Enzimologie Aplicata (Partea 4)

CHIMIE ALIMENTARĂ ȘI TEHNOLOGII BIOCHIMICE
ENZIMOLOGIE APLICATĂ
Producerea industrială a enzimelor

Separarea, purificarea și formularea preparatelor enzimatice
Conf. Dr. Biochim. Bogdan Nicolae Manolescu
Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

Departamentul de Chimie Organică ”C. Nenițescu”
Laborator 013, Corp F, Campus Polizu
Producerea enzimelor:
 surse de enzime pentru aplicații industriale:

 surse vegetale
 surse animale
 surse microbiene
 piața enzimelor cu aplicații industriale:

 2014 – 2.2 miliarde $
 2020 – 6.2 miliarde $
Producerea enzimelor:
 tehnologia ADN recombinant permite:

 producerea unor cantități mari de enzime
 obținerea unor preparate cu puritate înaltă
 modificarea enzimelor pentru obținerea anumitor proprietăți:
 rezistență la acțiunea unor agenți oxidanți
 modificarea specificității de substrat
 stabilitate termică crescută
 obținerea unor enzime de la organisme patogene sau care produc o
anumită enzimă la un nivel scăzut
 utilizarea enzimelor produse de extremofile:

 termofile (stabilitate la peste 90°C)
 psicrofile (stabilitate la 0°C)
 barofile (stabilitate la presiuni mari)
 acidofile (stabilitate la pH acid)
Inginerie genetică:
 modificarea genomului  organisme modificate genetic (GMO)
 aplicații ale GMO:

 industria farmaceutică:
 hormoni (insulină)
 anticorpi, vaccinuri
 industria alimentară:
 obținerea de aminoacizi și vitamine
 producerea de enzime utilizate în industria alimentară
 agricultură:
 specii vegetale rezistente la dăunători sau cu calități nutriționale superioare
 cercetare fundamentală
 generarea GMO  tehnologia ADN recombinant

Deficiența vitaminei A:
 incidența deficienței:
 190 milioane copii
 19 milioane femei gravide
 122 tări
 consecințele deficienței:
 deces (1-2 milioane/an)
 pierderea ireversibilă a vederii (500.000/an)
 xeroftalmie (milioane/an)
 tulburări de creștere
 grupuri vulnerabile:
 copii preșcolari
 femei gravide
 femei care alăptează
 strategii pentru combaterea deficienței de vitamină A:

 utilizarea de suplimente pe bază de vitamină A
 consumul de alimente fortificate cu vitamină A
 consumul de alimente bogate în vitamină A
 alimente cu conținut ridicat de vitamină A:

 orez modificat genetic
 cartofi dulci portocalii
The Journal of Nutrition

(Mai, 2017)
Cartofi dulci (Ipomoea batatas L. Lam.)
Biotransformarea vitaminei A
 orez modificat genetic – ”Golden rice” 1 & 2:

 GR1 – Science 2000
 manipulare genetică:
 gena psy:
 Narcissus pseudonarcissus
 codifică fitoen sintază
 gena crtl:
 Erwinia uredovora
 codifică fitoen desaturază
Tehnologia ADN recombinant:
 izolarea genei de interes de la organismul donor

 introducerea sa într-un vector de expresie
 transformarea organismului gazdă
 generarea proteinei codificate (enzimă pentru industria alimentară)
Tehnologia ADN recombinant:
 organism donor:
 organism de la care se izolează gena ce codifică enzima de interes
 exemple: organism mamalian, organism vegetal, microorganism
 organism gazdă:
 organism în care se introduce gena ce codifică enzima și care produce
enzima de interes:
 expresie homologă
 expresie heterologă
 exemple: organisme prokariote (bacterii), organisme eukariote (levuri,
fungi filamentoși, celule mamaliene, celule de la insecte)
 vector de expresie/clonare:
 vehicolul ce permite transferul genei de interes
 exemple: plasmide, cosmide, fagimide, cromozomi artificiali
Plasmide – prezentare generală:
 molecule de ADN dublu catenare circular (1-200 kb)
 conțin următoarele elemente:

