromatografiei
Absorbţia şi adsorbţia ...

ABsorbţie ADsorbţie

p.3 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 Distribuţia concentraţiei solutului în
faza mobilă şi faza staţionară
direcţia de curgere

Faza mobilă
profilul concentraţiei
transfer din faza solutului în faza mobilă
staţionară
în faza mobilă

profilul concentraţiei
solutului în faza
staţionară
transfer din faza
mobilă
în faza staţionară

Faza staţionară p.4 - Bazele teoretice ale cromatografiei

intensitate
Timp de retenţie şi ordine de eluţie

octan nonan
Injecţie pic 1

timp

p.5 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 Forma picului cromatografic

Concentraţie
distanţă
Răspunsul detectorului

tr

punct de inflexiune

injecţie timp sau volum

p.6 - Bazele teoretice ale cromatografiei
Schema procesului cromatografic
direcţia de curgere a f.m. detector cromatogramă

timp

coloana cromatografică p.7 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 Lărgirea zonei cu probă

coloană

start

p.8 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă
- echilibrul interfazic -
faza mobilă direcţie de eluţie

faza staţionară

zona cu probă la intrare în coloană

faza mobilă

faza staţionară

zona cu probă în coloană, la un timp oarecare de eluţie

p.9 - Bazele teoretice ale cromatografiei
Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă
- difuziune longitudinală -

zona cu probă la scurt timp după intrarea în coloană

difuziune longitudinală

zona cu probă după un timp mai îndelungat de eluţie

direcţie de eluţie

p.10 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă
- difuziune structurală -

timp

p.11 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factori ce duc la lărgirea zonei cu probă
- difuziune transversală -
zona cu probă la intrare în coloană

direcţie de eluţie

zona cu probă în coloană, la un timp oarecare de eluţie

p.12 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Factor de separare şi factor de capacitate

retenţia relativă sau factorul de separare (pentru compuşii 1 şi 2)

 = (tr2’/tr1’) = k2’/k1’ = K2/K1

factorul de capacitate

k’ = (tr – tm)/tm= CsVs / CmVm= K (Vs/Vm)

(raportul între timpul petrecut de un component în f.m. respectiv f.s.)

coeficientul de partiţie
K = Cs/Cm

p.13 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 Numărul de talere teoretice şi
înălţimea echivalentă a talerului

Numărul de talere teoretice (N)

tR – timpul de retenţie
wh – lăţimea picului la ½ din înălţime

Înălţimea echivalentă a talerului teoretic (H)

L – lungimea coloanei

p.14 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 2((tR)y - (tR)x)
Rezoluţia Rs = -----------------
Wx + W y

rezoluţie rezoluţie

intensitate
intensitate

0.5 0.75

rezoluţie
intensitate

intensitate
1.0 rezoluţie
1.5

timp timp

p.15 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Compararea rezoluţiei
la diverse concentraţii

p.16 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Izoterma de adsorbţie

p.17 - Bazele teoretice ale cromatografiei

Picuri cromatografice asimetrice

2
41.7(t r / w0 .1 )
N
A / B  1.25

p.18 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 E c u a ţ i a Van D e e m t e r

B
H  A  C x
x

Unde A, B, C sunt contribuţii din:

A difuziune structurală
B difuziune longitudinală
C timp de echilibrare

ux debitul liniar

p.19 - Bazele teoretice ale cromatografiei

 E c u a ţ i a Van D e e m t e r

B
H  A  C x
x

Unde A, B, C sunt contribuţii din:

A difuziune structurală
B difuziune longitudinală
C timp de echilibrare

ux debitul liniar

p.20 - Bazele teoretice ale cromatografiei

C u r b e l e Van D e e m t e r

p.21 - Condiţii de analiză GC-MS

F a z a m o b i l ă - c u r b e l e Van D e e m t e r
pentruH2, He şi N2

Debite recomandate (ml / min):

