ANALIZA

MEDICAMENTULUI
NOTE DE CURS (3) Conf.dr. Cristina Adela Iuga
16-17.10.2017
 Cromatografia de lichide (LC)
2

 Liquid Chromatography (LC)/ Chromatographie liquide (CL)

 EPh 8.8 capitolul 2.2.29

 Definiţiile, modul de calcul al parametrilor şi cerinţele aplicabile în mod general

pentru verificarea sistemului cromatografic (system suitability)
 EPh 8.8 capitolul 2.2.46

 High performance liquid chromatography/ Ultra-high performance liquid

chromatography
 HPLC/UHPLC
 Ce este metoda HPLC ?
3

 Metoda cromatografică derivată din:

 cromatografiade lichide pe coloană (CLC) – din punct

de vedere al principiilor de separare

 gaz-cromatografie (G.C.) - din punct de vedere al

echipamentului de analiză
 Obiectivele cursului
4

 Cunoaşterea echipamentelor utilizate pentru analiză

 Cunoaşterea principiilor şi mecanismele separării în

cromatografia de lichide (LC)

 Evaluarea şi interpretarea informaţiilor oferite de

cromatogramă

 Aplicaţiile metodei în domeniul farmaceutic

 Cromatograful de lichide
5

Separarea se bazează pe migrarea

diferenţiată între faza staţionară
Injector şi faza mobilă.
Mixer

Faza mobilă – transportă proba

prin faza staţionară şi o
Pompe deplasează prin coloană.

Coloana Faza staţionară – faza

fixă din interiorul coloanei
(de ex.C18)

Detector

Reziduu
Solventi
 Cromatograful de lichide
6

Solvenţi Injector
Detector UV-VIS
Termostat
coloane

Autosampler
Software
specializat

Pompe, degazor Valvă comutare solvenţi

 Echipamentul cromatografic HPLC
7

 Sistemul de pompe  Coloane cromatografice

 Binare  Fază normală
 Ternare  Fază inversă
 Cuaternare  Ionice
 Chirale
 Sistemul de amestecare a solvenţilor  Speciale
 La joasă presiune
 La presiune înaltă  Detectori
 Refractometric
 Sistemul de injectare a probelor  UV – VIS
 Manual  Dual sau multi λ
 Automat  Photo Diode Array (PDA)
 Fluorescenţă
 Electrochimic
 Spectrometrul de masa
 Principiile şi mecanismele separării
8

 După natura interacţiunilor:

 Cromatografie de repartiţie (CLL)
 Faza staţionară lichidă/faza mobilă lichidă
 Cromatografie de adsorbţie (CSL)
 Faza staţionară solidă/faza mobilă lichidă

 După natura fazei staţionare solide:

 Cromatografie în fază normală NP-LC
 Cromatografie în fază inversă RP-LC
 Cromatografie de schimb ionic IEX-LC
 Cromatografie de excluziune moleculara SEC-LC
 Cromatografie de afinitate AC-LC
 Principiile şi mecanismele separarii
9

 Faza staţionară solidă

 NP- HPLC (clasic)
 faza staţionară polară - silicagel
 faza mobila nepolară – cloroform, clorura de metilen, 2-
propanol

 Compuşii polari sunt reţinuţi mai mult pe coloană şi eluaţi mai

târziu decât compuşii nepolari.

 Compuşi polari = hidrosolubili, hidrofilici;

 Principiile şi mecanismele separarii
10

 Faza staţionară solidă

 RP- HPLC
 faza staţionară nepolară – silicagel modificat
 faza mobila polară – apă, sisteme tampon, metanol,
acetonitril, tetrahidrofuran

 Compuşii nepolari sunt reţinuţi mai mult pe coloană şi eluaţi

mai târziu decât compuşii polari.

