TEMA 2: BIOTEHNOLOGIA OBINERII PREPARATELOR

ENZIMATICE
4. Liaze, care catalizeaz scindarea
legrutilor chimice altfel dect prin hidroliz
sau oxidare;
5. Izomeraze ce catalizeaz rearanjarea
structural a moleculelor;
6. Ligaze sau sintetaze care catalizeaz
formarea de noi legturi te tip C-N, C-O, CC, C-S, cu consumare de ATP.

2.1. Aspecte generale

Enzimele sunt din punct de vedere
structural proteine constituite din aminoacizi,
iar din punct de vedere funcional acioneaz
ca nite biocatalizatori biologici care au rolul
de a permite realizarea unor reacii cu o vitez
mrit.
Enzimele sunt utilizate drept catalizatori n
condiiile n care exist i catalizatori chimici,
deoarece prezint urmtoarele avantaje:
1. Au capacitatea de a cataliza reaciile
chimice n condiii blnde de temperatur, pH,
presiune. Aceasta permite un consum mai redus
de energie i nu necesit echipamente scumpe
rezistente la coroziune.
2. Enzimele sunt catalizatori specifici,
deseori stereoselective, care nu conduc la
obinerea de produi de reacie secundari
nedorii. n aceste condiii nu sunt necesare
cheltuieli mari privind rafinarea i purificarea
produsului ce urmeaz a fi fabricat.
3. Comparativ cu procesele chimice,
enzimele sunt din punctul de vedere al mediului
compui biodegradabili care nu necesit costuri
semnificative de epurare.
4. Anumite enzime nu sunt limitate numai
la aciunea n mediul apos, putnd aciona i la
interfaa dintre dou faze, ap: solvent organic
sau ap:ulei etc.
Totui exist i o serie de dezavantaje:
au stabilitate limitat;
de cele mai multe ori sunt utilizate
industrial o singur dat.
Clasificarea enzimelor. Enzimele se
clasific conform sistemului stabilit de Comisia
de Enzime a Uniunii Internaionale de
Biochimie (1979). Conform acestei clasificri
exist 6 clase principale grupate conform cu
reaciile pe care le catalizeaz astfel:
1. Oxidoreductaze care catalizeaz reacii
de oxidoreducere, transfer de atomi de
hidrogen, oxigen sau electroni;
2. Transferaze care catalizeaz transferul
unei grupri de pe o molecul pe alta;
3. Hidrolaze ce catalizeaz scindarea
hidrolitic (implic apa) a legturilor chimice
covalente;

2.2. Utilizri ale enzimelor n industrie:

Principalele domenii n care enzimele i-au
gsit utilizri sunt:
- fabricarea
unor
produse
prin
transformarea enzimatic a amidonului;
- la fabricarea altor produse alimentare :
produse lactate, bere, sucuri, vin,
panificaie;
- n compoziia detergenilor;
- industria textil, hrtiei i a furajelor
pentru animale;
- sinteza catalitic a unor substane
chimice;
- analiza alimentelor, diagnoz chimic
i terapie;
- inginerie genetic.
Biotehnologia preparatelor enzimatice este
un domeniu de baz al biotehnologiei, avnd
drept scop studierea tehnicilor de obinere a
preparatelor enzimatice folosind materii prime
de origine animal, vegetal i microbian, sub
form liber sau imobilizat pentru a fi folosite
ca ageni biologici n industria alimentar,
industria
furajelor,
industria
textil,
detergenilor,
farmaceutic,
cosmetic,
chimic, etc. Prin utilizarea preparatelor
enzimatice, tehnologiile tradiionale se
transform n biotehnologii, devenind mai
eficiente i mai puin poluante.
n figura 2.1 este prezentat ponderea de
utilizarea a preparatelor enzimatice n diferite
ramuri.
Aa cum se observ din datele de mai sus,
cea mai mare pondere o are utilizarea n
industria alimentar, urmat de industria
detergenilor.
n figura 2.2 sunt prezentate principalele
tipuri de preparate enzimatice produse pe plan

sursele din care se obin i aplicaile n industria

alimentar.

mondial.
Cea mai mare pondere o au
preparatele de proteaze urmate de amilaze.

