CAPITOLUL I

INTRODUCERE ÎN
BIOLOGIA MOLECULARĂ
Biologia Moleculară:
•studiul proceselor biologice la nivel molecular.
•ramură a biologiei care se ocupă cu studierea
proceselor biologice la nivel molecular prin evaluarea
ADN, ARN,a proteinelor și a altor biomolecule
implicateîn controlul și modularea informației genetice
utilizând metode și tehnici avansate de separare,
manipulare și cuantificare.
COMPONENTELE STRUCTURALE ALE
ACIZILOR NUCLEICI
Acizii nucleici sunt macromolecule, care au fost pentru prima dată izolaţi
din nucleii celulelor.
Mai târziu s-a evidenţiat, existenţa acizilor nucleici atâtîn nucleu cât şi în
citoplasma celulelor.
Acizi nucleici pot fi:
a) ADN (acid deoxiribonucleic) localizatîn principal în nucleul celulelor dacă
acesta este individualizat, cum este cazul eucariotelor;
b) ARN (acid ribonucleic), prezent în principal în citoplasma celulelor dar şi
în nucleu.
Interesul studierii acizilor nucleici:
•ADN şi ARN au rol esenţial în sinteza proteinelor.
•ADN conţine „programul” sintezei proteinelor, fiind responsabil de dictarea
ordinii în care aminoacizii se leagă între ei pentru a da naştere unei
proteine.
•ADN este un element permanent al celulei, informaţiile conţinute în
structura sa sunt transmise descendenţilor→ADN este suportul eredităţii.
•Majoritatea tipurilor de acizii ribonucleici, ARNr, ARNt şi ARNm, sunt
moleculele implicate în realizarea sintezei proteice.
•Molecula de ADN este cea mai mare din organism, având o dimensiune
variind de la 103-105pb, la virusuri, la 108-109pb, la mamifere.
•structural, acizii nucleici sunt macromolecule polinucleotidice foarte mari,
formate din repetiţia unor subunităţi numite nucleotide.
•Nucleotidele sunt formate dintr-un rest de acid fosforic,un rest de pentoză
(riboză sau deoxi-riboză) şi un rest de bază purinică sau pirimidinică.
Bazele azotate
În structura nucleotidelor şi a polimerilor lor intră două baze purinice și trei
baze pirimidinice majore precum şi baze modificate enzimatic după sinteza
acestora asociate cu semnale chimice de protecţie şi control.

Baze majore
•Sunt derivaţi ceto-sau amino- ai pirimidinei şi ai purinei (imidazolpirimidină)
•Numele utilizate curent nu sunt corelate cu denumirile sistemice folosite în
chimia organică. Anumite denumiri evocă sursa unde bazele azotate au
fost descoperite: guanina de la guano(excrementede pasăre),timină de la
evidenţierea sa în timusul de vacă.
Baze pirimidinice: pirimidina; citozina (2-ceto-4-amino-pirimidina); uracilul
(2,4-diceto-pirimidina); timina (2,4-diceto-5-metil-pirimidina);
Baze purinice: purina (imidazolpirimidină); adenina (6-amino-purina);
guanina (2-amino-6-ceto-purina).
•În structura ADN intră: Citozina, Timina, Adenina şi Guanina
•În structura ARN intră: Citozina, Uracilul, Adenina şi Guanina
Baze modificate sau substituite
Modificarea bazelor azotate din structura ADN prin metilare
•la animale 5-metil-citozinadin ADN este un semnal negativ de reglare a
expresiei genelor.
Gruparea metil favorizează conformaţia inactivă a ADN în formă
condensată şi împiedică fixarea factorilor de transcripţie, deci copierea inf.
în ARN
• la bacterii moleculele de citozină metilate din ADN au cel puţin două
roluri:
a)constituie un sistem de distincţie şi de protecţiea ADN bacterian faţă de
ADN non-self. Celula activează de fapt enzime de restricţie (endonucleaze)
pentru a distruge ADN viral/fag nemetilat, cel puţin în cazul primei infectări.
Acest sistem de apărare este cunoscut sub numele de restricţie-metilare;
b)sunt elemente ale sistemului de corectare aeventualelor greşeli de
replicare(etichetare).
•5-hidroxi-metil-citozina la bacteriişibazelepuriniceN-metilate la mamifere
sunt implicateîn reglarea timpului deînjumătăţire al ARN.
Activareași inactivarea genelor prin procesul de
metilare a promotorului
Degradarea bazelor purinice prin reacţii de deaminare
•bazele purinice care nu sunt reciclate sunt degradatela acid uric trecând
prin formele deaminate hipoxantină şi xantină. Acidul uric, foarte puţin
solubil, este produsul de excreţie al acestor baze la primate
•la plante, alcaloizii sunt derivaţi metilaţi ai xantinei având proprietăţi
farmacologice: cafeina (stimulant),teobrominaşi teofilina (stimulatori
cardiaci, relaxanţi ai musculaturii netede şi vasodilatatorii).

