PROTEINELE

CURSUL 3

Definiie
sunt compui organici care conin n molecula lor mai mult de 100 de aminoacizi proteinele se pot clasifica: homoproteine sunt alctuite numai din aminoacizi exemple: albumina, transferina

heteroproteine sunt alctuite dintr-o parte proteic (apoproteine) i o parte prostetic exemple: colagenul, cromoproteine

Funciile proteinelor
funcia unei proteine deriv din conformaia sa:
cataliz enzimatic: enzimele depozitate: Mb pentru O2, feritina pentru Fe3+ transport: Hb pentru O2, transferina pentru Fe3+, albumina pentru acizii grai suport mecanic i elasticitate a esuturilor i organelor: colagenul, elastina imunitate mediat umoral: imunoglobulinele transmiterea mesajelor ctre celule (hormonii): glucagon, insulina, interleukine

Nivele de organizare structural

Structura primar

Structura secundar
Structura teriar Structura cuaternar

Nivele de organizare structural Structura primar

se refer la ordinea de niruire a resturilor de aminoacizi (secvena aminoacizilor) n catenele polipeptidice, precum i locul legturilor bisulfurice secvena de aminoacizi este codat n ADN

cunoaterea structurii primare a proteinelor permite explicarea la nivel molecular a unor simptome clinice, fiind util pentru diagnostic sau stadiul afeciunii

Nivele de organizare structural

Structura primar
1. Determinarea compoziiei n aminoacizi a proteinelor
este prima etap pentru determinarea structurii primare a unei proteine, n care se identific aminoacizii i numrul acestora procedura: proteina de analizat este hidrolizat n mediu acid obinndu-se un amestec de aminoacizi amestecul de aminoacizi este supus unei tehnici de separare (exp.: cromatografie de schimb ionic)

Nivele de organizare structural Structura primar

Cromatografie de schimb ionic aminoacizii din amestec sunt separai pe baza proprietilor acido-bazice pentru aceast tehnic de separare se folosete o coloan coninnd granulele unei rini sintetice, avnd pe suprafaa lor grupri funcionale fixe ncrcate electric aminoacizii sunt separai, de obicei, pe o coloan schimbtoare de ioni cationici, CATIONIT

Nivele de organizare structural

Structura primar
Cromatografie de schimb ionic
coloana conine granule de polistiren sulfonat, aduse la echilibru prin tratarea cu NaOH pe coloana cu rin, sub forma n care gruprile acide sulfurice au ataat Na+, se aplic amestecul de aminoacizi complet protonai (pH acid) aminoacizii se leag de coloan cu diferite afiniti, n funcie de ncrctura lor electric

Nivele de organizare structural

Structura primar
Cromatografie de schimb ionic fiecare aminoacid este eliminat secvenial din coloana de cromatografie prin eluie cu soluii avnd pH cresctor aminoacizii separai coninui n eluat reacioneaz cu ninhidrina insuflat n sistemul de determinare, determinnd formarea purpurii de Ruhemann dozarea cantitativ a fiecrui aminoacid se determin spectrofotometric prin msurarea cantitii de lumin absorbit de ctre derivatul ninhidrinei

Nivele de organizare structural

Structura primar Principiul secvenierii
a fost pus la punct de ctre Sanger, care a stabilit pentru prima dat secvena complet a insulinei, n 1953

Nivele de organizare structural

1. Prepararea proteinei pentru secveniere
1.1. determinarea numrului catene polipeptidice distincte ale proteinei 1.1.1. identificarea capetelor N-terminale ale proteinei 1.1.2. identificarea capetelor C-terminale ale proteinei 1.2. ruperea legturilor bisulfurice inter- i intracatenare 1.3. separarea catenelor polipeptidice

Structura primar Principiul secvenierii

2. Secvenierea
2.1. clivajul unei catene n fragmente destul de mici pentru a putea fi secveniate 2.2. separarea fragmentelor 2.3. secvenierea fragmentelor peptidice 2.4. repetarea clivajului catenei cu un agent cu specificitate diferit

3. Deducerea secvenei ntregii proteine

3.1. ordonarea fragmentelor peptidice prin medoda suprapunerii 3.2. determinarea poziiilor punilor bisulfurice prin electroforez diagonal

