CHIMIE ALIMENTARĂ ȘI TEHNOLOGII BIOCHIMICE

ENZIMOLOGIE APLICATĂ

Structura enzimelor – Cofactorii enzimatici

Mecanisme în cataliza enzimatică

Conf. Dr. Biochim. Bogdan Nicolae Manolescu

Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

Departamentul de Chimie Organică ”C. Nenițescu”
Laborator 013, Corp F, Campus Polizu
 Structura enzimelor

Structura enzimelor:

 enzime cu structură exclusiv proteică:

 la hidroliză eliberează doar aminoacizi
 exemple: lizozim, tripsină, chimotripsină

 enzime ce conțin și o componentă neproteică:

 conțin și o componentă neproteică (COFACTOR)
 exemple: kinaze, dehidrogenaze, transferaze

 terminologie:
 APOENZIMĂ – parte proteică
 HOLOENZIMĂ – parte proteică + cofactor

 clasificarea cofactorilor:
 ioni metalici
 coenzime
 Structura enzimelor

Structura enzimelor:

 enzimele sunt proteine formate din cei 20 de aminoacizi standard:

 aminoacizi nonpolari (Ala, Val, Leu, Met)
 aminoacizi polari fără sarcină electrică (Asn, Gln, Ser, Thr)
 aminoacizi polari cu sarcină pozitivă (Glu, Asp)
 aminoacizi polari cu sarcină negativă (Arg, Lys, His)

 legătura peptidică:
 legătură dublă (~40%)
 conformație trans
 Structura enzimelor

Structura enzimelor:

 nivele de organizare:
 structura primară
 structura secundară
 structura terțiară
 structura cuaternară

 structura primară:
 indică secvența și tipul aminoacizilor
 determină nivelele superioare de organizare

 structura secundară:
 organizarea 3D a aminoacizilor din regiuni discrete
 tipuri de structuri secundare:
 α-helix
 β-sheet (paralel, antiparalel)
 α-helix

β-sheet
 Structura enzimelor

Structura enzimelor:

 structura terțiară:
 organizarea 3D a întregii proteine
 consecința interacțiilor dintre catenele laterale ale aminoacizilor
 la suprafața proteinei sunt localizați aminoacizi ce pot forma legături de
hidrogen cu moleculele de apă
 tipuri de legături ce stabilizează structura terțiară:
 legături ionice
 legături de hidrogen
 interacții van der Waals

 structura cuaternară:
 specifică enzimelor formate din mai multe subunități
 indică modul de interacție și de aranjare în spațiu al subunităților
 subunitățile pot fi identice sau diferite
Structura enzimelor
 Structura enzimelor

Structura enzimelor:

 motivele structurale:
 asocieri de mai multe elemente de structură secundară
 elementele care se asociază pot fi de același fel sau nu
 se mai numesc domenii

 clasificarea proteinelor în funcții de domeniile conținute:

 all-α-proteins – conțin doar elemente de tip α-helix
 all-β-proteins – conțin doar elemente de tip β-helix
 α/β-proteins – conțin ambele tipuri de elemente alternând
 α+β-proteins – conțin ambele tipuri de elemenet separate
Structura enzimelor
 Structura enzimelor

Domeniul de tip Rossmann:

 conține secvența de tip βαβαβ

 specific dehidrogenazelor dependente de NAD(P)+
 Structura enzimelor

Izoenzime:

 enzime ce catalizează aceași reacție

 diferă prin:
 distribuția tisulară
 parametrii cinetici (KM, vmax)
 exemple: lactat dehidrogenaza, alcool dehidrogenaza, creatin kinaza
 Structura enzimelor

Centrul catalitic activ:

 caracteristici generale:
 regiune discretă din structura 3D a unei enzime
 dimensiuni mici comparativ cu toată enzima

 format din aminoacizi situați la distanță unul de celălalt în structura

primară a enzimei:
 lizozim – 35, 52, 62, 63, 101, 108

Transformarea este
 rolurile centrului catalitic activ: asigurată de către
 enzime cu structură exclusiv proteică: cofactorii enzimatici!
 recunoașterea și legarea substratului
 realizarea transformării substratului
 enzime ce conțin și o componentă neproteică:
 recunoașterea și legarea substratului
Structura enzimelor
Structura enzimelor
 Structura enzimelor

Determinarea aminoacizilor din centrul catalitic activ:

 folosirea unor reactivi specifici pentru diferiți aminoacizi

 determinarea resturilor de Cys:

 reacția cu acid iodoacetic

 determinarea resturilor de Ser:

 reacția cu diizopropil fluorofosfat (DIPF)
 Structura enzimelor

Modelarea interacției enzimă – substrat:

 tipuri de legături implicate:

 interacții ionice
 legături de hidrogen
 interacții hidrofobe
 legături van der Waals

 complementaritatea S – E:
 sterică
 electrostatică
 Structura enzimelor

Modelarea interacției enzimă – substrat:

 modelul lacăt-cheie:
 propus de Emil Fischer
 centrul catalitic activ este o regiune fixă

 există o complementaritate sterică și

electrostatică perfectă între centrul catalitic activ și substrat

 modelul adaptării induse:

 propus de Daniel Koshland
 centrul catalitic activ este o regiune

preformată și nu fixă
 se formează doar în prezența substratului
 Structura enzimelor

Centre allosterice:

 regiuni discrete din structura 3D a unei enzime diferite de centrului

catalitic activ

 leagă compuși cu masă moleculară mică:

 produsul final al reacției sau al căii metabolice
 substratul reacției
 alți compuși (ATP, ADP, citrat, fructozo-2,6-bisfosfat)

 leagă:
 efectori allosterici pozitivi
 efectori allosterici negativi

 sunt importante pentru reglarea activității enzimelor in vivo

 Structura enzimelor

Reglarea enzimelor allosterice:

• efectorul allosteric negativ induce o modificare conformațională ce blochează legarea substr.

• efectorul allosteric pozitiv induce o modificare conformațională ce facilitează legarea substr.
 Cofactorii enzimatici

Cofactorii enzimatici:
 Cofactorii enzimatici

Cofactorii enzimatici – ioni metalici:

 rolurile ionilor metalici:

 structural – stabilizarea structurii 3D a enzimei
 funcțional – participarea directă în reacția chimică
 ambele

 clasificarea enzimelor ce conțin ioni metalici:

 metaloenzime:
 cationul este legat puternic la apoenzimă
 pierderea cationului duce la anularea activității enzimatice
 exemple: Fe2+, Fe3+, Mn2+, Co2+

 enzime activate de ioni metalici:

 cationul este legat slab la apoenzimă
 pierderea cationului duce la scăderea activității enzimatice
 exemple: Na+, K+, Ca2+, Mg2+
 Cofactorii enzimatici

Cofactorii enzimatici – ioni metalici:

 α-amilaza (Bacillus subtilis):

 Ca2+ – rol catalitic
 Zn2+ – rol structural

 alcool dehidrogenaza:
 Zn2+ – rol catalitic
 Zn2+ – rol structural

 anhidraza carbonică:
 Zn2+ – rol catalitic
 Cofactorii enzimatici
B1 – tiaminpirofosfat (TPP)
Cofactorii enzimatici – compuși organici: B2 – FAD/FMN
B6 – piridoxal/-ol-5’-fosfat
PP – NAD(P)+/NAD(P)H
 terminologie: Biotină
Acid pantotenic – coenzima A
 coenzimă – legătura dintre cofactor și apoenzimă este slabă
 grupare prostetică – legătura dintre cofactor și apoenzimă este tare

 roluri îndeplinite:
 conferă specificitate de reacție
 cofactori implicați în transferul de grupări
 cofactori implicați în transferul de electroni
 cofactori implicați în activarea substratului

 proveniență:
 derivă de la vitamine hidrosolubile
 exemple: TPP, FAD/FMN, NAD(P)+/NAD(P)H
 Mecanisme în cataliza enzimatică

Mecanisme în cataliza enzimatică:

 mecanismul unei reacții enzimatice este cunoscut atunci când:

 se cunosc etapele intermediare prin care S  P
 se cunosc vitezele cu care au loc reacțiile intermediare
 se cunosc structurile complexelor intermediare

 tipuri de mecanisme în cataliză:

 cataliză acido-bazică
 cataliză covalentă
 cataliză prin cationi
 cataliză prin efecte de proximitate
 cataliză prin legarea preferențială a stării de tranziție
 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza acido-bazică:

 clasificare:
 cataliză acidă – cedarea unui H+ către substrat scade energia liberă
necesară pentru formarea stării de tranziție
 cataliză bazică – extragerea unui H+ din substrat scade energia liberă
necesară pentru formarea stării de tranziție
 cataliză acido-bazică concertată

 observații:
 enzimele conțin aminoacizi ale căror catene laterale au grupări pot ceda
sau accepta H+ (Asp, Glu, His, Cys, Ser)
 acești aminoacizi au valori pKa ale grupărilor din catena laterală aproape
de pH-ul fiziologic  cedează/acceptă H+ la pH fiziologic
 activitatea acestor enzime este sensibilă la variația pH-ului mediului
deoarece este influențată ionizarea grupelor ce pot ceda/accepta H+
 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza covalentă: CATALIZĂ NUCLEOFILĂ

 apare un intermediar covalent enzimă-substrat:

 legătura covalentă apare în urma atacului unei grupări nucleofile din
enzimă asupra unei grupări electrofile din molecula substratului

 agenți nucleofili importanți din punct de vedere biologic:

 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza covalentă:

 observații:
 cu cât legătura covalentă formată este mai stabilă cu atât intermediarul
se descompune mai lent și se formează mai lent produsul de reacție
 caracteristicile grupei nucleofile:
 trebuie să aibă caracter nucleofil accentuat
 trebuie să fie o bună ”leaving group”

I- este un agent nucleofil mai

bun decât HO-

I- este o ”leaving group”

mai bună decât Cl-
 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza covalentă – serin proteazele: ENDOPROTEAZE

 enzimele: tripsină, chimotripsină, elastază

 aminoacizii implicați în reacție: Asp, His, Ser

 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza prin cationi:

 cationii cresc viteza de reacție prin:

 accentuarea caracterului electrofil al unui substrat
 diminuarea bazicității unei ”leaving group”  better ”leaving group”
 creșterea caracterului nucleofil al apei

 exemplu:
 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza prin cationi:

 cationii participă în reacțiile enzimatice prin:

 legarea și orientarea corectă a substratului
 participarea în procesele redox
 modularea reactivității substratului
 Mecanisme în cataliza enzimatică

Cataliza prin cationi:

 anhidraza carbonică:
 Zn2+ crește caracterul nucleofil al H2O  facilitează pierderea unui H+
 Zn2+ scade valoarea pKa a H2O de la 15,7 la 7

 alcool dehidrogenaza:
 Zn2+ crește caracterul electrofil al grupării carbonil  facilitează primirea
unui H- (ion hidrură)
Mecanisme în cataliza enzimatică