Diametru interior Hidrogen Heliu

0.10 mm 1.0 0.5
0.25 mm 2.5 1.3
0.32 mm 3.2 1.9
0.53 mm 5.3 4.2

p.22 - Descrierea părţilor componente ale GC

C u r b e l e Van D e e m t e r

p.23 - Condiţii de analiză GC-MS

Efectul vitezei fazei mobile

Viteză mare >> scăderea R

p.24 - Condiţii de analiză GC-MS

 Separarea gaz - cromatografică
Injector

Detector
Cromatograf

Coloană
cromatografică
Calculator sau
Gaz purtător “Cuptor” înregistrator

Proba: amestec A+B+C+D+E

E A
Cromatogramă

B E
D
A C

B
C
Intensita
te

??? - volatilitate
D
??? - punct de fierbere
??? - masă moleculară 0 5 10
Timp (minute)
15 20

??? - polaritate
??? - matrice, solvent, stabilitate termică, alţi factori.
p.25 - Principiul determinării gaz-cromatografice
Faza mobilă – cerinţe de puritate

p.26 - Descrierea părţilor componente ale GC

Faza mobilă – cerinţe de puritate

p.27 - Descrierea părţilor componente ale GC

Dispozitive de măsurare şi reglare a debitului

p.28 - Descrierea părţilor componente ale GC

 Coloane cromatografice

solut adsorbit la
suprafaţa fazei
Convenţionale staţionare

peretele coloanei
capilare
Capilare

solut dizolvat
în faza staţionară
depusă pe peretele
capilarei

p.29 - Descrierea părţilor componente ale GC

 Nume comercial Suprafaţa Diametrul porilor
Tip adsorbant specifică (nm)
(m2/g)
Silice Spherosil XOA 400 300 – 500 8
Spherosil XOA 200 140 - 230 15
Spherosil XOB 075 75 – 125 30
Spherosil XOB 030 37 – 62 60
Spherosil XOB 015 18 - 31 125
Spherosil XOC 005 5 -15 300
Porasil B 125 – 250 10 – 20
Porasil C 50 - 100 20 - 40
C grafitizat Carbopack B 100 -
Carbopack C 12 -
Carbosieve 1000 1,3
Spherocarb 1200 1,5
Polimeri Chromosorb 101 (răşini < 50 300 - 400
poroşi poliaromatice)
Porapak P sau Q > 500 7,5
(copolimeri ai stirenului
cu etilvinilbenzen)
 Polaritatea coloanelor cromatografice
Me
Si O 100 % metil (HP-1, DB-1 etc.) Nepolară
Me n

Ph Me
5% fenil (HP-5, DB-5, etc.) Nepolară
O Si O Si O 35% fenil (HP-35, DB-35, etc.) Polaritate medie
Ph Me 50% fenil (HP-50+, DB-17, etc.) Polaritate medie
m n

R Me
6% cianopropilfenil (HP-1301, DB-1301, etc.) Polaritate medie
O Si O Si O 14% cianopropilfenil (HP-1701, DB-1701etc.) Polaritate medie
R' m Me 50% cianopropilfenil (HP-225, DB-225, etc.)
n Polaritate mare

H H
HO - - C-C-O- -H 100% PEG (HP-WAX) Polară

H H
p.31 - Descrierea părţilor componente ale GC
Polaritatea coloanelor cromatografice

HP-17: 50% fenil şi 50% metil siloxan

comparativ cu
HP-50+ : (50%)-Difenil (50%)-Dimetilpolisiloxan

CH3

Si O Si O Si O
CH3 m n CH3 n

! coloanele sunt diferite !

p.32 - Descrierea părţilor componente ale GC

Polaritatea coloanelor cromatografice
C10 C12
Hexanol
100% Metil
(nepolar)

0 2 4 6 8
condiţii identice la GC
coloane de dimensiuni identice
C10 C12 fază staţionară diferită

Hexanol 100% PEG

(polar)

0 2 4 6 8

p.33 - Descrierea părţilor componente ale GC

Ordinea de eluţie şi punctele de fierbere

p.34 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice

● faza staţionară
● diametrul interior
● lungimea
● grosimea filmului
p.35 - Descrierea părţilor componente ale GC
Caracteristicile coloanelor cromatografice
- diametrul interior -