 Compuşi nepolari = liposolubili, hidrofobici;

 Faze mobile în HPLC
11

 Soluţii tampon
 Acetat (CH3COONa/CH3COOH)
 Fosfat (KH2PO4/K2HPO4/H3PO4)
 Solvenţi organici:
 Metanol
 Acetonitril
 Tetrahidrofuran
 Modificatori:
 Laurilsulfat de sodiu, hexansufonat de sodiu, etc.
 Clorură de tetrabutil amoniu etc.
 Faze staţionare în CL
12

 Silicagel, alumină, grafit poros - cromatografie în fază normală

 Polimeri, silicagel, grafit poros cu suprafaţă modificată –
cromatografie în fază inversă
 Raşini sau polimeri grefaţi cu grupări acide sau bazice (schimbători
de ioni)
 Silicagel poros sau polimeri – site moleculare pentru excluziune
sterică
 Faze staţionare speciale modificate chimic – derivaţi de celuloză
sau amiloză, proteine sau peptide, ciclodextrine - cromatografia
chirală
 Tipuri de faze staţionare
13

 C18 – Octadecil silane silica gel (ODS) –

 C8 – Octil silane silica gel (OS)
 C4 - Butil silane silica gel (BS)
 Fenil silane silica gel
 Silica gel
 Aminopropil silicagel
 Cianopropil silica gel
 Schimbători de cationi
 Schimbători de anioni
 Faze staţionare nepolare (RP)
14

 Timpul de retenţie a compuşilor nepolari pe coloană creşte

proporţional cu lungimea lanţului hidrocarbonat grefat de
suportul de silicagel

C18>C8>C3>C1

 Din punct de vedere practic între fazele staţionare C18 si C8

nu exista o diferenţă semnificativă în ceea ce priveşte
retenţia
 Faze staţionare nepolare (RP)
15

 Stabilitatea fazei staţionare este dependentă de:

 tipul de suport
 tipul lanţului hidrocarbonat grefat
 pH-ul fazei mobile
 tipul de soluţie tampon utilizat în compoziţia fazei mobile
 tipul de modificator organic din faza mobilă

 Stabilitatea fazelor inverse (RP) versus pH-ul fazei mobile

 pH-ul optim 2.00 < pH < 8.00
 la pH < 2.00 coloane “stable bond”
 la pH > 8.00 coloane “extend”

 La valorile extreme de pH nu se utilizează soluţii tampon!

 Interacţiuni cu faza staţionară
16

Interacţiunea naproxenului
cu faza staţionară normală
(silicagel) şi inversă (C18) în
coloane HPLC

Watson D.G. Pharmaceutical Analysis, 3rd Edition, A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemists. Fig.12.2
 Cromatografia de lichide de inalta performanta
HPLC
17
Parametri de retenţie
 Timpi de retenţie
 Timp mort t0
 Timp de retenţie tR
 Timp de retenţie corectat t′R
 Timp de retenţie relativ tRr
 Volume de retenţie
Parametri de separare
 Coeficientul de distribuţie KC
 Factorul de capacitate k’
 Eficacitatea coloanei N
 Factorul de separabilitate α
 Rezoluţia Rs
 Timpul mort t0
18

 Este timpul scurs de la injectarea unui compus neretinut pe coloana cromatografică

până la înregistrarea picului său pe cromatogramă

 Se poate estima prin:

 Apreciere din linia de bază
 Utilizarea unui solvent puternic ca faza mobilă
 Calcularea din dimensiunea coloanei

Vm~ 0.5xLxdc2
 Vm=volumul mort al coloanei
 L=lungimea coloanei in cm
 dc= diametrul intern al coloanei in cm

 Injectarea unui compus nereţinut pe coloană

 Uracil
 Azotat de sodiu
 Cromatograma
19

to – timpul de eluţie a unui compus nereţinut pe coloană (timp mort)

tR- timpul de retenţie – criteriu de identificare

tR5

tR2 Aria picului ~ cantitatea

de analit
mAU

to

Injectare Timp (min)

Fig.1 Cromatograma unui amestec de 6 componente

 Separarea cromatografică
20

 Rezoluţia clasică Rs

Rs < 0.8
Rs = 1.0
Rs > 2.0

Fig.2 Evaluarea rezolutiei cromatografice

 Separarea cromatografică
21

 Rezoluţia Rs  Numărul de talere teoretice N

 Lungimea coloanei
 Debitul fazei mobile
 Mărimea particulelor fazei
staţionare

 Parametrii k’ si α
http://www.chromacademy.com/essential-guide/Feb-2014/figure-8.jpg
 Compoziţia fazei mobile
 Compoziţia fazei staţionare
 Lungimea coloanei
 Temperatura coloanei
 Separarea cromatografică
22

