Chimie Alimentară și Tehnologii Biochimice

Enzimologie aplicată

Valorificarea pielițelor de struguri – utilizarea enzimelor pentru extragerea compușilor fenolici

Aspecte generale:
Industria de vinificație generează cantități importante de deșeuri precum semințele și pielițele
de struguri. Aceste deșeuri au un conținut variabil de substanțe biologic active.
Pielițele de struguri conțin cantități importante de compuși bioactivi aparținând unor clase de
substanțe precum flavonoidele, antocianii, procianidinele, stilbenii etc.
Valorificarea acestor deșeuri ale industriei de vinificație permite utilizarea unor substanțe care
în mod uzual se pierd. Pe de altă parte, limitarea deșeurilor are un impact pozitiv asupra mediului în
contextul unei economii sustenabile.

Reactivi și materiale necesare:

1. preparat enzimatic pectinolitic (Pectinenex® Yieldmash Extra)
2. alcool etilic 96%
3. reactiv Folin-Ciocâlteu
4. soluție de Na2CO3 (200 g la 1 L de apă distilată)
5. soluție stoc de acid galic (100 µg/mL)
6. sticlărie: pahare Erlenmeyer
7. alte consumabile: tuburi Falcon (50 mL), tuburi Eppendorf (1,5 mL), eprubete
8. aparatură: agitatoare magnetice, vortex, spectrofotometru UV-Vis
9. stative și cleme

Mod de lucru:
Se curăță cu grijă coaja de pe aproximativ 20 boabe de struguri pentru a colecta o cantitate de
aproximativ 20 g de pieliță.
Cantitatea se repartizează în mod egal în două pahare Erlenmeyer notate ”E-” și ”E+” pentru a
sugera absența și respectiv prezența tratamentului enzimatic.
În ambele pahare se adaugă câte 18 mL de apă distilată. Apoi, în paharul ”E-” se mai adaugă
încă 2 mL de apă distilată, în timp ce în paharul ”E+” se adaugă 2 mL de preparat enzimatic nediluat.
În fiecare pahar se introduce câte un magnet. Apoi, fiecare pahar se așează pe câte un agitator
magnetic și se fixează într-o clemă pentru a preveni răsturnarea.

1
 Se pornesc agitatoarele și se cronometrează 30 de minute. După acest interval de timp în
fiecare pahar se mai adaugă câte 2 mL de etanol 96%. Se pornesc din nou agitatoarele pentru încă 20
de minute.
În final, conținutul fiecărui pahar se varsă într-un tub Falcon și se lasă în repaus 10 minute
pentru a permite sedimentarea particulelor aflate în suspensie. Se observă diferențele de culoare.
Din fiecare tub Falcon se prelevează câte un volum de 1300 µL, se introduc în două tuburi
Eppendorf și se centrifughează timp de 10 minute la 10.000 de rpm la temperatura de 4°C.
Se notează două eprubete ”E-” și ”E+” și se pipetează în fiecare după cum urmează: 100 µL
probă (fără tratament enzimatic și respectiv cu tratament enzimatic), 500 µL de reactiv Folin-Ciocâlteu
diluat 1/10 și 1500 µL de apă. Se incubează timp de 5 minute. Apoi, se adaugă în fiecare eprubetă câte
un volum de 1500 µL de soluție de Na2CO3. După adăugarea fiecărui reactiv se vortexează eprubetele.
Se incubează eprubetele 2 ore și apoi se citește absorbanța celor două soluții față de un blank
la 746 nm.
Rezultatele se calculează folosind o curbă de calibrare realizată cu ajutorul unei soluții stoc de
acid galic de concentrație 100 µg/mL.

Soluție stoc de acid galic (µL) Apă distilată (µL) Concentrație acid galic (mg/L) Absorbanță
0 1600
100 1500
200 1400
300 1300
400 1200
500 1100
600 1000

În fiecare eprubetă se adaugă un volum de 500 µL de reactiv Folin-Ciocâlteu și se incubează 5

minute. Apoi, se adaugă 1500 µL de soluție de Na2CO3 și se incubează 2 ore. După adăugarea fiecărui
reactiv se vortexează eprubetele.
În final, se citește absorbanța la 746 nm față de blank.
Se completează tabelul anterior și se realizează curba de calibrare. Ecuația curbei este folosită
pentru a calcula conținutul total de fenoli din cele două probe (”E-” și ”E+”).

Rezultatele experimentului:
Se atașează graficul curbei de calibrare și se trec concentrațiile obținute pentru cele două probe
luate în lucru.
De asemenea, se notează și observații privind culoarea filtratele celor două probe.

2
Descrierea preparatului enzimatic:

Preparatul enzimatic a fost oferit de către firma Gama Serv SRL