2.4. Surse de enzime

Preparatele fabricate la scar industrial
folosesc trei tipuri de surse: esuturi animale i
vegetale sau microorganisme.
Sursele animale sunt reprezentate de
subprodusele din industria crnii (ficat,
pancreas, inim, rinichi, creier, mucoas
stomacal i intestinal). Utilizarea acestr surse
este pe scar din ce n ce mai redus, fiind
nlocuite de sursele microbiene, deoarece
sursele animate prezint o serie de dezavantaje,
cum ar fi: producia limitat, apariia unor boli
cum ar fi encefalopatia spongiform la bovine.
Principalele enzime de origine animal care
se obin sub form de preparate sunt chimozin
(renina) care se extrage din stomacul de miel
sau viei care se utilizeaz pentru coagularea
laptelui la fabricarea brnzeturilor. O alt
enzim este -amilaza pancreatic care are
utilizri n industria farmaceutic.
Sursele vegetale sunt reprezentate de
semine(germinate sau negerminate), rdcini,
fructe, sev, latexuri, frunze. Utilizarea surselor
vegetale pentru obinerea preparatelor
enzimatice ridic o serie de probleme, cum ar
fi: prezena unor substane potenial duntoare
sntii omului (ex. Compuii fenolici) sau a
unor compui toxici de comtaminare. Aceste
dezavantaje face ca sursele de origine vegetal
s fie destul de puin utilizate. Principalele
enzime obinute din surse vegetale sunt.
- papaina, proteaz obinut din latexul
fructelor de Caryca Papaia. Enzima este
utilizat pentru tenderiyarea crnii sau n
industria berii;
- ficina, proteaz obinut din latexul
fructului de smochin (Ficus carica), utilizat
pentru degradarea proteinelor miofibrilare.
- bromelina, proteaz obinut din sucul de
ananas ( Ananas comosus ), folosit pentru
hidroliya proteinelor colagenice.
Alte enzime de origine vegetal sunt
lipoxigenaza din soia i complexul enzimatic
din mal ( amilaze, proteaze, glucanaze).
Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu
sunt purificate, fiind sub form de fin de soia
sau de mal.
Microorganismele reprezint principala
surs pentru obinerea de preparate enzimatice.

Alte domenii; 6
Morarit,
panificatie; 5
Amidon; 30

Sucuri, vinuri; 10
Bere; 4

Distilate; 5
Produse lactate;
5

Detergenti; 35

Figura 2.1. Poderea utilizrii preparatelor

enzimatice

Alte enzime; 4
Pectinaze; 10

Glucozizomeraze;
14
Amilaze fungice;
18

Proteaze fungice;
4

Amilaze bcteriene;
10
Proteaze
bacteriene; 35

Proteaze de
coagulare; 5

Figura 2.2. Principalele tipuri de preparate

enzimatice.
2.3. Tipuri de preparate enzimatice.
Preparatele enzimatice se comercializeaz
sub diverse forme i grade de purificare:
Preparate enzimatice solide:
1. Preparate enzimatice brute, sub form
de pulbere, obinute prin uscarea i mcinarea
mediului fermentat;
2. Preparate sub form cristalizat, enzime
pure utilizate preponderent n chimia analitic
i ingineria genetic;
3. Preparate liofilizate, care sunt enzime
purificate
n
amestec
cu
substane
crioprotectoare, care sunt urcate n vacum la
temperaturi de -20......-50C.
Preparate enzimatice lichide
1. Preparate enzimatice brute, form sub
care se livreaz enzimele extracelulare
(eliberate de ctre microorganisme n mediul de
cultur n timpul fermentaiei).
2. Preparate parial purificate, n care se
adaug conservani pentru a le mri stabilitatea
n timp.
In tabelul de mai jos sunt prezentate
principalele tipuri de preparate enzimatice,
2

Avantajele utilizrii microorganimelor constau

n:
- microorganismele se pot obine n cantiti
mari (biomas) prin cultivare n instalaii
speciale pe medii de cultur ieftine (tr de
gru, extract de porumb, melas, roturi de soia
sau floarea soarelui, zer),
- ciclul de dezvoltare al microorganismelor
este foarte scurt fa de cel al plantelor sau
animalelor;
- producia de enzime de ctre
microorganisme poate fi mrit prin selectarea
i utilizarea de tulpini mutante, nalt
performante (productive) i prin stabilirea
condiiilor optime fizice i chimice pentru
producerea de enzime;
- proprietile enzimelor i specificitatea de
aciune difer cu natura microorganismelor
productoare, astfel industrial se pot obine
preparate care corespund ntocmai scopului
dorit.
- preparatele enzimatice obinute pot avea
activiti diferite cu predominana unei
activiti.