80°C izoterm
21.81
0.25 mm
0 5 10 15 20

16.06 0.32 mm
0 2 4 6 8 10 12 14 16

Timpul de retenţie este invers proporţional cu diametrul interior

p.36 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice
- diametrul interior -

n =58,700 n =107,250

0.53 mm 0.32 mm
capacitate pentru probă : < 2 ug < 500 ng

p.37 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice
- lungimea coloanei -

Lungime (m) N
15 71,430
30 142,860
60 285,720

0.25 mm ID
N/m = 4762

p.38 - Descrierea părţilor componente ale GC

Caracteristicile coloanelor cromatografice
- lungimea coloanei -

R=0.84 R=1.16 R=1.68

2.29 min 4.82 min 8.73 min

15 m 30 m 60 m

p.39 - Descrierea părţilor componente ale GC

 Caracteristicile coloanelor cromatografice
- grosimea filmului -
7.00
grosimea mai mare 0.25 µm
a filmului conduce la 0 2 4 6 8
timpi de retenţie
mai mari
25.00
1.00 µm
0 5 10 15 20 25

grosimea mai mare a filmului

conduce la pierderi de f.s. mai mari
p.40 - Descrierea părţilor componente ale GC
Caracteristicile coloanelor cromatografice
- grosimea filmului -

formarea produşilor siloxanici de degradare H3C CH3

Si
HO O
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
Si O Si O Si O Si O Si Si
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH O
CH3 CH3
Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si OH 3
CH3
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3

Si O Si O Si O Si OH
CH3 CH3 CH3 CH3 + H3C CH3
O
Si
O
H3C Si Si CH3
O CH
H3C 3

Reacţia se repetă

p.41 - Descrierea părţilor componente ale GC

Efectul grosimii filmului

p.42 - Condiţii de analiză GC-MS

p.43 - Condiţii de analiză GC-MS
Operarea în regim programat de
temperatură
Sistemele de injecţie neselective pentru cromatografia de gaze (cu transferul
integral, sub aspect calitativ şi cantitativ, al probei către coloana
cromatografică):

i) Injectoare fără divizarea fluxului de fază mobilă („splitless”);

ii) Injectoare cu injecţie direct în coloană, la rece („cool-on-column”);
iii) Injectoare de tip valvă rotativă pentru gaze sau lichide;
iv) Injectoare de tip diafragmă pentru probe lichide.

Sistemele de injecţie selective utilizate în cromatografia de gaze sunt:

i) Injectoare cu divizarea fluxului de fază mobilă („split”);

ii) Injectoare cu şi fără divizarea fluxului de fază mobilă („split / splitless”);
iii) Injectoare de tip „head space”;
iv) Injecţie de tip „purge and trap”;
v) Injecţie cu piroliză (pirolizoare);
vi) Injectoare cu programare de temperatură („program temperature vaporizer” - PTV).
 INJECTOARE Sisteme de introducere a probei
● clasice
● cu splitare
● split-splitless
● on column
● P T V, a l t e t i p u r i

PTV

On column Split-splitless
p.46 - Descrierea părţilor componente ale GC
 Sisteme de introducere a probei
specifice analizei gazelor

p.47 - Descrierea părţilor componente ale GC

Injectoare - avantajele
injecţiei split-splitless

p.48 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sisteme automate de introducere a probei

p.49 - Descrierea părţilor componente ale GC

 Sistemul headspace

Sistem static

Sistem dinamic

p.50 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace cu compensare de presiune

p.51 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace

inj.lichid

Headspace

p.52 - Descrierea părţilor componente ale GC

Sistemul headspace

1 ml 5 ml 5 ml + NaCl
sol.apoasă ciclohexan + dioxan

Influenţa volumului de probă şi a adaosului

de NaCl asupra senzitivităţii
Influenţa temperaturii asupra senzitivităţii p.53 - Descrierea părţilor componente ale GC
 Detectori