Proprietăţile bazelor azotate

Conjugarea dublelor legături din structura heterociclurilor
i)stabilizarea puternică a moleculei;
ii)structurile sunt aproape plane(pirimidinele sunt plane şi purinele
uşor pliate);
iii)moleculele există sub diferite forme tautomere(amino-imino şi ceto-
enol),înfuncție de pH. La pH fiziologic, sunt favorizate formele amino
și ceto;
iv)absorbanţă la 260 nm (dozarea şi controlul purităţii derivaţilor).

Comportarea acido-bazică
Purinele și pirimidinele sunt baze slabe ale căror molecule nu au
sarcină ionică la pH7,0.Comportamentul la titrare este complex
deoarece posedă multiple situsuri potenţiale donoare sau acceptoare
de protoni cu localizare diferită în funcţie de forma tautomeră
implicată.

Solubilitatea
Datorită nucleelor condensate hidrofobe, la pH şi temperatură
fiziologică bazele purinice sunt aproape insolubile. La valori de pH
acide sau bazice dizolvarea lor în mediu apos este favorizată de
ionizare;

Interacţia hidrofobă
În soluţii apoase, apare interacţia hidrofobă dintre nucleele bazelor
azotate care se realizează prin forţe Van der Waals,conducând la
suprapunerea planurilor acestora.
Această tendinţă reprezintă fenomenul de stivuire sau „stacking” al
bazelor azotate.Suprapunerea parţială a inelelor reprezintă o
asociere tipică a bazelor în structuri cristaline şi în dubla elice a AN.
Bazele se stivuiesc într-o ordine preferenţială: pur-pur>pur-pir>pir-pir.
Stivuirea bazelor este un factor primordial în stabilizarea structurii
spaţiale a acizilor nucleici. Are drept consecinţă scăderea absorbţiei
în UV a unui acid nucleic faţă de o soluţie echivalentă de nucleotide
libere,urmată în acelaşi timp de deplasarea spectrului cu câţiva nm
(efecthipocrom).

Capacitatea de a forma legături de hidrogen cu bazele

complementare:
Grupările polare fixe, carbonil şi amino,şi atomii de azot ai ciclurilor
sunt adecvate pentru stabilirea legăturilor de hidrogen între baze, de
tip O---H şi N---H.
Împerecherea necovalentă dintre baze, este un fenomen cheie pentru
formarea structurii secundare a acizilor nucleici şi pentru replicarea,
copierea şi exprimarea materialului genetic.
Formele tautomere,în care se găsesc partenerii bazelor, au o
importanţă foarte mare deoarece condiţionează posibilitatea formării
acestor legături.
Transformarea chimică a bazelor
Radiaţiile UV: Iradierea UV deschide dublele legături din structura a
două baze suprapuse şi determină formarea de legături covalente C-
C între acestea. Dimerizarea pirimidinelor (timinelor),este un factor
care estimează capacitatea de carcinogeneză a acestor radiaţii;

Agenţi chimici
a)acidul azotos(HNO2)şi compuşii organici şi minerali derivaţi de la
acesta:nitrozamine, nitriţi şi nitraţi ca şi acidul sulfuros (HSO3-) au
acţiune de deaminare.
În industria alimentară regăsim aceşti compuşi în categoria
conservanţilor utilizaţi pentru a împiedica dezvoltarea bacteriilor.
b)mediul industrial este sursă de substanţe toxice alchilante care
determină metilarea diferitelor baze(guanina este cea mai uşor de
metilat);
Nucleozide= bază azotată+riboză/deoxiriboză
Riboza intră în structura acizilor ribonucleici iar 2’-deoxiriboza intră în
structura acizilor deoxiribonucleici.
Ambele pentoze fac parte din serie sterică D, prezintă ciclizare
semiacetalică furanozică şi anomerie .
Legătura cu baza este de tip N-glicozidică fiind stabilită între carbonul 1’ al
pentozeişi azotul N1 al pirimidinelor şi N9 al purinelor(se realizează
numerotarea bazei şi apoi se reîncepe prin numerotarea ribozei, dând
numerelor apelativul „prim”).
Ca regulă generală trebuie să reţinem sufixul „-idină”pentru nucleozidele
pirimidinice şi „-ozină”pentru nucleozidele purinice.

Legătura N-glicozidică, rezistă la tratament alcalin.

Reacţia sa cu acizii depinde de baza azotată: nucleozidele purinice
hidrolizează uşor,în timp ce pentru a degrada nucleozidele pirimidinice este
necesară acţiunea prelungită a unui acid concentrat. Se estimează că într-
o zi,într-o celulă de mamifere, numai unul din 105 nucleotidele purinice îşi
pierde baza.
În cazul nucleozidelor, nucleotidelor şi acizilor nucleici legătura glicozidică
C1’-N permite rotaţia bazei azotateîn jurul legăturii şi situarea sa în două
poziţii diametral opuse în raport cu pentoza.
Pentru conformaţia syn (împreună), planul bazelor este orientat de aceeaşi
parte cu riboza,în timp ce pentru conformaţia anti (contrar), orientarea este
contrară.În cazul nucleozidelor pirimidinice singura conformaţie naturală
admisă este anti deoarece carbonul din poziţia 2 purtător de grupare
carbonilică determină apariţia unor forţe de respingere cu oxigenul ciclului
ribozei.
Nucleotide-esteri fosfati ai
nucleozidelor

ADN şi ARN, sunt polimeri nucleozidici 5’-monofosfat. În

reacţiile de sinteză ale AN, nucleozidele 5’-trifosfat(NTP)sunt
substrate care participă la formarea legăturilor 3’,5’-
fosfodiester cu eliberarea unei molecule de pirofosfat la
fiecare condensare, energia necesară formării legăturii
covalente fiind furnizată de hidroliza legăturii anhidridice.
Tipuri de nucleotide
a)fosfatul esterifică una sau mai multe grupări hidroxil legate la atomii de
carbon din ciclul pentozei: nucleozid mono-şi difosfat (nucleozid 3’-
monofosfat, nucleozid5’-monofosfat, nucleozid 3’,5’-difosfat, etc).

b) gruparea fosfat poate ea însăşi să fie angajată în condensări anhidridice:

i) cu alte molecule de acid fosforic(nucleozid 5’-difosfat, nucleozid5’-
trifosfat);
ii) cu un nucleotid cu structură de nucleozid 5’-monofosfat,5’-difosfat sau
3’,5’-difosfat(NAD+, NADP+, FAD, coenzima A)
c)Gruparea fosfat ce esterifică o grupare hidroxil legată la un atom de
carbon din ciclul pentozei poate forma o a doua legătură ester cu o altă
grupare hidroxil aparţinând aceleiaşi pentoze conducând la formarea unei
nucleotide ciclice(nucleozid3’,5’-monofosfatciclic).
Acizii nucleici sunt polimeri de nucleozide 5’-monofosfat. Celelalte
nucleotide intervin în biosinteza acestora şi în alte tipuri de reacţii fiind părţi
componente ale coenzimelor, având rol de mesageri secundari, efectori
allosterici sau participând la regenerarea NTP.

Funcţile biologice ale

nucleotidelor
Rol NTP în metabolismul energetic
NTP au un înalt potenţial energetic, legăturile de tip anhidridă acidă au o
entalpie liberă de hidroliză superioară legăturilor ester-fosfat (de ordinul a-
30kJ/mol).
ATP este molecula selecţionată evolutiv de către organisme pentru a
constitui rezerva temporară şi sursa de energie utilizabilă de către materia
vie, cu toate că în câteva reacţii metabolice intervin şi CTP, GTP şi TTP.
ATP este generat în celule prin fosforilare oxidativă şi fosforilare la nivel de
substrat.
De hidroliza ATP depind:
-realizarea unor acţiuni fizice cum sunt contracţia musculară şi transportul
activ al ionilor şi moleculelor prin membrană;
-reacţiile biochimice care sunt termodinamic imposibile fără cuplare
energetică (fosforilarea substraturilor, regenerarea altor NTP: GTP, UTP,
CTP).

Prima etapă a glicolizei(proces prin care are loc catabolizarea glucozei)în

care se formează glucozo-6-fosfat, este o reacţie endergonică şi nu s-ar
putea produce fără cuplarea cu reacţia de hidroliză a ATP, care este
puternic exergonică:

Componente ale coenzimelor: intră în structura NAD+, NADP+, FAD şi

CoA care sunt constituenţi celulari foarte importanţi cu rol critic în multe
reacţii metabolice.
 Unităţi monomere ale acizilor nucleici
Acizii nucleici, ADN şi ARN, sunt polimeri nucleozidici 5’-monofosfat. În
reacţiile de sinteză ale acizilor nucleici, nucleozidele 5’-trifosfat sunt
substrate care participă la formarea legăturilor 3’,5’-fosfodiester cu
eliberarea unei molecule de pirofosfat la fiecare condensare, energia
necesară formării legăturii covalente fiind furnizată de hidroliza legăturii
anhidridice.

Mediatori fiziologici
Mesagerii secundari:
Mesager secundar este o moleculă care asigură acţiunea intracelulară a
unui semnal extracelular (un hormon sau un alt mediator şi constituie
primul mesager care se fixează la suprafaţa celulară).
AMPc se formează din ATP la nivelul adenilil ciclazei pe fața intracelulară a
mb în urma fixării moleculei semnal.
Sinteza AMPc se stopează, când acţiunea externă încetează, prin hidroliza
uneia dintre legăturile ester, produsul fiind 5’-AMP.
AMPc controlează glicogenoliza şi glicogenogeneza mediată de adrenalină
şi glucagon.
GTP este implicat în prelucrarea post-transcripţională a ARNm (adăugarea
capului),transmiterea semnalului către proteinele G („GTP binding
protein”),şi formarea microtubulilor.

Intermediari activaţi
Nucleotidele au rol de transportori („carriers”) ai intermediarilor „activaţi”
într-o serie de reacţii metabolice.
Compusul UDP-glucoză este un intermediar cheie în sinteza glicogenului şi
glicoproteinelor.
Compuşii GDP-manoză, GDP-fucoză, UDP-galactoză,şi CMP-acid sialic
sunt intermediari cheie în reacţiile în care monomerii glucidici sunt
transferaţi pentru sinteza glicoproteinelor.
CTP este implicat în metabolismul fosfolipidelor în generarea CDP-colinei,
CDP-etanol aminei şi CDP-diacilglicerolilor.
S-adenozilmetionina (SAM) este un donor de grupări metil în reacţiile
responsabile de metilarea glucidelor, a bazelor azotate din structura ARN şi
ADN,şi în formarea unor compuşi cum sunt fosfatidilcolina,
fosfatidiletanolamina și carnitinei din lizină, etc.3’-fosfoadenozin 5’-
fosfosulfat (PAPS) este folosit ca donor de grupări sulfat pentru sulfatarea
biomoleculelor de tipul proteoglicanilor şi sulfatidelor.
Efectori alosterici: o serie de etape metabolice reglatoare sunt
controlate prin intermediul concentraţiilor intracelulare ale nucleotidelor.

NUCLEOTIDE SINTETICE UTILIZATE ÎN

MEDICINĂ
Purinele, pirimidinele, nucleozidele și nucleotidele cu heterociclul
sau cu partea glucidică modificată sunt utilizateîn clinica medicală.
Acești analogi pot inhiba enzimele implicate în sinteza AN sau
incorporarea lor în structura AN destabilizează împerecherea
bazelor azotate.
În tratarea cancerului sunt utilizați 5-fluoro-sau5-iodouracilul, 6-
tioguanina, 6-mercaptopurina,8-azaguanina și 6-azauridina care
sunt incorporate în ADN înaintea diviziunii celulare.
Analogul purinei, al lopurinolul este utilizat în hiperuricemie și gută,
inhibând biosinteza purinelor și enzima xantin oxidaza.
Azatioprinul, care este catabolizat la 6-mercaptopurină este utilizat
în cazul transplantului de organe, pentru a suprima respingerea
imunologică.

POLINUCLEOTIDE
Acizii nucleici sunt polimeri neramificaţi ai monofosfat nucleotidelor, care
pot fi liniari sau circulari.
Demonstrată de Levene în1925 şi confirmată după 1950 de către
Todd,înlănţuirea covalentă a nucleotidelor este de tip ester.
Gruparea 5’-fosfata unui mononucleotid este esterificată de o altă grupare–
OH, formând o legătură fosfodiester.
În general, cea de a doua grupare–OH este cea din poziția 3‘a pentozei
celui de al doilea nucleotid.
Scheletul AN este format din resturi de pentoză înlănțuite prin legături
3‘→5‘ fosfodiesterice.
Fosfodiesterazele catalizează rapid hidroliza legăturilor 3‘,5‘-
fosfodiesterice. Hidroliza spontană a legăturii 3‘,5‘-fosfodiesterice este un
proces extrem de lent, ceea ce explică faptul că ADN persistă perioade
lungi de timp, fiind găsit și ADN fosil.
ARN este mai puțin stabil decât ADN, deoarece gruparea–OH din poziția
2'-a ribozei funcționează ca o grupare nucleofilă atacând legătura 3‘,5‘-
fosfodiesterică. Depolimerizarea AN (hidroliza legăturilor3‘,5‘-
fosfodiesterice) se poate realiza prin hidroliză de diferite tipuri (acidă,
bazică, enzimatică) fiind folosită în tehnicile de biologie moleculară.

Nucleotidele sunt acizi polifuncționali

Purinele, pirimidinele și nucleozidele nu sunt încărcate electric la pH
fiziologic.
În schimb, gruparea fosfat primară (pKa~2,2) și gruparea fosfat
secundară(pKa~7.2) ale nucleotidelor sunt încărcate negativ la pH
fiziologic și în mediu alcalin.
Nucleozidele pot funcționa ca donori sau acceptori de protoni în medii cu
valori ale pH cu două unități sub și peste pH fiziologic.
AN și fragmentele lor datorită scheletului pentozo-fosfat încărcat negativ
pot fi separate în câmp electric prin electroforeză în funcție de numărul de
nucleotide din componeța lor.