 gene ce conferă rezistență la antibiotice (ampicilină)
 originea replicării (oriC)
 regiune polylinker – acționează specific anumite enzime de restricție
 promotor – secvență de la care este transcrisă gena de interes
Introducerea unei gene într-un vector de clonare:
 enzime de restricție:
 endonucleaze ce recunosc anumite secvențe
 taie pe ambele catene ale unei molecule de ADN dublu catenar
 generează 2 tipuri de capete:
 sticky ends
 blunt ends
 ADN ligaze:
 catalizează formarea legăturilor fosfatdiesterice
 permit inserarea și legarea genei de interes în plasmid
Tehnologia ADN recombinant – producerea fosfolipazei A2:
 fosfolipaza A2 (EC 3.1.1.4):

 substrat – glicerofosfolipide
 produs – 2-lizofosfolipide
 aplicații industriale:
 prelucrarea gălbenușului de ou  crește capacitatea de emulsionare
 eliminarea fosfolipidelor din uleiurile vegetale (soia)
 obținerea lizolecitinei  industria alimentară, cosmetică, medicamente
 obținerea tradițională:
 extragere și purificare din pancreas de porc
 obținere prin biotehnologii:

 clonarea și expresia genei porcine la Aspergillus sp.
 clonarea și exprimarea genei de la Streptomyces violaceoruber
Sisteme de expresie:
 sisteme prokariote
 sisteme eukariote
Dezvoltarea de microorganisme recombinante:
 dezvoltarea tulpinii gazdă

 construcția vectorului de expresie
 transformarea tulpinii gazdă
 identificarea celei mai bune tulpini recomb.
 îmbunătățiri suplimentare
 caracterizarea tulpinii producătoare
 exemplu:
 sucurile de Glc + Fru  edulcoranți
 se obțin prin:
 hidroliza amidonului
 izomerizarea Glc ↔ Fru
 lichefierea amidonului:
 încălzire la 105°C (2-5 minute)
 încălzire la 90-100°C (1-2 ore)
Menținerea și stocarea culturilor microbiene:
 conservarea și stocarea se face prin înghețare
 forma de conservare:
 cultură în mediu lichid (suspensie) + crioconservant (glicerol, DMSO)
 cultură în mediu solid
 condiții de stocare:
 durată scurtă – freezer (-20°C – -70°C)
 durată lungă – azot lichid – durată lungă
 colecții de microorganisme:
 ATCC – american type culture collection
 NCIMB – national collection of industrial, marine and food bacteria
 NCTC – national collection of type cultures
Producerea enzimei – fermentator:
 transferul culturii microbiene în fermentator se face treptat

 se trece prin vase cu volume de 10X mai mari decât cele anterioare
 localizarea enzimei de interes:
 enzimă intracelulară
 enzimă secretată în mediul de cultură
Izolarea și purificarea enzimelor
Aspecte generale:
 gradul de puritate:
 enzime brute
 preparate enzimatice foarte pure
 surse de izolare a enzimelor:

 organe animale
 materiale vegetale
 microorganisme
 purificare  localizarea enzimei:

 enzime intracelulare:
 dezintegrare celulară și separare
 costuri mai mari
 enzime extracelulare:
 purificare mai simplă
 costuri mai mici
Alegerea sursei biologice: Etapa 1
 disponibilitatea sursei:
 unele organisme sunt endemice pentru anumite zone ale globului
 unele organisme trăiesc în medii greu accesibile (adâncime mare)
 abundența enzimei:
 ficat – glucokinază, glucuronil transferaze, enzimele ciclului ureogenetic
 glanda mamară – enzime implicate în sinteza lactozei, acizilor grași
 localizarea enzimei de interes:

 enzime extracelulare – se izolează din mediul de cultură
 enzime intracelulare:
 spargerea celulelor
 izolarea din amestecul complex
 tehnologia ADN recombinant  microorganisme ce produc enzime
extracelulare
Alegerea sursei biologice:
 gradul de caracterizare a sursei biologice:

 surse animale:
 animale clinic sănătoase, crescute în aceleași condiții, cu aceeași greutate și
vârstă
 animalele de laborator trebuie să urmeze un regim alimentar strict
 surse vegetale:
 trebuie să fie cunoscute genul, specia, varietatea
 condițiile de mediu (tipul de sol, umiditatea, gradul de expunere la lumină)
 surse microbiene:
 să fie stabile dpdv genetic
 să nu producă antibiotice, substanțe toxice, alergene, piretice
 microorganisme GRAS (generally regarded as safe)
 alegerea sursei biologice se face ținând cont de cei patru factori