Distructivi
• Spectrometru de masă (CI/EI)
• Ionizare în flacără (FID)
• Pentru azot şi fosfor (NPD)
• Flame - fotometric (FPD)
• Emisie atomică (AED)
• ICP, ICP-MS

p.54 - Descrierea părţilor componente ale GC

Detectori distructivi

FPD
FID

NPD AED
p.55 - Descrierea părţilor componente ale GC
Detectori

Nedistructivi
• Conductivitate termică (TCD)
• Captură de electroni (ECD)
• Fotoionizare (PID)
• Infraroşu (FT-IR)
• RMN

p.56 - Descrierea părţilor componente ale GC

 Detectori nedistructivi

TCD

PID

ECD
p.57 - Descrierea părţilor componente ale GC
Cromatograme cu detectori diferiţi

p.58 - Descrierea părţilor componente ale GC

Nivel de zgomot, drift şi bleeding
în cromatogramă
 Picuri incomplet separate prin GC

p.60 - Condiţii de analiză GC-MS

 Identificarea
componenţilor
pentru picuri
incomplet separate
prin GC

p.61 - Condiţii de analiză GC-MS

Soluţii hardware pentru separare incompletă

p.62 - Condiţii de analiză GC-MS

● Stabilirea condiţiilor de analiză pentru GC Stabilirea condiţiilor
● Condiţii la injector de analiză
● Debitul de gaz purtător
● debit mare – viteză de eluţie mare >> pierdere de rezoluţie
● debit mic – creşterea rezoluţiei >> creşterea timpului de retenţie
● Volumul de injecţie – volum mare >> poate duce la depăşirea capacităţii
coloanei pentru probă, volum mic >> senzitivitate scăzută
● Temperatura
● temperatură mare – mobilitate mare, vaporizare rapidă
>> potenţial de degradare a compuşilor în injector
● temperatură mică – depunerea compuşilor grei >> contaminare
● Condiţii la coloană – prin optimizare în funcţie de natura probei
● Condiţii la detector – temperatură acoperitoare pentru evitarea condensării compuşilor grei
● Stabilirea condiţiilor de analiză pentru injectorul SSL
● Temperatură acoperitoare (20-30 grade peste punctul de fierbere al celui mai greu compus)
● Operare split – rată de splitare mai mare de 1:20, gas saver pentru economisire He
● Operare split - splitless – timp de splisless 0.5 – 1 ml/min, debit de purjare mare (> 50 ml/min)
 Vapoare optimă Explicaţii

Temperatura injectorului 200 - 280°C - asigură volatilizarea instantanee; -reduce efectul de degradare.
Observaţie: de folosit valori mai mari în cazul probelor cu efect
puternic de matrice şi analiţi cu p.f. ridicate

Volumul tubului de > 0,8 mL în cazul injecţiei automate

vaporizare

< 0,7 mL în cazul injecţiei manuale

Tipul tubului de fără umplutură numai în cazul injecţiei manuale

vaporizare

cu vată de sticlă silanizată pentru autoinjecţie, probe cu efect de matrice pronunţat

