Enzimologie Aplicata (Partea 3)

CHIMIE ALIMENTARĂ ȘI TEHNOLOGII BIOCHIMICE
ENZIMOLOGIE APLICATĂ
Cinetica enzimatică
Metode de determinare a activității enzimelor
Conf. Dr. Biochim. Bogdan Nicolae Manolescu
Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

Departamentul de Chimie Organică ”C. Nenițescu”
Laborator 013, Corp F, Campus Polizu
Cinetica chimică:
 ramură a chimiei-fizice care se ocupă de studiul vitezei reacțiilor ch.

Reacție de ordinul I (unimoleculară)
 situații posibile:
 transformare A  P:
 transformare 2A  P:
Reacție de ordinul II (bimoleculară)
 transformare: A + B  P: Reacție de ordinul II (bimoleculară)
k = constanta de viteză (M*s-1, M-1*s-1)

Reprezentarea grafică a variației vitezei de reacție:
 v = f([A]): A  P
 v crește linear cu creșterea [A]
 v = f([S]): S  P
 viteza crește cu creșterea [S]
 viteza nu mai crește la creșteri suplimentare ale [S]
SATURAREA
ENZIMEI
Reacție de ordinul I
Reacție de ordinul 0
Prelucrarea matematică a datelor – Adrian Brown (1902):
 studiază hidroliza zaharozei de către zaharază
 observații:
 când [zaharoză] > [zaharază]  viteza este independentă de
[zaharoză]
 concluzii:
 reacția globală este compusă din două reacții elementare
 expresia vitezei de reacție:

Prelucrarea matematică a datelor:
 principiul de echilibru (Michaelis & Menten, 1913):
k-1 >> k2
 principiul stării staționare (Briggs & Haldane, 1925):
Pentru un interval de
timp [ES] este constantă!
vmax este atinsă în momentul în
Prelucrarea matematică a datelor:
care enzima este saturată cu
substrat (toată cantitatea de E se
găsește sub formă de ES)
 viteza maximă (vmax):
ECUAȚIE
 viteza de reacție (v0):
MICHAELIS-MENTEN
 interpretarea ecuației Michaelis-Menten:

 [S] < KM  v0 = vmax[S]/KM (reacție de ordinul I)
 [S] > KM  v0 = vmax (reacție de ordinul 0)
Fază de depleție a substratului:
• [ES] – scade, [S] – scade, [P] - constantă
Fază prestaționară:
Fază staționară:
• [E] – scade, [ES] – crește
• milisecunde
• [ES] – constantă, [S] – scade, [P] –
crește
• minute
Semnificațiile constantelor cinetice (KM și vmax):
 KM și vmax – sunt constante pentru un cuplu E-S  pentru aceeași

enzimă se obțin valori diferite ale KM și vmax în funcție de S utilizat
 constanta Michaelis-Menten (KM):

 valori cuprinse între 10-1 și 10-7 moli/L
 valoarea KM depinde de: substrat, pH, temperatură, tărie ionică
 semnificația KM:
 [S] la care se atinge ½ din vmax
 afinitatea enzimei pentru substrat
 afinitatea enzimei pentru substrat:

 valoare mare a KM  afinitate mică pentru S
 valoare mică a KM  afinitate mare pentru S
R160Q = Arg  Gln
R160K = Arg  Lys

Afinitate mică pentru S!
Afinitate mare pentru S!

Semnificația KM – metabolizarea etanolului:
 metabolizarea etanolului:
 microzomi – citocromul CYP2E1
 citosol – alcool dehidrogenază (ADH)
 mitocondrie – aldehid dehidrogenază (ALDH)
Semnificația KM – metabolizarea etanolului: metanol – KM = 7 mM

etanol – KM = 0,7 mM
 ADH:
 există mai multe izoenzime organizate în 4 clase (I, II, III, IV)
 aloenzimele ADH2: Metabolizează rapid EtOH!
 ADH2*1 – populație caucaziană (95%)
 ADH2*2 – populații asiatice (japonezi, chinezi, coreeni) (90%)
 ADH2*3 – populații africane și afroamericane (24%)
 ALDH:
 există mai multe izoenzime implicate în oxidarea aldehidelor simple
 ALDH2: Metabolizează lent acetaldehida!
 polimorfism genetic Glu487  Lys487
 afectează populațiile asiatice  scade afinitatea pentru aldehidă
 consecințe fiziologice:
 se acumulează acetaldehidă
 apare roșeața în obraji (eliberare de histamină)
Dezavantajele reprezentării Michaelis-Menten:
 pentru determinarea valorilor KM și vmax trebuie utilizate concentrații

saturante de S  concentrație infinită!!!
 concentrația saturantă nu poate fi atinsă practic:

 E poate fi inhibată la concentrații mari de S
 E poate fi inhibată nespecific la tărie ionică mare
 S are o solubilitate limitată
 practic se lucrează cu [S]

cuprinse între 0,5KM și 5KM
Linearizări ale ecuației Michaelis-Menten:
 permit determinarea cu acuratețe a valorilor KM și vmax
 prelucrarea Lineweaver-Burk:
 reciproca ecuației Michaelis-Menten
 prelucrarea Eadie-Hofstee
 prelucrarea Hanes
 prelucrarea Eisenthal-Cornish-Bowden
Probleme:
 O enzimă are KM = 1 mM și vmax = 5 nM*s-1 pentru un anumit

substrat. Care este valoarea v0 pentru concentrații de substrat
egale cu 0,25 nM, 1,5 mM și 10 mM?
 S-a realizat un experiment de cinetică enzimatică și s-au obținut

valorile din tabelul de mai jos. Să se calculeze valorile celor două
constante cinetice.
Clasificarea reacțiilor enzimatice funcție de numărul de substrate:
Uni – Uni
 reacții monosubstrat: Uni – Bi
 40% din totalul reacțiilor enzimatice Uni – Ter
 reacții de forma: Bi – Bi
Bi – Ter
 reacții bisubstrat:
 60% din totalul reacțiilor enzimatice Reacție de transfer
 reacții de forma:
 clasificarea reacțiilor bisubstrat:

 reacții secvențiale:
 cu mecanism ordonat
 cu mecanism aleator
 reacții Ping-Pong
Reacție redox
Reacții secvențiale:
 ambele molecule de substrat trebuie să se lege la enzimă înainte de

a avea loc transformarea propriu-zisă și eliberarea produșilor
 se mai numesc și reacții de monosubstituție (single displacement)
 clasificare:
 reacții secvențiale cu mecanism ordonat: DEHIDROGENAZE
 reacții secvențiale cu mecanism aleator:

KINAZE
Reacții secvențiale:
 reacția catalizată de lactat dehidrogenază:
 reacția catalizată de creatin kinază:

Reacții Ping-Pong:
 unul sau mai mulți produși de reacție se eliberează înainte de

legarea ambelor molecule de substrat
 se mai numesc și reacții de dublă substituție (double displacement)

Factori ce afectează activitatea enzimatică:
 concentrația de enzimă:
 S trebuie să fie în exces  viteza independentă de [S]
 [S] este menținută constantă de-a lungul experimentului
 [E] este crescută treptat de-a lungul experimentului
 concentrația de substrat:
 S trebuie să fie în exces  viteza independentă de [S]
 [E] este menținută constantă de-a lungul experimentului
 [S] este crescută treptat de-a lungul experimentului
Factori ce afectează activitatea enzimatică:
 efectori allosterici:
 substanțe cu masă moleculară mică
 se leagă la situsul allosteric
 pot stimula (efectori pozitivi) sau inhiba (efectori negativi)
 cofactori și coenzime:
 necesari pentru activitatea enzimatică
 inhibitori:
 vezi inhibiția enzimatică
 pH-ul
 temperatura
Factori ce influențează activitatea enzimelor – pH-ul:
 activitatea enzimatică – domeniu îngust de pH (pHoptim)
 utilizarea sistemelor tampon de pH:

 permite menținerea pH soluției în domeniul de pHoptim
 împiedică diminuarea/pierderea activității enzimatice
Factori ce influențează activitatea enzimelor – temperatura:
 efectele creșterii temperaturii mediului de reacție:

 scăderea energiei de activare
 creșterea vitezei de reacție
 ecuația lui Arrhenius:
 pentru fiecare 10°C viteza de reacție crește de 2 ori
 peste 50°C începe denaturarea termică:

 excepție organismele termofile
Inhibiția enzimatică
Inhibiția enzimatică:
 inhibitorii enzimatici influențează:

 legarea substratului/substratelor la enzimă
 viteza de transformare a substratului/substratelor
 tipuri de inhibiție enzimatică: Inhibitorul se leagă IREVERSIBIL la enzimă!