menționați anterior
Extracția enzimei de interes: Etapa 2
 situații posibile:
 enzimă extracelulară  se trece la etapa 5
 enzimă intracelulară  se trece la etapa 3
 extracția enzimelor intracelulare necesită:

 dezintegrarea celulelor
 prepararea unui mediu de extracție
 mediul de extracție:
 soluție tampon
 suplimentar mai poate conține:
 detergenți
 agenți reducători
 agenți de complexare a cationilor metalelor tranziționale
 inhibitori de proteaze
Mediul de extracție:
 compoziția mediului de extracție se optimizează prin încercări
 sistemul tampon:
 fiecare enzimă are un pHoptim
 fiecare enzimă are un pI ecuația Henderson-Hasselbalch
 solubilitate minimă
 pierderea activității biologice
 menține pH-ul constant pe un interval de pKa ± 1
 observații:
 se consideră o enzimă cu pHoptim = 7,6  ce tampon se va alege:
 acid acetic/acetat (pKa = 4,75)
 HEPES (pKa = 7,39)
 se consideră ureaza (pI = 5)  se poate lucra cu un tampon cu pH
apropiat de 5?
Sistemul tampon – criterii de alegere:
 nu trebuie să lege cationi de care depinde enzima de interes:

 tampoanele pe bază de anioni polivalenți (citrat) complexează cationii
 exemple: kinaze (Mg2+), hidroxilaze (Cu2+, Fe2+)
 nu trebuie să reacționeze chimic cu subst. din mediul de extracție, cu

substratul/substratele enzimei, cu coenzimele:
 tampoanele pe bază de borați  reacționează cu compuși ce conțin
grupări –OH vicinale
 tampoanele pe bază de Tris  pot forma baze Schiff cu aldehide/cetone
 nu trebuie să absoarbă în UV:

 etapele ulterioare ale unui protocol necesită determinarea concentrației
proteice
 unele substanțe interferă cu metodele de determinare a conc proteice
Tampoanele Good (tampoane biologice):
 caracteristici:
 pKa cuprins între 6 și 8
 hidrosolubilitate cât mai mare
 să nu modifice tăria ionică a mediului
 interacții minime cu cationii din mediu
 stabilitate chimică crescută
 absorbanță minimă între 240 și 700 nm
 aplicații:
 studii de enzimologie
 studii de biologie moleculară
 studii de genetică
Utilizarea detergenților:
 substanțe hidrosolubile cu proprietăți tensioactive:

 conțin în structura lor:
 o grupare polară (încărcată/neîncărcată)
 o catenă hidrocarbonată hidrofobă
 formează micele în soluție
 reduc tensiunea superficială, cresc miscibilitatea, stabilizează emulsii
 clasificarea detergenților:
 detergenți neionici
 detergenți ionici (anionici & cationici)
 detergenți zwițerionici
 observații:
 detergenții neionici nu afectează structura 3D a proteinelor
 detergenții ionici sunt agenți denaturanți puternici
Tipuri de detergenți
Solubilizarea proteinelor
integrale de membrană cu
ajutorul detergenților
Utilizarea agenților reducători:
 enzimele ce conțin resturi de Cys (-SH) sunt sensibile la prezența O2
 protejarea grupărilor –SH de oxidare  agenți reducători
cel mai avantajos

 exemple:
 1,4-ditiotreitol
este foarte scump
 1,4-ditioeritritol
 2-mercaptoetanol este toxic
 se lucrează cu concentrații de 10-25 mM pentru a reveni scindarea

punților disulfurice în cazul în care acestea există în structura
enzimei de interes
Utilizarea agenților de complexare a cationilor:
 cationii metalelor tranziționale alterează funcția enzimelor prin:

 reacția directă cu grupările –SH ale resturilor de Cys
 participarea în reacții generatoare de specii reactive de oxigen și azot
 efectele negative sunt limitate prin:

 adăugarea unor agenți de complexare (EDTA*, EGTA**)
 tratarea apei utilizate cu Chelex (Chelex-20, Chelex-100)
 rășinile Chelex:
 copolimeri stiren-divinilbenzen
 conțin grupări iminodiacetat
 manifestă afinitate foarte mare pentru cationi
 sarcina electrică depinde de pH-ul mediului
* EDTA = acid etilendiaminotetraacetic