Volumul injectat 0,5 -3 μL

Debit în circuitul de 20 - 50 mL/min nu e un parametru critic

purjare a vaporilor

Timpul de splitare 20 - 80 sec în funcţie de natura probei

Temperatura internă a p.f.solv.= 25°C în cazul focusării prin solvent

coloane

Debitul gazului purtător > 2 mL/min Parametru

prin coloană

Debitul de gaz purtător 1 - 5 mL/min

utilizat la purjarea
septumului
Spectrometria de masă
Importanţa MS
în analiza
structurală
 Cuplajul GC-MS - compatibilitate
● Faza mobilă în stare gazoasă, mobilitate mare  eliminare uşoară prin
sistemul de vid, interfernţă minimă cu proba
● Sistem simplu pentru linia de transfer – este necesară numai termostatarea
● Transfer al probei în fază gazoasă, cu puritate avansată
● Limitare la capabilitatea de separare a metodei GC
● Permite obţinerea ionilor moleculari cu energie ridicată (nu este necesară o ionizare
suplimentară cum ar fi la HPLC-MS pentru fragmentarea ionului molecular) – viteze
mari de scanare în full scan
● Precauţii
● Limitele de temperatură la linia de transfer – minim 20oC sub limita
specificată pentru coloană
● Calitatea coloanei – impurificare cu siloxani
● Exploatarea incorectă a coloanei – impurificare cu siloxani
● Probe cu impurităţi nevolatile cu masă mare (ex.trigliceride) – impurificare
● Debitul incorect al fazei mobile – depăşirea capacităţii pompei de vid înalt
● Volumul incorect de injecţie – contaminarea sursei p.67 - Compatibilitatea GC-MS
● Stabilirea condiţiilor de analiză pentru GC Stabilirea condiţiilor
● Condiţii la injector de analiză
● Debitul de gaz purtător
● debit mare – viteză de eluţie mare >> pierdere de rezoluţie
● debit mic – creşterea rezoluţiei >> creşterea timpului de retenţie
● Volumul de injecţie – volum mare >> poate duce la depăşirea capacităţii
coloanei pentru probă, volum mic >> senzitivitate scăzută
● Temperatura
● temperatură mare – mobilitate mare, vaporizare rapidă
>> potenţial de degradare a compuşilor în injector
● temperatură mică – depunerea compuşilor grei >> contaminare
● Condiţii la coloană – prin optimizare în funcţie de natura probei
● Condiţii la linia de transfer – în mod curent o valoare acoperitoare
● Stabilirea condiţiilor de analiză pentru MS
● Domeniul de masă suficient de mare – domeniu mare >> viteză mică de achiziţie mică
● Threshold – acoperitor pentru integrarea picurilor mici
● Viteza de achiziţie – acoperitoare pentru forma picului cromatografic
p.68 - Condiţii de analiză GC-MS
 Schema spectrometrului de masă
Introducerea probei Ieşirea datelor

Intrare
Achiziţia de
date

Sursa de ioni
Separator de
(camera de Detector
ioni
ionizare)

Pompe de
vid
 Sistemul de vid al spectrometrului MS
Presiune (Torr) Drum liber mijlociu (meters)
760 6.0x10-8
1 4.5x10-5
10-3 4.5x10-2
10-5 4.5x10
10-7 4.5x102
10-9 4.5x104

Pompe de vid preliminar Pompă de difuzie Pompă turbomoleculară

ex.”rotary-vane”
Introducerea probei prin termodesorbţie
 O C H3
Introducerea probei
H3C
N
C
C
N prin sistem cromatografic
CH
C C
O N
H
N informaţie obţinută :
(~1 nanogram) Spectrometru ● masa moleculară
de masă
compus pur separat ● distribuţia
cromatografic
izotopică
● fragmentarea

ionului molecular
194
Mass Spectrum

Cromatograf
GC, HPLC, etc
67 109
Abundance

55
82
E A
42

D 94 136 165

B 40 60 80 100 120 140 160 180 200

C Mass (amu)
Proba: amestec A+B+C+D+E
Linia de transfer GC
 Linia de transfer GC

Linia de transfer

Sistemul quick-swap pentru schimbarea coloanei fără vent

Introducerea probei prin ESI, TS, APCI,
plasmaspray, nanospray
Introducerea probei prin ICP

Exemple de cuplaje posibile:

- GC-ICP-MS
- HPLC-ICP-MS
- LA-ICP-MS
Exemple de metode de ionizare a probei
Schema camerei de ionizare clasice (EI)

Colector pentru electroni Electrod de

focalizare

Ioni pozitivi
+
Repeller Molecule
neutre
Inlet
+ __
+ + + + + +
+
ioni către
separator
e- e- e- ul
_ Electroni magnetic

Filament Electrod
accelerare

+
Specii formate la ionizarea EI
Ionizarea chimică CI
Alura spectrelor în EI respectiv CI pentru efedrină