producie, urmat de etapa fermentativ

prorpiu-zis.
3. Etapa de separare, purificare i
standardizare a enzimelor.
A. Pregtirea mediului de cultur
Materii prime utilizate pentru fabricarea
mediilor de cultur.
Materiile prime trebuie s asigure
principalii nutrieni microorganismelor n
vederea dezvoltrii lor n timpul fermentaiei.
Surse de carbon. Principala surs de
carbon
(surs
de
energie)
pentru
microorganisme o constituie glucidele, sub
form de glucoz, fructoz, galactoz care sunt
uor asimilabile, n timp ce maltoz, zaharoza
i lactoza sunt asimilate doar dac
microorganismele posed enzime capabile s le
transforme n monoglucide. Poliglucidele pot fi
utilizate doar de ctre microorganismele apte s
sitetizeze enzimele care s le hidrolizeze
extracelular n monoglucide capabili s
difuzeze prin membrana celular.
Ca surse de carbon n reetele mediilor
industriale se folosesc urmatoarele:
- Melasele care provin de la rafinarea
zahrului.
- Extractul de porumb, este reprezentat de
extractul obinut din industria amidonului dup
ce sufer o concentrare pn la 50% S.U.
- Leiile sulfitice provin din industria hrtiei
ca urmate a transformrii masei lemnoase n
pulp celulozic sub aciunea bisulfitului de
calciu.
Surse de azot. Azotul din mediul de cultur
are rol anabolic, participnd la biosinteza
proteinelor structurale, a enzimelor i acizilor
nucleici.
Principalele surse de azot sunt:
- azot anorganic: amoniac, sruri de
amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de
diamoniu,
- azot organic: hidrolizate proteice de
cazein, soia, carne etc.
Surse de ioni anorganici. Pentru
dezvoltarea microorganimelor n timpul
procesului de fermentaie este necesar
prezena ionilor anorganici, acetia reprezint
circa 8% din substana urcat a a celulelor
microbiene. Principalii ioni anorganici care
trebuie s fie prezeni n mediul de cultur sunt:
macronutrienii (azot, fosfor, sulf, potasiu, i

2.5.
Tehnologii
de
obinere
a
preparatelor enzimatice
Schema tehnologic general de obinere a
preparatelor enzimatice este prezentat n
figura Tehnologia de obinere a preparatelor
enzimatice implic operaiile indicate n
schema prezentat n fig. 1.4. din care rezult
ca preparatele enzimatice pot fi obinute sub
form de:
- preparate enzimatice brute-uscate;
- preparate enzimatice brute lichide
concentrate;
- preparate enzimatice purificate
concentrate, respectiv i uscate.
Procesele biotehnologice de obinere a
preparatelor microbiene sunt complexe,
realizarea lor presupune parcurgerea a trei
etape:
1. Pregtirea mediului de cultur, prin
prelucrarea mecanic i fizico chimic a
materiilor prime ce intr n compoziia
mediului de cultur (fermentativ). Aceast
etap presupune operaii de dozare, mrunire,
solubilizare, sterilizare etc.
2 Etapa biologic care const n obinerea
culturilor starter intermediare i a culturii de

magneziu) i micronutrienii (sodiu, calciu,

clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru,
mangan, nichel i seleniu).
Surse de factori de cretere. Factorii de
cretere sunt compui organici a cror prezen
n mediul de cultur este necesar n cantiti
mici, avnd un rol catalitic sau structural
pentru microorganisme. Factorii de cretere
includ
vitaminele,
purine,
pirimidine,
nucleotide i nucleozide, aminoacizi, acizi
grai, steroli i poliamide.
Principalele vitamine necesare ca factori de
cretere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul
nicotinic, tiamina.
Tratementul termic al mediilor de cultur.
Pentru buna desfurare a procesului de
fermentaie
este
necesar
cultivarea
microorgnimelor pe un mediu de cultur steril
pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea
mediului de cultur se poate realiza direct n
bioreatorul n care se realizeaz fermentaia sau
ntr-un vas sub presiune separat, ulterior fiind
transferat n bioreactor.
B. Etapa biologic.
Obinerea culturilor starter de producie
Pentru producerea enzimelor, fermentaiile
industriale se desfoar n volume de 150
250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie
pregtit o cantitate suficient de inocul.
Cultura folosit drept inocul trebuie s fie n
faza
exponenial
de
cretere.
La
microorganismele care au vitez de cretere
redus, se recomand s se foloseasc o
cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce
durata iniieirii fermentaiei. Cultura starter de
producie trebuie s conin celule active,
adaptate la mediul industrial pentru ca
fermentaia s se declaneze rapid. n cazul
fermentaiilor desfurate pe mediul solid,
pentru care se utilizeaz inocule sporifere se
recomand s se asigure prin inoculare
concentraii de 105-106 spori pe g mediu, iar n
cazul celor submerse cultura starter de
producie s fie de circa 10% din mediul de
cultur.