Nivele de organizare structural

Structura primar
1.1. Determinarea numrului catene polipeptidice distincte ale proteinei 1.1.1. Captul N-terminal 1.1.2. Captul C-terminal poate fi identificat poate fi identificat utiliznd un reactiv, care utiliznd hidrazina, care se leag covalent de cliveaz toate legturile gruparea amino terminal peptidice rezultnd aminoacidul N-derivatizat hidrazide de aminoacil i poate fi identificat prin aminoacidul C-terminal cromatografie dup ce liber proteina a fost hidrolizat aminoacidul liber poate fi reactivi folosii frecvent: difereniat i identificat r. Sanger, clorura de prin HPLC dansyl, r. Edman

Nivele de organizare structural

Structura primar
1.1. Determinarea numrului catene polipeptidice distincte ale proteinei 1.1.2. Captul C-terminal aminoacidul C-terminal poate fi ndeprtat selectiv i prin aciunea unei carboxipeptidaze, care atac specific legtura petidic C-terminal dezavantajul acestei metode este c viteza de clivaj a aminoacizilor depinde de tipul radicalilor acestora

Nivele de organizare structural

Structura primar
1.2. Ruperea legturilor bisulfurice inter- i intracatenar legturile bisulfurice dintre resturile de Cys pot lega 2 catene polipeptidice (legturi intercatenare), dar pot apare i n cadrul aceleai catene (legturi intracatenate)

Nivele de organizare structural

Structura primar
1.2. Ruperea legturilor bisulfurice inter- i intracatenar

Nivele de organizare structural

Structura primar
1.3. Separarea catenelor polipeptidice se face prin cromatografie sau electroforez.

Nivele de organizare structural

Structura primar
2.1. Clivajul unei catene n fragmente destul de mici pentru a putea fi secveniate

secvenierea direct a unei catene cu mai mult de 100 de aminoacizi este dificil clivajul catenei polipeptidice n fragmente de aprox. 4060 aminoacizi este efectuat folosind ageni chimici sau enzime care desfac legturile peptidice n funcie de radicalii care o flancheaz

Nivele de organizare structural

Structura primar
2.1. Clivajul unei catene n fragmente destul de mici pentru a putea fi secveniate cu diferii ageni de clivaj 2.1. Ageni chimici 2.4. Enzime proteolitice 1. Tripsina 2.1.1. BROMCIANUL Rx-1= Arg, Lys; Rx Pro cliveaz legturile peptidice la care Met Chimotripsina Rx-1= Phe, Trp, Tyr; RxPro particip cu gruparea carbonilic Elastaza 2.1.2. HIDROXILAMINA Rx-1= Ala, Gly, Ser, Val; RxPro cliveaz legtura peptidic dintre Asn-Gly Pepsina Rx-1 Pro; Rx = Leu, Phe, Trp,Tyr

Nivele de organizare structural

Structura primar
2.2. Separarea fragmentelor se face prin cromatografie pe coloan sau pe hrtie. 2.2.1. n cazul folosirii tehnicilor pe hrtie, metodele bidirecionale sunt mai eficiente. 2.2.2. Cromatografia pe coloan a amestecurilor peptidice se face n coloane cu schimbtori de ioni. Eluia se face n gradient de pH.

Nivele de organizare structural

Structura primar
2.3. Secvenierea fragmentelor peptidice
este determinat cu ajutorul reaciei Edman, folosindu-se un sequenator automat

Nivele de organizare structural

Structura primar
2.4. Repetarea clivajului cateinei cu un alt agent cu specificitate diferit
ordonarea corect a fragmentelor este o problem care poate fi rezolvat prin fragmentarea catenei polipeptidice cu ali ageni de clivaj se obin alte seturi de fragmente peptidice, care vor parcurge ulterior aceleai etape: separarea fragmentelor, secvenierea fragmentelor

Nivele de organizare structural

Structura primar
3.1. Ordonarea fragmentelor peptidice prin metoda suprapunerii
Setul de fragmente obinute prin aciunea bromcianului.

Setul de fragmente obinute prin aciunea tripsinei.

Nivele de organizare structural

Structura primar
3.2. Determinarea poziiilor punilor bisulfurice prin electroforez diabonal n prima etap, se fragmenteaz proteina intact cu tripsin fragmentele obinute sunt separate prin electroforez electroforetograma se expune la vapori de acid performic, care va oxida puniile bisulfurice hrtia este rotit cu 90 i supus la a 2 a electroforez

Nivele de organizare structural

Structura primar
3.2. Determinarea poziiilor punilor bisulfurice prin electroforez diabonal dac fragmentele cu conin legturi bisulfurice, ele vor migra pe aceeai distan n cele dou cmpuri electrice, astfel nct unirea punctelor de migrare va determina dispunerea acestora pe o diagonal dac fragmentele conin legturi bisulfurice, subfragmentele obinute prin aciunea acidului performic vor migra pe distane diferite n cele dou cmpuri electrice