** EGTA = acid etilenglicoltetraacetic
EGTA
EDTA
Utilizarea inhibitorilor de proteaze:
 celulele conțin proteaze ce pot degrada enzima de interes
 acțiunea proteazelor endogene poate fi limitată prin:

 menținerea probelor pe gheață
 utilizarea unor surse biologice cu un conținut mai scăzut de proteaze
 fixarea proteazelor cu ajutorul unor adsorbanți
 modificarea pH-ului mediului de extracție
 utilizarea unor inhibitori de proteaze
 clasificarea proteazelor:
 serin proteaze
 cistein proteaze
 metaloproteaze
 aspartic proteaze
Utilizarea inhibitorilor de proteaze:
 mecanisme de acțiune ale inhibitorilor de proteaze:

 modificarea covalentă și ireversibilă a unor aminoacizi din centrul
catalitic al enzimei
 complexarea ionilor metalici necesari proteazei (metaloproteaze)
 legarea necovalentă a unor inhibitori
 comercializare:
 inhibitori individuali
 amestecuri de inhibitori
Eliminarea interferențelor date de compușii fenolici – probe vegetale:
 oxidarea fenolilor din organismele vegetale:

 monofenol oxidze (tirozinaze)
ioni de Cu2+
 catecol oxidaze
 soluții pentru prevenirea brunificării probelor vegetale:

 agenți de complexare a ionilor de Cu2+
 agenți reducători:
 inhibă activitatea celor două enzime
 reduc chinonele la difenolii corespunzători
 substanțe ce elimină produșii de polimerizare:
 polimeri naturali (albumină serică bovină)
 polimeri sintetici (polivinilpirolidonă, rășini polistirenice)
Metode folosite pentru dezintegrarea celulară: Etapa 3
 aspecte generale: EXTRACT PROTEIC TOTAL

 metodele se deosebesc prin agresivitatea față de probă
 se preferă folosirea unor metode blânde pentru a preveni:
 inactivarea enzimei de interes
 eliberarea enzimelor ce ar putea afecta enzima de interes
 alegerea unei metode ține cont de:
 tipul probei biologice luată în lucru
 stabilitatea enzimei de interes
 gradul de purificare ce se dorește a se obține
 clasificarea metodelor:
 metode fizice
 metode chimice
 metode enzimatice
• determină permeabilizarea membranei celulare
• se folosesc diferiți reactivi (baze, detergenți, solvenți organici)
Metode folosite pentru dezintegrarea celulară – metode fizice:
 liquid shear:
 utilizează omogenizatoare Manton-Gaulin (French press)
 suspensia celulară este forțată să treacă printr-un orificiu cu diametru
reglabil (< 150 MPa)
 spargerea celulelor  forțe de lovire și frecare, diferență de presiune
 aplicații: dezintegrarea celulelor bacteriene și de levuri
 se aplică la scară industrială
 solid shear:
 similară cu metoda anterioară
 suspensia celulară:
 este transformată într-o pastă prin înghețare (-20°C – -27°C)
 este forțată să treacă printr-un orificiu cu diametru reglabil (150-230 MPa)
 spargerea celulelor  forțe de lovire și frecare, diferență de presiune,
prezența cristalelor de gheață
 nu se aplică la scară industrială
Observații:
• suspensia trebuie răcită în prealabil

deoarece în timpul procesului tehnologic
crește temperatura
• nu se utilizează pentru dezintegrarea
microorganismelor filamentoase
Metode folosite pentru dezintegrarea celulară – metode fizice:
 mojararea în prezența unor materiale abrazive:

 spargerea celulelor este realizată cu materiale abrazive: perle de sticlă
(0,1-0,2 mm), particule de alumină, kieselgur, nisip, materiale pe baza
de titan
 suspensia celulară este amestecată cu materialul abraziv și introdusă
într-un vortex (sute-mii rotații/minut)
 procesul este însoțit de creșterea temperaturii  răcirea vasului
 ultrasonicarea:
 se bazează pe utilizarea sunetelor de frecvență înaltă (> 20 Hz) aplicate
pulsatoriu
 spargerea celulelor  fenomene de forfecare la nivelul pereților celulari
 procesul este însoțit de creșterea temperaturii  răcirea vasului
Metode folosite pentru dezintegrarea celulară – metode chimice:
 permeabilizarea cu baze:
 se utilizează soluții de NaOH, KOH, Ca(OH)2
 se aplică în cazul probelor vegetale și microbiene
 se poate produce denaturarea proteinelor
 permeabilizarea cu detergenți:
 se utilizează detergenți ionici, amfionici, neionici
 permeabilizarea cu solvenți organici:

 se utilizează metanol, etanol, n-propanol, izopropanol
 se aplică în cazul probelor microbiene
Metode folosite pentru dezintegrarea celulară – metode enzimatice:
 aspecte generale:
 enzimele acționează selectiv
 trebuie cunoscute particularitățile structurale ale peretelui celular al
speciilor cu care se lucrează
 se utilizează anumite enzime sau amestecuri de enzime litice
 se aplică la: bacterii, levuri, microfungi, probe vegetale
 degradarea peptidoglicanului bacterian:

 glicozidaze (muraminidaze)
 endopeptidaze
 amidaze
 bacterii Gram-pozitive vs. bacterii Gram-negative:

 lizozimul nu se poate folosi la bacteriile Gram negative
Structura peretelui celular bacterian (bacterii Gram-pozitive & Gram-negative)
Observații:
• bacteriile Gram-pozitive  liză cu ajutorul lizozimului

• bacteriile Gram-negative:
• permeabilizare a membranei externe  detergenți
• liză cu ajutorul lizozimului
Etape preliminare în purificarea enzimelor:
 tipuri de medii din care enzima trebuie purificată:

 mediul de cultură din fermentator  enzimă extracelulară
 extract proteic total  enzimă intracelulară
 situații posibile:
 enzimă extracelulară  separarea enzimei de celule
 enzimă intracelulară  separarea enzimei de fragmentele celulare
 obiective înainte de purificare enzimei de interes:

 eliminarea biomoleculelor contaminante (glucide, lipide, acizi nucleici)
 eliminarea celulelor și a fragmentelor celulare
 avantajul microorganismelor ce secretă enzima în spațiul extracel

Metode de eliminare a acizilor nucleici: Etapa 4
 probleme create de acizii nucleici  cresc vâscozitatea mediului
 metode fizice de eliminare:

 denaturare termică
 există riscul denaturării proteinelor
 metode chimice de eliminare:

 se utilizează compuși încărcați pozitiv (policationi)
 complexele rezultate au solubilitate scăzută și se îndepărtează prin
centrifugare
 exemple: protamine, sulfat de streptomicină
 metode enzimatice de eliminare:

 se utilizează nucleaze (pancreas bovin)
 fragmentele de acizi nucleici se îndepărtează în etapele ulterioare
Metode de eliminare a celulelor și a fragmentelor celulare: Etapa 5
 eliminarea celulelor și a fragmentelor celulare:

 filtrare
 centrifugare • kieselgur
 extracție lichid-lichid • perlită
• celuloză
 filtrarea:
 permite îndepărtarea dintr-un mediu lichid a unor particule în suspensie
 factori ce influențează rata de filtrare:
 suprafața filtrantă
 presiunea aplicată
 vâscozitatea mediului supus filtrării
 rezistența opusă de filtru și precipitat
 variante practice:
 filtrare la vid
 cross-flow filtration
 dead-end filtration
Metode de eliminare a celulelor și a fragmentelor celulare:
 dead-end filtration:
 direcția de curgere este perpendiculară pe suprafața filtrantă
 acumularea precipitatului scade eficiența procesului
 cross-flow filtration:
 direcția de curgere este paralelă cu suprafața filtrantă
 precipitatul ne se acumulează, ci este eliminat permanent
Metode de eliminare a celulelor și fragmentelor celulare:
 filtrare la vid:
 se utilizează filtre rotatorii
 se realizează o filtrare în sistem continuu a unor volume mari de lichid
Metode de eliminare a celulelor și fragmentelor celulare:
 centrifugare:
 permite îndepărtarea dintr-un mediu lichid a unor particule aflate în
suspensie (celule, fragmente celulare, macromolecule) prin aplicarea
unei forțe centrifuge
 celulele bacteriene cu Ø = 0,5 μm sedimentează cu o rată de < 1 mm/h
 factorii ce influențează separarea prin centrifugare:
 dimensiunile particulelor aflate în suspensie
 conținutul în material solid al suspensiei
Concentrarea enzimelor: Etapa 6
 concentrația enzimelor în materia primă este relativ scăzută