EI

CI
 Ionizarea prin electrospray ESI

Alura spectrelor în EI respectiv ESI

pentru amfetamină
Ionizarea prin desorbţie

Spectrul FD pentru polistiren

 EI

Alura spectrelor
în EI respectiv FI
(field ionization)

FI
 Ionizarea prin bombardament cu
a t o m i r a p i z i ( FAB )

S p e c t r u l p o l i e t i l e n g l i c o l u l u i p r i n FAB
Ionizarea prin desorbţie asistată laser
din matrice (MALDI)

Spectrul polistirenului prin MALDI

 Schema separatorului de ioni
cu sector magnetic

traiectoria în
domeniu

traiectorie în afara
domeniului
(ioni prea uşori)

Detector
Sursa de
ioni
N traiectorie în afara
domeniului
Electromagnet (ioni prea grei)
 Schema separatorului de ioni
cu sector magnetic cu dublă focalizare
Geometrii cu focalizare
dublă şi triplă
Schema separatorului de ioni
cu filtru quadrupolic
ion resonant

ion nerezonant

_
Detector
+

+
_

Sursa de
ioni

Tensiune
continuă
şi alternativă
 Schema separatorului de ioni
cu trapă ionică, nanotehnologii
Schema separatorului de ioni
cu timp de zbor (TOF)
Separarea ionilor – TOF
Schema separatorului de ioni
orbitrap
Schema separatorului de ioni
cu rezonanţă ciclotronică

Spectru ESI Q-FT-ICR

Schema cuplajului MS - MS
Var i a n t e d e c u p l a j M S - M S
Detectorul multiplicator de electroni

microcanal
dinodă
Detectorul multiplicator de fotoni
Rezoluţia spectrală
Rezoluţia spectrală MS
 Mecanismul ionizării probei
M + e- M+. + 2e-
M+.

unde M+. => ionul molecular

Ioni moleculari formaţi în EI:

M+.
(M+1)+. (M+1)+.

(M+2)+.
...
Abundenţa picurilor izotopice
C10H14
13
C 10 * 1.11% = 11.1%
2
H 14 * 0.015% = 0.21%
-------
135
pic / 34pic 11.31%
Distribuţia izotopică naturală
Analiza izotopică
Determinarea formulei moleculare
Alura picurilor moleculare pentru
compuşi cu Cl sau Br
Spectrometrul IR-MS pentru
analiză izotopică
 Spectrometrul IR-MS pentru
analiză izotopică

Unităţile de măsură utilizate:

● As – abundenţa izotopului greu (n2): As = Rs / (1 + Rs) x 100 [% atom]
unde Rs = n2 / n1
● APE (atom percent excess): APE = As – Astd
unde Astd este valoarea standard
● notaţia  utilizează raportarea la mie:  = ((Rs – Rstd) / Rstd) x 1000 [‰]
std - PDB – carbonul conţinut în carbonatul de calciu din Peedee – Carolina de sud
(de origine marină, din Belemnitella americana)
 Spectrometrul IR-MS pentru
analiză izotopică (ex.provenienţa heroinei)
 Evidenţierea fragmentărilor specifice pe
baza distribuţiei izotopice pentru Cl sau Br
 Regula azotului

• compuşii organici cu număr par de atomi de

N în moleculă au masa moleculară pară,
compuşii cu număr impar de atomi de N au
masa moleculară impară

• ionii OE respectă regula azotului

• ionii EE respectă regula azotului inversată

Picul molecular şi picul de bază
- tetrahidrocanabinol -
PB
PM
Dificultăţi în
atribuirea
spectrelor
Utilizarea bibliotecilor de spectre
Dificultăţi la căutarea în bibliotecă
- spectru MDMA -
Energii relative ale orbitalilor moleculari
în compuşi organici
Formarea ionului molecular în funcţie
de localizarea electronului expulzat
Energii de ionizare pentru
molecule şi radicali (în eV)
Tipuri de fragmentări
Diagrama energetică a fragmentării
Diagrama energetică a fragmentării
exemplificare
Tipuri curente de pierderi de
fragmente neutre
Pierderi de molecule neutre