Figura 2.3. Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice

Figura 2.4. Schema bloc pe operaii de obinere a preparatelor enzimatice microbiene brute
parametrii fermentaiei sunt perfect controlai.
Aceast ultim tehnic este superioar primei
metode din punct de vedere tehnologic i
biochimic.
Dintre speciile de microorganisme ce se
folosesc menionm urmtoarele : Aspergillus
niger, Aspergillus
oryzae, Mucor miehei,
Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica,
Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis,
Bacillus
amylolichefaciens,
Bacillus
licheniformis, Bacillus
stearothermophilus,
Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.

2.6. Tehnici de fermentaie

Pentru producia de preparate enzimatice de
origine microbian se poate aplica dou tehnici
de baz :
Fermentaia de suprafa n care se
utilizeaz un mediu solid pe care se cultiv
microorganismul (de regul un mucegai
filamentos). Aceast tehnic are avantajul c
mediul de cultur va deveni un mediu bogat
n activitate enzimatic ;
Fermentaia de submers, n care mediul
este lichid ce se afl ntr-un reactor unde toi
8

La sfritul fermentaiei microorganismul

trebuie distrus cu condiia pstrrii intacte a
activitii enzimatice.
Microorganismele
cultivate pot produce
enzime extracelular sau intracelular. n funcie de
tipul acestora variaz i procedeul de extracie. n
ceea ce privete tipurile de culturi submerse,
ne putem situa n unul din urmtoarele cazuri:
Procedeul nealimentat, n care caz toate
ingredientele mediului de fermentare sunt
pregtite n fermentator la pH-ul i temperatura
dorit nainte de a introduce inoculum. Dup
introducerea inoculum, fermentaia principal
ncepe i finalizarea ei se urmrete prin
prelevarea de probe, n mod steril, care arat :
- creterea
microorganismelor (biomas,
vscozitatea mediului) ;
- concentraia
n
enzim (activitatea
enzimatic a mediului) ;
- consumul de glucide ;
- nivelul de proteine.
La procedeul nealimentat se pot monta
diferii senzori care arat :
- pH-ul care se poate regla prin adaus de
baze sau acid ;
- temperatura care se poate regla prin
debitul de circulaie al apei reci n mantaua
fermentatorului sau n serpentina din interiorul
fermentatorului ;
- nivelul de spum care se poate combate
cu un antispumant aflat ntr-un rezervor ataat
fermentatorului;
- presiunea care se regleaz prin supape
care se deschid la presiuni de 1 pn la 3 bar;
- coeficientul respirator QR care se
msoar prin cantitatea de CO2 produs fa
de cantitatea de oxigen consumat ;
- nivelul de oxigen consumat, pornind de la
analiza efluenilor.
Procedeul alimentat, n care se ncepe cu un
volum de 10 30% de substrat n care se
introduce inoculum, dup care fermentatorul se
alimenteaz cu restul de mediu, dup care
oprirea fermentaiei se face dup un anumit
timp fixat experimental. Acest procedeu se
aplic n cazul n care sinteza enzimelor ar fi
reprimat de concentraiile ridicate ntr-unul din
nutrienii mediului de cultur sau n cazul cnd
creterea microorganismelor, n funcie de
concentraia n unul din componenii mediului,
ar provoca creterea vscozitii, care trebuie s
fie reglat n timp. Alimentarea fermentatorului
poate fi repetat de mai multe ori efectundu-

se sutiraje (evacuri) programate, dar ntotdeauna

30%, care servete n acest caz drept cultur
de producie.
Procedeul continuu necesit alimentarea
continu a fermentatorului cu mediu i folosirea
unei culturi concentrate de microorganisme. n
acest
caz, bioreactorul (fermentatorul) de
dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate
de micro sau ultrafiltrare. n figura 1.9. se arat
schia unei astfel de instalaii format dintr-un
bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la
care exist i posibilitatea de a recicla biomasa.

Figura 2.5. Procedeul continuu

Avantajele unui astfel de procedeu sunt
urmtoarele:
-se poate detoxifica mediul de cultur prin
eliminarea produsului de inhibare ;
-celulele reciclate devin perfuzate ;
-cantitatea de mediu de cultur care se
introduce n bioreactor este controlat de
cantitatea de permeat care traverseaz
membrana de ultrafiltrare ;
-celulele au posibilitatea de a se dezvolta
pn la concentraii relativ mari ( 300 g
substan uscat/l, n cazul drojdiilor) ;
-aceste concentraii mari de celule se
constituie ca o barier eficace fa de
contaminarea exterioar ;
-retenatul poate fi evacuat i el periodic,
fiind constituit din biomas care conine
enzime intracelulare, dup care este trecut la
prelucrare ulterioar (extracie) ;
-permeatul de la ultrafiltrare, care conine
enzime nu mai are celule microbiene i poate
fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaie n
aval de purificare sau concentrare.