Permit eliminarea diferiților agenți
 metode de concentrare: contaminanți (organici și anorganici)
 metode termice
 precipitare
 desalifiere
 concentrare prin metode termice:

 se utilizează evaporatoare rotative
 se lucrează la temperatură moderată pentru a evita denaturarea
 concentrare prin precipitare:

 precipitarea este rezultatul modificării interacțiilor dintre grupările polare
(ionizabile & neionizabile) și solvent (apa)
 alterarea interacțiilor: modificarea pH, tărie ionică, const. dielectrică
precipitarea fracționată cu
Concentrarea prin precipitare: (NH4)2SO4
 precipitare prin modificarea tăriei ionice:

 proteinele au o solubilitate relativ scăzută în apă pură
 solubilitatea proteinelor depinde de tăria ionică (J) a mediului:
 solubilitatea proteinelor:
 crește la concentrații mici de sare (SALTING IN)
 scade la concentrații mari de sare (SALTING OUT)
 precipitarea prin modificarea pH-ului:

 proteinele au solubilitate minimă la pI
 precipitarea prin modificarea constantei dielectrice:

 se utilizează solvenți organici miscibili cu apa (EtOH, acetonă)
 acești solvenți au constante dielectrice mici
 se lucrează la temperatură apropiată de 0°C pentru a preveni
denaturarea proteinelor
Concentrarea prin desalifiere:
 se realizează prin dializă:

 procedeu ce permite separarea moleculelor dintr-un amestec cu ajutorul
unei membrane semi-permeabile (acetat de celuloză, nitroceluloză)
 etapele dializei:
 soluția ce conține enzima de interes este introdusă în sacul de dializă
 sacul de dializă este plasat într-un tampon de molaritate cunoscută
 după un anumit interval de timp concentrația speciilor cu masă
moleculară mică se echilibrează pe cele două fețe ale membranei
 sacul de dializă se plasează într-o soluție proaspătă de tampon
 etapele se repetă până se îndepărtează complet speciile chimice cu
masă moleculară mică
Purificarea enzimelor: Etapa 7
 după parcurgerea etapelor 1-6 se obține un amestec ce conține:

 enzima de interes
 diferite alte proteine contaminante
 obiectivele unui protocol de purificare:

 randament maxim
 conservarea unei proporții cât mai mari a activității enzimatice
 atingerea unui grad cât mai mare de puritate pentru enzima de interes
 protocolul de purificare:
 se optimizează prin încercări preliminare
 reflectă compromisul între randamentul purificării și gradul de puritate
al enzimei
 enzimele cu aplicații în industriile alimentară, farmaceutică și de analiză
trebuie obținute cu grade foarte mari de puritate
Purificarea enzimelor – clasificarea metodelor:
 funcție de volumul de probă:

 metode preparative
 metode analitice
 funcție de caracteristicile exploatate:

 solubilitate
 sarcină electrică
 polaritate
 dimensiunea moleculei
 afinitatea față de anumiți liganzi
 observații:
 proprietățile generale permit separarea de contaminanții non-proteici
 proprietățile particulare permit separarea doar a enzimei de interes
Centrifugarea:
 permite separarea macromoleculelor (proteine, acizi nucleici, lipide)

aflate într-o suspensie, prin sedimentare sub acțiunea unei forțe
centrifuge (1.000.000Xg)
 separarea prin centrifugare depinde de:

 densitatea mediului
 volumul particulelor aflate în suspensie
 masa particulelor
 variante practice:
 centrifugare diferențială
 centrifugare în gradient de densitate
Centrifugarea:
 centrifugarea diferențială:
 se utilizează în etapele preliminare de purificare
 generează:
 sediment – fragmente celulare
 supernatant – soluție ce conține biomolecule în soluție
 sedimentul și supernatantul se pot folosi în etapele ulterioare
 centrifugarea în gradient de densitate:

 se utilizează un gradient de densitate
 generarea gradientului: zaharoză, CsCl
 proteinele din amestec migrează până în zona cu aceeași densitate
 observații:
 centrifugarea nu se poate aplica pe scară largă
Cromatografia de excludere moleculară:
 permite separarea macromoleculelor în funcție de:

 masa moleculară
 forma moleculelor
 poate fi aplicată în două variante în funcție de faza mobilă:

 gel filtrare – solvent apos
 cromatografie de permeație prin gel – solvent organic/amestec
 faza staționară:
 dextran:
 polizaharidă pe bază de D-glucoză (Leuconostoc mesenteroides)
 agaroză:
 polizaharidă pe bază de D-glucoză și 3,6-anhidro-L-galactoză (alge roșii)
 poliacrilamidă
Cromatografia de excludere moleculară:
 limita de excludere:
 masa moleculară a celei mai mici molecule ce nu poate pătrunde în porii
materialului fazei staționare
 principiul separării:
 masă moleculară < limita de excludere:
 moleculele sunt eluate în ordinea masei moleculare
 moleculele cele mai mari sunt eluate primele (cel mai mic timp de retenție)
 masă moleculară > limita de excludere:
 moleculele traversează faza staționară
 moleculele nu intră în porii fazei staționare
 poate fi utilizată și pentru determinarea masei moleculare dar nu

are precizie foarte bună
Cromatografia de schimb ionic:
 permite separarea macromoleculelor în funcție de sarcina electrică
 principiul funcționării:
 ionii legați electrostatic la faza staționară încărcată electric sunt dați la o
parte de alți ioni dintr-o soluție
 poate fi aplicată în două variante:

 anionit:
 faza staționară este funcționalizată cu grupări încărcate pozitiv
 leagă doar anioni (anion exchanger)
 cationit:
 faza staționară este funcționalizată cu grupări încărcate negativ
 leagă doar cationi (cation exchanger)
Cromatografia de schimb ionic:
 sarcina proteinelor este influențată de pH-ul și tăria ionică a mediului
 strategia separării:
 modificarea pH-ului:
 anioniți – soluții tampon cu pH din ce în ce mai scăzut  diminuarea
sarcinilor negative ale proteinelor
 cationiți – soluții tampon cu pH din ce în ce mai crescut  diminuarea
sarcinilor pozitive ale proteinelor
 modificarea tăriei ionice:
 se crește concentrația de NaCl din faza mobilă
 ionii de sare competiționează cu proteinele pentru legare la faza staționară
 proteinele cu sarcină scăzută vor fi eluate la tărie ionică mică
 proteinele cu sarcină puternică vor fi eluate la tărie ionică mare
Cromatografia de afinitate:
 exploatează o proprietate biologică a proteinelor
 proteina de interes se leagă specific și necovalent la un ligand
 permite atingerea unor grade înalte de purificare
 faza staționară:
 caracteristici:
 inertă din punct de vedere chimic
 porozitate accentuată
 prezența unui mare număr de grupări funcționale (-OH)
 funcționalizare:
 atașarea covalentă a unui ligand la faza staționară
 faza mobilă:
 amestec de solvenți
Cromatografia de afinitate:
 tipuri de liganzi:
 substrate, cofactori enzimatici, inhibitori competitive – enzime
 antigene – anticorpi
CROMATOGRAFIE DE
 hormoni – receptori hormonali IMUNOAFINITATE
 spacer-ul grefat pe faza staționară:

 catenă cu număr variabil de atomi (≈ 12 atomi)
 previne apariția unor impedimente sterice care ar putea împiedica
apropierea moleculelor de enzimă de faza staționară
 strategia separării:
 adăugarea în faza mobilă a unui ligand pentru care proteina de interes
are afinitate mai mare decât pentru ligandul de pe faza staționară
 modificarea pH-ului sau temperaturii fazei mobile
Cromatografia covalentă
Cromatografia de afinitate
Criterii de puritate în separarea enzimelor:
 preparatele enzimatice pot fi contaminate cu:

 acizi nucleici – se determină raportul DO280/DO260 (1,8 – 2,0)
 proteine – se determină activitatea specifică (AS)
 parametrii care se monitorizează în timpul purificării:

 activitatea enzimatică (AE) (UI/mL)
 concentrația proteică totală (mg/mL)
 activitatea specifică (AS) (UI/mg proteină)
 gradul de purificare
 randamentul purificării
Formularea preparatelor enzimatice:
 tipuri de formulări:
 lichide – soluții concentrate
 solide – tablete, particule
 formularea permite limitarea pierderii activității enzimatice în timpul:

 transportului
 stocării
 utilizării enzimei în procesul tehnologic
 alte aspecte legate de formulare:

 adăugarea de agenți antimicrobieni
 prevenirea precipitării unor componente (formulări lichide)
 prevenirea generării de particule sau aerosoli
 optimizarea aspectelor legate de culoare și miros

Enzimologie Aplicata (Partea 4)

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Enzimologie Aplicata (Partea 4)

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

CHIMIE ALIMENTARĂ ȘI TEHNOLOGII BIOCHIMICE

Producerea industrială a enzimelor

Conf. Dr. Biochim. Bogdan Nicolae Manolescu

Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

 surse de enzime pentru aplicații industriale:

 piața enzimelor cu aplicații industriale:

 tehnologia ADN recombinant permite:

 utilizarea enzimelor produse de extremofile:

 modificarea genomului  organisme modificate genetic (GMO)

 aplicații ale GMO:

 generarea GMO  tehnologia ADN recombinant

 strategii pentru combaterea deficienței de vitamină A:

 alimente cu conținut ridicat de vitamină A:

The Journal of Nutrition

 orez modificat genetic – ”Golden rice” 1 & 2:

Tehnologia ADN recombinant:

 izolarea genei de interes de la organismul donor

Tehnologia ADN recombinant:

Plasmide – prezentare generală:

 molecule de ADN dublu catenare circular (1-200 kb)

 conțin următoarele elemente:

Introducerea unei gene într-un vector de clonare:

Tehnologia ADN recombinant – producerea fosfolipazei A2:

 fosfolipaza A2 (EC 3.1.1.4):

 obținere prin biotehnologii:

Dezvoltarea de microorganisme recombinante:

 dezvoltarea tulpinii gazdă

Menținerea și stocarea culturilor microbiene:

 conservarea și stocarea se face prin înghețare

Producerea enzimei – fermentator:

 transferul culturii microbiene în fermentator se face treptat

 surse de izolare a enzimelor:

 purificare  localizarea enzimei:

Alegerea sursei biologice: Etapa 1

 localizarea enzimei de interes:

Alegerea sursei biologice:

 gradul de caracterizare a sursei biologice:

 alegerea sursei biologice se face ținând cont de cei patru factori

Extracția enzimei de interes: Etapa 2

 extracția enzimelor intracelulare necesită:

 compoziția mediului de extracție se optimizează prin încercări

Sistemul tampon – criterii de alegere:

 nu trebuie să lege cationi de care depinde enzima de interes:

 nu trebuie să reacționeze chimic cu subst. din mediul de extracție, cu

 nu trebuie să absoarbă în UV:

Tampoanele Good (tampoane biologice):

 substanțe hidrosolubile cu proprietăți tensioactive:

Utilizarea agenților reducători:

 enzimele ce conțin resturi de Cys (-SH) sunt sensibile la prezența O2

 protejarea grupărilor –SH de oxidare  agenți reducători

cel mai avantajos

 se lucrează cu concentrații de 10-25 mM pentru a reveni scindarea

Utilizarea agenților de complexare a cationilor:

 cationii metalelor tranziționale alterează funcția enzimelor prin:

 efectele negative sunt limitate prin:

* EDTA = acid etilendiaminotetraacetic

Utilizarea inhibitorilor de proteaze:

 celulele conțin proteaze ce pot degrada enzima de interes

 acțiunea proteazelor endogene poate fi limitată prin:

Utilizarea inhibitorilor de proteaze:

 mecanisme de acțiune ale inhibitorilor de proteaze:

Eliminarea interferențelor date de compușii fenolici – probe vegetale:

 oxidarea fenolilor din organismele vegetale: