Metode cromatografice

Cromatografia in strat subtire CSS

Thin Layer Chromatography TLC
Istoric

• Ismailov si Schraiber – 1938

– Al2O3

• Stahl – 1962
– Prima monografie despre CSS
Caracterizarea metodei
forma plana a suportului fazei fixe

Separarea se bazeaza pe distributia

(repartitia) componentelor probei
intre:

• Faza fixa – strat subtire de material solid

depus pe un suport plan

• Faza mobila - lichida

Faza fixa = solidă
• Conditii:
– Sa nu reactioneze cu substantele de
separat sau cu faza mobila
– Sa nu reactioneze cu reactivii de
identificare
– Sa fie termostabil T > 1000C
– Sa aiba suprafata specifica mare
(granulatie fina)
CONDITIE OBLIGATORIE: legatura intre faza
fixa si substantele adsorbite sa fie reversibila in
prezenta fazei mobile !!!!

• Silicagel
• Oxid de aluminiu
• Kieselgur
• Hidroxid de magneziu
• Celuloza
• Poliamide
• Sephadex
• Rasini schimbatoare de ioni
 Prepararea placilor cromatografice
1. Placi de sticla 10 x 10 cm; 20 x 20
cm, spalate, degresate, uscate
2. Aplicarea pastei de adsorbant:
intindere in strat uniform
3. Uscarea pastei de adsorbant
4. Activarea placilor → cresterea
capacitatii de adsorbtie: prin
incalzire
– Ex : silicagel 1200C
Tipuri de placi
• Monocanal
• Multicanal
• Cu zona de concentrare
• De inalta performanta
• Pentru CSS in faza
inversa
Faza mobila (developant)
• Conditii:
– Substante cat mai pure
– Sa separe cat mai complet componentele
– Rf 0,05 – 0,9
– Sa nu interactioneze chimic cu suportul sau cu
componentele amestecului de separat

• Amestecuri de solventi in proportii si

concentratii variabile

• Seria eluotropa → o serie de solventi cu

putere de separare crescatoare
Alegerea fazei mobile

• Substanţe cunoscute → în funcţie de polaritatea

acestora utilizând seriile eloutrope.
• Substanţe necunoscute →mai multe încercări pornind
de la solvenţii nepolari spre cei polari sau sisteme
eluotrope binare sau ternare

9
Etape
• Aplicarea probei (spotare)

• Developare

• Relevarea componentelor amestecului

• Determinare calitativa

• Determinare cantitativa
Aplicarea probelor pe placa
• 1,5 cm de marginea plăcii
• Microseringi, 4-20µl
 • se imersează placa într-un vas cu

Developare închidere etanşă în care atmosfera este

saturată de vapori ai solventului sau ai
amestecului de solvenţi utilizaţi pentru
separare (faza mobilă)

• migrarea componenţilor fazei mobile

printre particolele fazei staţionare

Componentele amestecului migrează

diferit, în funcţie de modul lor de
distribuţie între cele două faze:

- Componentele adsorbite mai

puternic de către faza staţionară vor
staţiona mai mult şi durata antrenării va fi
mai mică;

- cu cât componenta este mai puţin

adsorbită de către faza fixă, cu atât va
avea o viteză de migrare mai mare,
apropiată de a fazei mobile.
Camere (tancuri) cromatografice

• Normale (paralelipipedice, cilindrice)

• Tip Sandwich (stratificate) – cresterea vitezei de

migrare

• Orizontale
Identificarea componentelor
amestecului
– Reactivi de identificare
– Vizualizare in UV
Componente CSS:
Determinarea calitativa
1. Prin reactii chimice specifice, direct pe placa
2. Metode fizico-chimice, dupa eluarea de pe placa
3. Valoarea Rf (retardation factor) – masoara viteza de deplasare pe
placa a componentelor fata de frontul developantului
– Rf valori 0 - 1
– Etaloane !!!!

Rf = Xspot/Xsolvent
Cromatografia bidimensionala
Two-dimensional TLC separation of complex lipids from
A. thaliana

• MGDG, monogalactosyldiacylglycerols;
• DGDG, digalactosyldiacylglycerol;
• SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol;
• DPG, diphosphatidylglycerol; PG,
phosphatidylglycerol;
• PE, phosphatidylethanolamine;
• PI, phosphatidylinositol;
• PS, phosphatidylserine;
• PC, phosphatidylcholine.
Determinarea cantitativa
1. Direct pe placa
1. Metoda compararii vizuale – semicantitativa
2. Metoda densitometrica

2. Dupa elutia substantei din adsorbant

1. Spectrofotometrie UV
2. Colorimetrie
3. GC
Metoda densitometrica
– prin transmisie sau reflexie a spotului
(spoturilor), respectiv mai recent scanarea lui
– se poate realiza în lumină vizibilă sau UV (si
radiatia de fluorescenta).
 Semnalul măsurat serveşte
– construirea unei curbe de etalonare
din semnalele măsurate pentru
diferitele spoturi
– cantităţi crescătoare de component
aplicate, alături de proba
necunoscută, pe aceeaşi placă.

Metoda curbei de etalonare în

reflexie (măsurarea reflectanţei)
deoarece domeniul liniar al
metodei este destul de îngust

Calibration Curves Obtained by Densitometer Measurements at 270

nm of a Caffeine Standard and the Image Analyzing System at 259 nm
Schema unui densitometru

Lămpi cu:
•incandescenţă - cu halogen - (W), pentru
determinări în domeniul vizibil (400-800nm)
•cu deuteriu (D) pentru spoturile care
absorb în UV (190-400nm)
• UV cu intensitate ridicată (xenon sau cu
vapori de mercur), (Hg), pentru spoturile
fluorescente
.

1. Lumina monocromatică care părăseşte monocromatorul MC

2. se reflectă pe oglinda O,
3. se reflectă pe placa cu strat subţire P
4. lumina reflectată este receptată pe fotomultiplicatorul F.
5. Semnalul obţinut este înregistrat de înregistratorul I, care
poate fi un calculator
Scanner 3 for Densitometric Evaluation
of Thin-Layer Chromatograms

CAMAG TLC Scanner 4

the most advanced workstation for
densitometric evaluation of Thin-Layer
Chromatograms currently available.
 Quantification of lipids by analytical Thin Layer
Chromatography:
• After separation and derivatization of the lipid bands,
•the TLC is scanned lane by lane by the TLC Scanner 3 of
CAMAG, which produces quantitative data by densitometry.
•a calibration curve is calculated from the peak areas of standard
substances developed together with the sample extract on the
same plate.
•The lipid content of the samples is then calculated on the basis
of the calibration curve.
Aplicatii ale metodei TLC
• Determinarea unor componente ale
alimentelor
– Lipide
– Oligozaharide
– Vitamine
– Flavonoide
– Compusi fenolici
– Carotenoide
– Clorofile
– aminoacizi
Determinarea unor substante
adaugate
• Coloranti
• Indulcitori
• Emulgatori
• conservanti
Contaminanti alimentari
• Micotoxine
• Medicamente
• Pesticide
• HPA
Avantaje :
• Rapiditate
• Cost mai redus fata de alte metode cromatografice
• Aplicabilitate la compuşi care prezintă instabilitate
termică, atât hidrosolubili cât şi liposolubili
• Posibilitatea analizării simultane a mai multor probe
• Reproductibilitatea rezultatelor

Dezavantaje:
• Sensibilitate (în general) mai mică decât în
cromatografia de lichide pe coloana
• Necesitatea unei purificări mai avansate
• Repetabilitate scăzută în cazul unor temperaturi sau
umidităţi ambientale ridicate (risc scăzut în condiţiile
climatice din ţara noastră)
Intrebari de verificare
1. Pe ce se bazează metoda CSS (TLC)?
2. Dati ex de faza fixa/mobilă la CSS
3. Care este criteriul de alegere al fazei mobile la CSS?
4. Enumerați etapele unei determinări de tip CSS
5. Pe ce se bazează o determinare calitativa ȋn tehnica CSS?
6. Ce reprezintă și ce măsoara Rf ȋn tehnica CSS?
7. Enumerați metodele de determinare cantitativă ȋn tehnica
CSS
8. Care dintre metodele de determinare cantitativa de la CSS
utilizează curba de etalonare (eventual detaliați)
9. Dați minim trei exemple de determinări legate de alimente
care se pot executa prin tehnica CSS
10. Enumerați minim 2 avantaje/dezavantaje ale tehnicii CSS
față de alte tehnici cromatografice