Nivele de organizare structural

Structura primar
3.2. Determinarea poziiilor punilor bisulfurice prin electroforez diabonal

Fragmentele obinute prin aciunea acidului performic sunt eluate de pe suportul electroforetic i secveniate pentru localizarea resturilor de Cys formatoare de legturi bisulfurice

Nivele de organizare structural Structura secundar

reprezint al 2-lea nivel de organizare structural a proteinelor se refer la dispunerea spaial a lanului polipeptidic

se datoreaz legturilor de hidrogen realizate ntre gruprile C=O i NH aparinnd legturilor peptidice

Nivele de organizare structural Structura secundar

cele mai frecvent ntlnite structuri secundare: structura helicoidal sau de tip -helix legturile de hidrogen se stabilesc ntre gruprile C=O i NH aparinnd aceluiai lan polipeptidic structura straturilor pliate sau de tip legturile de hidrogen se stabilesc ntre gruprile C=O i NH aparinnd lanurilor polipeptidice diferite

 lanul polipeptidic este aranjat sub form de spir elicoidal avnd 3.6 aminoacizi/spir radicalii aminoacizilor sunt orientai n afara helixului, ptrunderea lor n interior fiind mpiedicat steric

- helix

se formeaz legturi de hidrogen ntre 2 spire consecutive, paralel cu axa longitudinal a helixului spira
* Imagine preluat de pe site-ul Wikipedia (Free encyclopedia)

 lanurile polipeptidice pot adopta i alte tipuri de rsuciri elicoidate ( helix, 310 helix) helix este format fie dintr-un lan polipeptidic cu L-aminoacizi, fie cu D-aminoacizi, niciodat dintr-un lan polipeptidic coninnd resturi L-aminoacizi i D-aminoacizi n proteinele naturale studiate, helixul este rsucit la dreapta

- helix

* Imagine preluat de pe site-ul Wikipedia (Free encyclopedia)

 lanurile polipeptidice sunt aranjate n foi pliate ntre care se foaia - pliat formeaz legturi de hidrogen o protein care are structur predominat pliat este fibroina toate gruprile peptidice particip din firul de mtase la aceast legare ncruciat a tot al 2-lea aminoacid lanurilor polipeptidice conferind din fibroin este glicina structurii o mare stabilitate fibroina este bogat n aminoacizi cu radicali relativi mici Gly, Ala radicalii aminoacizilor se vor situa deasupra sau sub planurile n prezena unor radicali voluminoi sau zigzag ale foilor pliate ncrcai electric ar destabiliza structura

Nivele de organizare structural

Structura secundar

foaia pliat
lanurile polipeptidice se pot desfura n aceeai direcie, adic de la captul N terminal ctre captul C - terminal n foaia pliat paralel, atomii implicai la formarea legturilor de hidrogen interlan nu sunt coliniari

Nivele de organizare structural

Structura secundar

foaia pliat
lanurile polipeptidice adiacente se pot desfura n direcie opus n foaia pliat antiparalel, atomii implicai la formarea legturilor de hidrogen interlan sunt coliniari

Nivele de organizare structural

Structura secundar
COLAGENUL

Proteine fibrilare
este cea mai rspndit protein la organismele superioare, constituind aproximativ 33% din masa proteic a acestora n funcie de modalitatea de aranjare a fibrelor de colagen n esutul conjunctiv, acesta poate ndeplinii funcii biologice diferite n tendoane fibrele de colagen sunt aranjate n mnunchiuri paralele n piele fibrele de colagen formeaz o reea ncruciat dipus n foi

Nivele de organizare structural

Structura secundar

Proteine fibrilare
subunitile colagenului sunt moleculele de tropocolagen Tropocolagenul este alctuit din 3 lanuri polipeptidice, fiecare rsucit la stnga i toate sunt nfurate la dreapta secvena de aminoacizi a lanurilor polipeptidice va determina diferite tipuri de colagen

Nivele de organizare structural

Structura secundar

Proteine fibrilare
aminoacizi implicai n definirea structurii elicoidale a colagenului:

Gly este tot al 3-lea aminoacid din lanul polipeptidic Ala i Gly prezint radicalii cei mai mici permind aranjarea elicoidal a lanurilor polipeptidice Pro este singurul aminoacid cu gruparea amino nclus ntr-un ciclu, ceea ce limiteaz rotirea liber a atomilor implicai la formarea legturilor peptidice la care particip, i astfel determin aranjamentul elicoidal

Nivele de organizare structural

Structura secundar

Proteine fibrilare
aminoacizi implicai n definirea funciilor biologice a colagenului:

hidroxiprolina aminoacid necodificat genetic este responsabil de rezistena termic a colagenului hidroxilizina aminoacid necodificat genetic este responsabil de rezistena mecanic a colagenului

 oxidarea gruprilor amino din Lys conduce la formarea unor grupri aldehidice, ce se vor condensa crotonic ducnd la formarea legturilor intercatenare resturile de HO-Lys pot constitui locurile de ataare a unor resturi oligozaharidice colagenul fiind o heteroprotein

Nivele de organizare structural

Structura secundar

Proteine fibrilare
fibrele de colagen prezint la ME , un aspect caracterisic cu striaii transversale zonele opace corespund poriunilor de suprapunere a moleculelor de tropocolagen zonele mai transparente corespund poriunilor de suprapunere parial a moleculelor de tropocolagen

* Imagine preluat de pe site-ul Wikipedia (Free encyclopedia)

Nivele de organizare structural

Structura secundar
ELASTINA

Proteine fibrilare
subunitile elastinei sunt moleculele de tropoelastin

legturile transversale dintre lanurilor polipeptidice se realizeaz prin intermediul desmozinei, structur aromatic rezultat prin condensarea a 4 molecule de Lys

Nivele de organizare structural Mioglobin Structura teriar

se refer la relaiile spaiale dintre atomii situai la distan n structura primar a unei catene polipeptidice

n soluii apoase, catenele polipeptidice ale proteinelor au tendina de a se plia formnd structuri globulare
plierea catenelor este datorat asocierii segmentelor de helix, foaia pliate sau a altor structuri secundare cu segmente non-structurale mioglobina este prima protein globular creia i s-a determinat structura teriar

Nivele de organizare structural

Structura teriar
Forele stabilizatoare ale structurii teriare

Nivele de organizare structural

Structura teriar
Forele stabilizatoare ale structurii teriare fore ionice gruprile ncrcate negativ ale Asp sau Glu pot interaciona cu gruprile ncrcate pozitiv ale Lys legturile de hidrogen aminoacizii coninnd H legat de O sau N (-OH, -NH2) pot forma legturi de hidrogen cu atomii puternic electronegativi ai gruprii carboxil sau gruprii carbonil din gruparea peptidic forele hidrofobe radicalii nepolari tind s fie localizai n interiorul moleculei proteice, unde se asociaz cu ali radicali nepolari legturile disulfurice sunt legturile formate ntre gruprile tiolice a 2 resturi de Cys, formndu-se resturi de cistin

Nivele de organizare structural Hemoglobin Structura cuaternar

este cel mai nalt nivel de organizare structural al proteinelor

se refer la relaiile spaiale dintre atomii aminoacizilor situai n catene polipeptidice diferite, care prezint structur teriar se formeaz agregate de molecule unite prin aceleai tipuri de legturi ca i cele din structura teriar, cu deosebirea c ele acioneaz ntre catene polipeptidice diferite

Nivele de organizare structural Structura cuaternar

* Imagine preluat de pe site-ul Wikipedia (Free encyclopedia)

Proteinele
Separarea proteinelor
Extracia proteinelor din celule pentru izolarea unei proteine este necesar alegerea unei surse clonarea molecular pe baza creia poate fi produs aproape orice protein codificat genetic dac proteina este citosolar, citoliza care se poate face pe cale osmotic, enzimatic, sau citoliza mecanic principalul criteriu n alegere a condiiilor de purificare este meninerea sub control a factorilor denaturani dup extracia din celule se trece la separarea proteinei de celelalte molecule dizolvate

Proteinele
Separarea proteinelor
Solubilitatea proteinelor ntruct proteinele sunt polielectrolii, solubilitatea lor depinde de: concentraia srurilor

Concentraia srurilor este exprimat prin fora ionic; la for ionic mic solubilitatea proteinelor crete cu concentraia srurilor, atinge o valoare maxim dup care scade. Cea mai folosit, n precipitarea salin, este cea cu (NH4)2SO4.

pH

Efectul pH-ului depinde de natura proteinelor deoarece au pI diferit (precipitarea izoelectric).

constanta dielectric ale mediului de dizolvare

Solvenii organici cum sunt acetona i etanolul precipit proteinele au constanta dielectric mic .

Proteinele
Separarea proteinelor 1. Gel filtrarea

Proteinele
Separarea proteinelor 2. Cromatografie de afinitate

Proteinele
Separarea proteinelor 3. Cromatografie de schimb ionic

Proteinele
Separarea proteinelor 4. Electroforez bidimensional