 Numărul de talere teoretice (N) ale coloanei

N=16(tr/w)2 sau N=5.54(tr/w1/2)2

 Lungimea coloanei
 Debitul fazei mobile
 Dimensiunile particulelor fazei stationare
 Temperatura
 Efect extra-coloană minim
 Compoziţia fazei mobile
23

 Efectul tăriei solventului

Fig. 3 Separarea unui

amestec de 5 compuşi prin
RP-HPLC

http://www.chromacademy.com/essential-guide/July_2012/fig-6.jpg
 Compoziţia fazei mobile
24

 Efectul selectivităţii solvenţilor

Fig. 4 Triunghiul selectivităţii

solvenţilor (Snyder)

http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageService.svc/ImageService/Articleimage/2015/GC/c5gc00887e/c5gc00887e-f1_hi-res.gif
 Compoziţia fazei mobile
25

 Efectul selectivităţii solvenţilor

Fig. 5 Efectul selectivităţii solvenţilor asupra separării

 Analiza iniţială a probelor
26

Condiţii cromatografice Iniţiale

 Coloana
 dimensiunea (L, id) 15 x 0.46cm
 dimensiunea particulelor 5m
 faza staţionară C8 sau C18
 Faza mobilă
 solventul A şi B apă MQ - acetonitril
 %B 80-100%
 Debitul fazei mobile 1.0 ml/min
 Temperatura coloanei 30 - 35 C
 Mărimea probei
 volumul < 25l d
 cantitatea < 100 g
 Optimizarea separării
27

Scop Comentarii

 Rezoluţia o analiză cantitativă precisă şi robustă presupune ca Rs >1.5

 Timpul de analiză < 5-10 minute pentru analize de rutină
 Determinare 2% (RSD) dozări;
cantitativă 5% (alte det;
15% (analiza urmelor)
 Presiunea < 150 bar optimă, < 200 bar uzuală
 Inălţimea picului optim picuri înalte, raport S/N mare
 Consumul de solvent optim minimum de fază mobilă/analiză
 Detectori în LC
28

 Refractometric (RIA)
 UV-VIS, PDA
 Fluorescenta (FLD)
 Electrochimic (EC)
 Spectrometrul de masa (MS)
 Evaporative light-scattering detector ( ELSD)
 Corona® charged aerosol detector (CAD)
 Sistemul de detecţie
29

 Caracteristicile unui sistem de detecţie sunt:

 Zgomotul de fond
 Sensibilitatea
 Selectivitatea (specificitatea)
 Zgomotul de fond
30

 Raportul S/N
 S = semnal analitic
 N = zgomot de fond
 Sensibilitatea detecţiei
31

Fig.6 Proba de n-butanol degradat a) detectie la 200nm; b) detectie la 184nm

 Selectivitatea detecţiei
32

Fig.7 Matrice de aliment cu riboflavina a) 365nm (UV) b) Ex 365nm ex/Em 530nm (FLD)
 Detecţia UV - absorbanţa probei
33

Fig.8 Spectrele UV ale amitriptilinei (AMI) si imipriminei (IMI)

 Probe analizate prin HPLC
34

 Compuşi polari, nepolari, polaritate intermediară, amestecuri cu polarităţi

diferite
 Pentru dezvoltarea unei metode sunt necesare informaţii despre probă:
 Natura probei (substanţe ca atare, forme farmaceutice, produse vegetale, produse
alimentare, medii biologice etc.)
 Numărul de componente din probă
 Structura chimică a substanţelor ce urmează a fi analizate
 Masa moleculară a componentelor
 Solubilitatea
 Ionizabile sau neionizabile
 Proprietăţile spectrale
 Pregătirea probelor
35

 Probele lichide
 Diluare simpla
 Extracţie lichid-lichid
 Extracţie pe faza solida (SPE)

 Probe solide
 Extractia Soxhlet
 Extracţia cu fluide supercritice (SFE)
 Tratament cu ultrasunete
 Extracţie solid-lichid
 Aplicatii ale metodei HPLC
36

 Calitative:
 Separarea şi identificarea componenţilor din amestec
 pe baza timpului de retenţie tR
 Controlul purităţii substanţelor medicamentoase
 pe baza timpului de retenţie tR
 Pe baza numărului de componente din proba de analizat

 Cantitative
 Determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase
 metoda standardelor externe
 metoda standardului intern
 Aplicaţii calitative
37

 tR - este un parametru caracteristic unei substanţe şi are o valoare

constantă în aceleaşi condiţii cromatografice

 Separarea componentelor unui amestec complex

 Evaluarea şi/sau calcularea rezoluţiei (Rs) a picurilor cromatografice

 Identificarea componentelor separate:

 pe baza timpului de retenţie tR,
 Compararea cu timpul de retenţie a unei substanţe etalon
 Pe baza caracteristicilor spectrale ale substanţei analizate
 Determinari cantitative
38

 Metoda standardelor externe

 A(aria picului) = f(concentraţie)

 Metoda standardului intern

 Aprobă/Astandard=f(cp/cs)
 Exemplu dezvoltare metodă
39

 Cafeină pKb =10,40 M= 194,2

 Paracetamol pKb = 9,38 M= 151,2
 Aspirină pKa = 3,49 M= 180,2
 Acid salicilic pKa = 2,97 M= 138,1

Acid salicilic

Cafeină Paracetamol Acid acetilsalicilic

 Proprietăţi spectrale
40
 Exemplu dezvoltare metodă
41

 Conditii cromatografice
 Echipament: Waters Alliance 2975 cu detector PDA 996
 Faza stationara:
coloana XTerra C8, 150x0.39mm,
precoloana XTERRA C8, 10x0.39mm
 Faza mobilă: (A) Acid acetic 4%
(B) Metanol
 Debit: 1mL/min
 Temperatura coloanei: 30°C
 Temperatura autosampler: 15°C
 Volum injectare: 20µl
 Exemplu - separare gradient G1
42

Timp min %A %B
Gradient 1: 0 95 5
5-100%B (20 minute) 20 0 100
25 95 5
30 95 5
 Exemplu – separare gradient G2
43

Timp min %A %B
0 95 5
Gradient 2: 60 0 100
5-100%B (60 minute) 65 95 5
70 95 5
 Exemplu – optimizare DryLab2000 software
44

Timp min %A %B
0 99 1
Gradient optim:
7 60 40
1-40%B (18 min) 15 99 1
18 99 1
 Exemplu – evaluare cantitativă
45

Name Time Equation R^2 R

1 PAR 3.350 Y = 1.73e+007 X - 4.97e+005 0.996656 0.998327
2 CAF 4.636 Y = 5.62e+007 X + 6.80e+004 0.998494 0.999247
3 AAS 8.922 Y = 7.14e+006 X - 3.65e+004 0.994802 0.997398
4 AS 11.857 Y = 3.94e+007 X + 6.08e+004 0.996444 0.998220
 Exemplu – evaluare cantitativă
46
 Oportunitatea alegerii metodei HPLC
47

 Standardizarea si verificarea materiilor prime si formelor

farmaceutice (puritate, stabilitate, dozare, stabilirea perioadei de
valabilitate);

 Izolarea si purificarea principiilor active din produse vegetale;

 Aprecierea concentratiilor mici (ng) din studiile “in vitro” sau “in vivo”
asociate cercetarilor din domeniul biofarmaciei, farmacocineticii si
farmacologiei.
 Concluzii
48

 Metoda HPLC este o metodă cromatografică modernă şi

performantă de analiză cu aplicații multiple în analiza
medicamentului

 Este necesară aprecierea oportunităţii utilizării metodei în

vederea reducerii costurilor

 Aprecierea corectă a naturii probelor de analizat este factorul

determinant în alegerea celei mai potrivite metode de analiza
HPLC.
 Bibliografie
49

1. Watson D.G. Pharmaceutical Analysis, 3rd Edition, A Textbook for Pharmacy

Students and Pharmaceutical Chemists, Elsevier, 2012
2. Brian A. Bidlingmeyer – Practical HPLC methodology and applications, Wiley
Interscience, New York,1992
3. F. Rouessac, A. Rouessac – Analyse Chimique, 4e edition, Dunod, Paris 1992
4. G. Mahuzier, M. Hamon, D. Ferrier, P. Prognon – abreges. Chimie Analytique.
Methodes de separation, Masson, Paris, 1990
5. Legături utile
http://www.chromatographyonline.com/?eid=195982173&bid=1556075
http://www.acdlabs.com/home
http://www.waters.com/waters/home.htm?locale=170
https://www.agilent.com/