Cromatografia de lichide pe coloană deschisă

Etapele realizării unei analize cromatografice utilizând cromatografia de lichide pe coloană

deschisă sunt:

1. Pregătirea probelor
 Probele vor fi obținute prin extracția cu solvenți potriviți, conform procedurii
recomandate pentru extracția compușilor respectivi
 Pentru a putea fi analizate, probele pot fi în stare solidă, lichidă sau solubilizate
într-un solvent potrivit, chiar în solventul utilizat ca fază mobilă dacă este posibil;
2. Materiale necesare
 Coloană de separare: tuburi de sticlă cu diverse lungimi și diametre, prevăzute la
partea inferioară cu robinet (pentru a controla viteza de curgere a fazei mobile
prin faza staționară) sau pompă de vid (pentru a mări viteza de curgere a fazei
mobile prin faza staționară, numită cromatografie flash)
 Faza staționară: silicagel, oxid de aluminiu, amidon, carbonat de calciu etc. sub
formă granulară
 Faza mobilă: un solvent sau amestecuri ex. diclorometan, acetonitril,
butanol:amoniac 4:1, ciclohexan: acetat de etil 3:2.
 Alte materiale: vată, nisip, eprubete/pahare pentru colectarea fracțiilor,
materiale specifice cromatografiei pe strat subțire (cameră de developare, fază
mobilă, fază staționară, foarfece, creion, riglă, tuburi capilare, sistem de uscare,
reactivi pentru revelare, lampă UV)
3. Pregătirea coloanei de separare
 Unele coloane sunt prevăzute cu frite (filtre din sticlă sinterizată) pentru a nu
avea pierderi de fază staționară în timpul eluției; alternativ, se fixează o bucățică
de vată la partea inferioară a coloanei, cu ajutorul unei baghete de sticlă;
 Se poate realiza o umplere umedă (se adaugă faza staționară amestecată în
prealabil cu faza mobilă – utilizată pentru faze staționare cu diametru mai mare a
particulelor: faza staționară, aflată în suspensie, va sedimenta uniform, putându-
se elimina mai ușor eventualele goluri de aer ce ar putea influența separarea)
sau o umplere uscată (faza staționară se introduce direct în coloană, având grijă
ca particulele să fie distribuite uniform); peste faza staționară se depune un strat
de nisip, pentru a proteja de distorsiuni ce pot apărea la adăugarea fazei mobile
4. Aplicarea probelor
 Probele solide se introduc având grijă ca pudra să formeze un strat uniform, cu
aceeași grosime de jur-împrejurul coloanei
  Probele lichide se introduc cu ajutorul unei pipete, asigurând de asemenea
distribuția uniformă
5. Developarea
 Faza mobilă se va introduce continuu, de la debutul analizei până la final, fără a
permite uscarea fazei staționare
 În scop preparativ, se vor colecta fracții ale compușilor separați, în pahare sau,
ideal, în eprubete; eprubetele umplute se colectează în ordinea eluției
6. Interpretarea rezultatelor
 Prin sondaj, se vor face cromatograme pe strat subțire ale eprubetelor, pentru a
monitoriza separarea compușilor; eprubetele ce conțin același compus se vor
combina, obținându-se compușii separați după evaporarea solventului utilizat ca
fază mobilă

Aplicații – separarea și dozarea pigmenților carotenoidici prin cromatografie pe

coloană deschisă și spectrofotometrie

Scopul lucrării: extracția și separarea pigmenților carotenoidici din materiale vegetale prin
metode cromatografice; dozarea pigmenților carotenoidici prin spectrofotometrie

Probe: materiale vegetale (morcov, pătrunjel, urzici etc.) uscate în prealabil la etuvă
Alte materiale necesare: mojar cu pistil, pâlnie, pompă de vid, spectrofotometru UV-Vis
Modul de lucru:
 Extracția: se cântărește aproximativ 1 g material vegetal și se mojarează cu nisip;
se adaugă în porțiuni un amestec de eter de petrol:benzen 1:1 (10 mL)
 Separarea: se pregărește o coloană de separare, umplută uscat cu oxid de
aluminiu, precum și faza mobilă (eter de petrol:benzen 1:1); cu ajutorul unei
pâlnii, se adaugă extractul lichid obținut; se pornește pompa de vid, montată la
vasul de colectare și se adaugă continuu fază mobilă până când eluentul este
incolor (faza mobilă antrenează doar pigmenții carotenoidici, în timp ce alți
compuși din amestec sunt reținuți de faza staționară);
 Dozarea: se măsoară volumul obținut; 2 mL sunt introduși în cuva unui
spectrofotometru, măsurându-se absorbanța probei la 450 nm; concentrația
probei necunoscute se va afla utilizând curba de calibrare:

A450 Concentrația de carotină (mg/L)

0,021 2
0,053 4
 0,075 6
0,096 8
0,117 10

Variația absorbanței în funcție de

concentrație
0.14

0.12

0.1

0.08

0.06

0.04 y = 0.011x + 0.001

0.02

0
0 2 4 6 8 10 12

 Dozarea: utilizând ecuația dreptei vom afla concentrația probei necunoscute (x),
înlocuind-ul pe y cu valoarea absorbanței probei; dacă absorbanța probei nu se
încadrează în curba de calibrare (0,021-0,117), se fac diluții și se notează factorul de
diluție; cantitatea de pigmenți carotenoidici din proba de analizat se va calcula astfel:

( )× × × 1000
㉠=

Unde:

C(x) – concentrația probei (determinată din curba de calibrare)

fD – factorul de diluție (ex. dacă am diluat 1:1, factorul de diluție va fi 2, dacă am diluat 1:9
factorul de diluție va fi 10 etc.)

V – volumul de eluent obținut

mp – masa de material vegetal utilizat ca probă