 inhibiție ireversibilă
 inhibiție reversibilă:
 competitivă Inhibitorul se leagă REVERSIBIL la enzimă!
 necompetitivă
 importanța inhibiției enzimatice:

 reglarea activității enzimelor in vivo
 terapia prin blocarea selectivă a unor enzime
 controlul diferitelor procese biotehnologice
Inhibiția ireversibilă:
 consecința acțiunii inhibitorilor ireversibili
 mecanismul de acțiune al inhibitorilor ireversibili:

 modifică covalent resturi de aminoacizi din centrul catalitic
 efectul inhibitorilor ireversibili:

 pierderea totală a activității enzimatice
Inhibiția reversibilă competitivă:
 caracteristici generale:
 inhibitorul este analog structural al substratului
 inhibitorul se leagă la centrul catalitic activ
 inhibitorul blochează accesul substratului la centrul catalitic activ
 consecințele legării inhibitorului la enzimă:

 scade afinitatea enzimei pentru substrat  crește valoarea KM
 vmax nu se modifică
Inhibiția reversibilă competitivă – sulfonamidele:
 acidul folic:
 este sintetizat de organismele vegetale și microorganisme
 organismul uman nu îl poate sintetiza
 forma biologic activă a acidului folic – acidul tetrahidrofolic (THF):

1,3-diazină (PIRIMIDINĂ) 1,4-diazină (PIRAZINĂ)

 reducerea acidului folic la THF  dihidrofolat reductază:
 rolurile biologice ale THF:

 transferul unităților cu un atom de carbon
 s
Inhibiția reversibilă necompetitivă:
 inhibitorul nu este analog structural al substratului
 inhibitorul se leagă la un centru diferit de centrul catalitic activ
 inhibitorul se leagă doar la complexul ES

 scade vmax
 scade KM
Inhibiția reversibilă noncompetitivă:
 inhibitorul nu este analog structural al substratului
 inhibitorul se leagă la E sau la complexul ES

 scade vmax
Metode de determinare a activității enzimatice
Determinarea activității enzimatice:
 necesită punerea la punct a unui protocol experimental prin care să

fie posibilă detecția unui semnal analitic dependent de concentrația:
 de substrat/e (A sau B)  scade în timp
 de produs/i (P sau Q)  crește în timp
 se preferă monitorizarea unui semnal dependent de produs:

 [A]inițail = [B]inițial ≠ 0
 [P]inițial = [Q]inițial = 0
 clasificarea metodelor de determinare a activității enzimatice:

 în funcție de semnalul analitic
 în funcție de modul de evidențiere a substratului/produsului
Clasificarea metodelor în funcție de semnalul analitic:

• metode accesibile
• nu necesită aparatură și
 metode spectrometrice: reactivi costisitori
 metode pe spectrometria de absorbție UV/Vis
 metode fluorimetrice
• metode mai sensibile
 metode luminometrice • necesită aparatură și reactivi costisitori
 metode polarimetrice
• metode mai sensibile
• necesită aparatură și reactivi costisitori
 metode electrometrice:
 metode pH-metrice
 metode potențiometrice • metode sensibile
 metode polarografice • aplicabilitate limitată (unități speciale)
 metode radiometrice • metodă ieșită din uzul curent
 alte tipuri de metode: cromatografice, electroforetice, calorimetrice

Clasificarea metodelor în funcție de modul de evidențiere a semnalului:
 metode continue:
 semnalul se monitorizează continuu pe un interval de timp
 exemplu: LDH, GOT
 metode discontinue:
 semnalul nu se monitorizează continuu pe un interval de timp
 etape:
 reacția enzimatică este stopată cu un agent de stopare
 se prelevează o probă din mediul de reacție
 se determină concentrația de S/P (direct sau indirect)
 exemplu: amilază
Clasificarea metodelor în funcție de modul de evidențiere a S/P:
 metode directe:
 se poate monitoriza direct un semnal analitic funcție de variația [S]/[P]
 exemplu: LDH
↑ absorbanța la 340 nm
↓ absorbanța la 340 nm
 metode indirecte:
 nu se poate monitoriza direct niciun semnal analitic funcție de [S]/[P]
 soluții practice:
 derivatizarea unui produs de reacție și dozarea sa
 cuplarea cu altă reacție enzimatică
 exemplu: hexokinază, GOT
Tehnica reacțiilor cuplate:
 permite cuplarea a două sau trei reacții enzimatice
 exemple: hexokinaza, GOT, 6-fosfofructo-1-kinază
↑ absorbanța la 340 nm
 observații:
 substratul celei de a doua enzime nu trebuie să fie limitant
 concentrația enzimei de cuplare nu trebuie să fie limitant
Tehnica reacțiilor cuplate:
Exprimarea activității enzimatice
Exprimarea activității enzimatice:
 observații:
 viteza unei reacții este proporțională cu cantitatea de enzimă
 viteza unei reacții este un indicator al cantității de enzimă
 unitatea internațională (UI):

 cantitatea de enzimă ce catalizează transformarea a 1 micromol de S în
timp de 1 minut în condiții standard de pH, temperatură
 katalul (kat):
 cantitatea de enzimă ce catalizează transformarea a 1 mol de S în timp
de 1 secundă în condiții standard de pH, temperatură

Enzimologie Aplicata (Partea 3)

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Enzimologie Aplicata (Partea 3)

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

CHIMIE ALIMENTARĂ ȘI TEHNOLOGII BIOCHIMICE

Conf. Dr. Biochim. Bogdan Nicolae Manolescu

Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

 ramură a chimiei-fizice care se ocupă de studiul vitezei reacțiilor ch.

 transformare: A + B  P: Reacție de ordinul II (bimoleculară)

k = constanta de viteză (M*s-1, M-1*s-1)

Reprezentarea grafică a variației vitezei de reacție:

Prelucrarea matematică a datelor – Adrian Brown (1902):

 studiază hidroliza zaharozei de către zaharază

 expresia vitezei de reacție:

Prelucrarea matematică a datelor:

 principiul de echilibru (Michaelis & Menten, 1913):

 principiul stării staționare (Briggs & Haldane, 1925):

 interpretarea ecuației Michaelis-Menten:

Fază de depleție a substratului:

• [ES] – scade, [S] – scade, [P] - constantă

Semnificațiile constantelor cinetice (KM și vmax):

 KM și vmax – sunt constante pentru un cuplu E-S  pentru aceeași

 constanta Michaelis-Menten (KM):

 afinitatea enzimei pentru substrat:

R160Q = Arg  Gln

R160K = Arg  Lys

Afinitate mică pentru S!

Afinitate mare pentru S!

Semnificația KM – metabolizarea etanolului:

Semnificația KM – metabolizarea etanolului: metanol – KM = 7 mM

Dezavantajele reprezentării Michaelis-Menten:

 pentru determinarea valorilor KM și vmax trebuie utilizate concentrații

 concentrația saturantă nu poate fi atinsă practic:

 practic se lucrează cu [S]

Linearizări ale ecuației Michaelis-Menten:

 permit determinarea cu acuratețe a valorilor KM și vmax

 O enzimă are KM = 1 mM și vmax = 5 nM*s-1 pentru un anumit

 S-a realizat un experiment de cinetică enzimatică și s-au obținut

Clasificarea reacțiilor enzimatice funcție de numărul de substrate:

 clasificarea reacțiilor bisubstrat:

 ambele molecule de substrat trebuie să se lege la enzimă înainte de

 se mai numesc și reacții de monosubstituție (single displacement)

 reacții secvențiale cu mecanism aleator:

 reacția catalizată de lactat dehidrogenază:

 reacția catalizată de creatin kinază:

 unul sau mai mulți produși de reacție se eliberează înainte de

 se mai numesc și reacții de dublă substituție (double displacement)

Factori ce afectează activitatea enzimatică:

Factori ce afectează activitatea enzimatică:

Factori ce influențează activitatea enzimelor – pH-ul:

 activitatea enzimatică – domeniu îngust de pH (pHoptim)

 utilizarea sistemelor tampon de pH:

Factori ce influențează activitatea enzimelor – temperatura:

 efectele creșterii temperaturii mediului de reacție:

 ecuația lui Arrhenius:

 pentru fiecare 10°C viteza de reacție crește de 2 ori

 peste 50°C începe denaturarea termică:

 inhibitorii enzimatici influențează:

 tipuri de inhibiție enzimatică: Inhibitorul se leagă IREVERSIBIL la enzimă!

 importanța inhibiției enzimatice:

 consecința acțiunii inhibitorilor ireversibili

 mecanismul de acțiune al inhibitorilor ireversibili:

 efectul inhibitorilor ireversibili:

Inhibiția reversibilă competitivă:

 consecințele legării inhibitorului la enzimă:

Inhibiția reversibilă competitivă – sulfonamidele:

 forma biologic activă a acidului folic – acidul tetrahidrofolic (THF):

k = constanta de viteză (Ms-1, M-1s-1)