Figura 2.6. Cultivarea submers a microorganismelor.

Neajunsurile acestui procedeu de obinere a
biomasei i enzimelor sunt urmtoarele :
-membranele trebuie s fie rezistente la

sterilizarea cu vapori de ap i la igienizare cu

substane chimice ;
-costurile energetice sunt destul de ridicate;
10

-mediul de cultur poate fi colmatant pentru

membrana de ultrafiltrare;
-chiar la densiti mari de celule, la sfritul
ciclului de dezvoltare este posibil o oarecare
liz a celulelor, ceea ce face necesar o purjare
a bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt
care conduce la micorarea vrstei medii a
celulelor care rmn n sistem.
O variant a procedeului continuu de obinere
a biomasei/ enzimelor const n folosirea
bioreactorului cu membran.

Preparatele enzimatice se comercializeaz de

regul sub form de pulbere, de microgranule,
precum i sub form lichid.
Preparatele enzimatice sub form de pulbere
sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul,
maltodextrinele, zahrul, sarea. La aceste preparate
se controleaz granulometria, umiditatea ( 6%).
Suportul trebuie s nu fie higroscopic pentru a
se evita formarea de cocoloae. n preparatele
comerciale pulbere sau lichide, coninutul de
enzim este redus raportat la suport i de aceea
cantitatea de preparat comercial este mult mai
mare, n comparaie cu nivelul de enzim
coninut.
n ceea ce privete preparatele comerciale
microgranulate, acestea
se
obin
dintr-un
ultrafiltrat care se amestec cu un suport (sare,
amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de
substrat este astfel calculat nct s se obin
titrul enzimatic dorit n microgranule. Amestecul
respectiv este pulverizat mpreun cu un agent
liant care reprezint 0,1% pn la 0,5% fa de
masa suportului. Picturile pulverizate sunt uscate
ntr-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90C.
Preparatele comerciale lichide sunt formulate
n general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se
utilizeaz n proporie de 20 50% fa de
preparatul lichid. La aceste formulri se adaog
o substan bacteriostatic (de exemplu benzoat
de sodiu n proporie de 0,1 0,2%).

C. Etapa de separare a enzimelor

Extracia. La
procedeul
discontinuu
(nealimentat) i cel alimentat, dup terminarea
fermentaiei se separ partea solid insolubil
(celule i produse insolubile) de partea lichid
care conine enzimele, separare care se poate face
prin centrifugare, filtrare frontal sau microfiltrare.
Soluia steril obinut este apoi ultrafiltrat
pentru a concentra enzimele. n cazul n care
enzimele sunt destinate a intra n compoziia unui
preparat
comercial
lichid, ultrafiltratul
se
stabilizeaz cu polioli (sorbitol, glicerol) i/sau
sruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaug
bacteriostatici
alimentari (benzoat, sorbat,
ascorbat).
n cazul n care enzima (enzimele) intr n
compoziia unui preparat comercial pulbere,
ultrafiltratul se suplimenteaz cu un suport i se
usuc prin atomizare (suplimentarea se face cu
amidon, dextrine). nainte de atomizare mai poate
fi realizat o filtrare steril.
Pentru a obine i enzimele intracelulare,
biomasa din fermentator, separat de partea
lichid, este supus lizei. Liza poate fi realizat
chiar de enzimele proprii microorganismelor ce
alctuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate
exogene, cum ar fi lizozimul din albuul de ou,
preparate enzimatice exogene complexe de natur
bacterian care conin chitinaz, mananaz, -1,6
glucanaz, proteaze, cteodat n combinaie cu
adaosul de metabisulfit.
n cazul n care enzima este periplasmic, un
oc osmotic este suficient pentru a elibera
enzimele. Se poate realiza i o liz mecanic
(folosire de presiuni mari de 600 1000 bar,
urmat de detenta brutal) Se pot folosi i
ultrasunetele cu frecvene mai mari de 20 MHz
pentru liza celulelor i deci pentru eliberarea
enzimelor intracelulare. Odat eliberate, enzimele
intracelulare sunt supuse operaiilor aplicate i
enzimelor extracelulare.
11