STRUCTURA PRIMARĂ A ACIZILOR

NUCLEICI(AN)
• se referă la secvenţa înlănţuirii monomerilor nucleozid 5’-fosfat (NMP),
lalegăturile dintre aceştia şi mărimea polimerilor obţinuţi.
• cele două tipuri de acizi nucleici se deosebesc prin două caracteristici
calitative:
1) prezenţa unei pentoze diferite (riboză sau deoxiriboză);tipul de glucid dă
numele celor două tipuri de acizi nucleici deoarece nu există structuri
naturale mixte ADN/ARN în afară de hibrizii care apar tranzitoriu în timpul
replicării şi transcripţiei; Prezenţa hidroxiluluiîn poziţia 2’ a ribozei
determină:
a) imposibilitatea catenelor de ARN de a forma structuri dublu catenare
pedistanţe mari;
b)o reactivitate particulară a ARN, gruparea hidroxil din poziţia 2’ a ribozei
are caracter nucleofil catalizând hidroliza legăturii 3’,5’-fosfodiesterice;
c) centre suplimentare de interacţiune prin legături de hidrogen.
2) diferenţe privind cele patru baze care intră în constituţia ADN şi ARN,
una dintre pirimidine fiind diferită. O distincţie mai nuanţată este dată de
bazele şi nucleotidele minore. ADN se caracterizează prin egalităţi şi
raporturi purine/pirimidine specifice pe care nu le regăsimîn ARN.
Faptul că acizii nucleici sunt polimeri fosfodiesterici ai NMP are
următoarele consecinţe directe:
a) asemeni polipeptidelor,catena este orientată(vectorizată). Sensul
convenţional 5’-3’a fost adoptat pentru lectura şi scrierea (de la stânga la
dreapta) polinucleotidelor ca şi pentru reprezentările prescurtate şi
simbolice.
b) bazele fixate regulat în funcţie de o secvenţă specifică speciei
moleculare, sunt purtate de un schelet covalent pentoză-fosfat.
Când toate legăturile sunt 3‘,5‘-fosfodiesterice o notație mai compactă a
fragmentului reprezentat alăturat este: pApTpCpA.
Această reprezentare indică faptul că doar gruparea hidroxil din poziția 5'-
a fragmentului (capătul din stânga)este fosforilată pe când cea din poziția
3'- este liber(capătul din dreapta).
Scrierea compactă de tipul ATCA prin convenție are capătul din stânga 5‘-
fosforilat iar cel din dreapta 3‘-liber.

Mărimea polimerilor nucleici

AN sunt cele mai mari macromoleculele naturale.
Mărimea acizilor nucleici se exprimă prin trei caracteristici(tipuri de unităţi):
•lungime;
•masă moleculară în Daltoni (Da);
•număr de nucleotide sau de baze ale acestora pentru monocatene(b)şi în
perechi de baze (pb) dacă molecula este constituită din două catene
asociate.
Multiplul cel mai folosit este cel de kilobaze sau kilo-perechi de baze (1000
bsau 1000 pb).
Masa moleculară medie a unei perechi de baze este de 660 Da, iar
distanţa între platourile a două baze este de 0,34 nm în conformitate cu
caracteristicile geometrice ale dublei catene de ADN.
Aceste caracteristici dau o echivalenţă foarte utilă în practică:2x1,06 MD a
se pot aproxima cu 3 000 pb şi cu1m.
Numărul nucleotidelor din structura ARN variază de la mai multe zeci de
baze la mai multe mii de baze.
ARN ribozomal (ARNr) variază de la 100-5 000 bARN de transfer (ARNt)
variază de la75- 90b ARN mesager (ARNm) are un număr variabil de
baze,în funcţie de lungimea secvenței genei copiată.
Mărimea ADN variază în funcţie de regn şi specie de la 5 000 la mai mult
de un miliard de perechi de baze.
Procariotele
 grup de organisme care nu au membrană nucleară(fără nucleu)
Mycoplasma, unul din cele mai mici procariote are genomul de 106pb
Bacteriile au genomul începând cu 2x106pb fiind reprezentat de un
cromozom format din ADN dublu catenar circular.

Eucariotele
grup de organisme ce prezintă membrană perinucleară, deci au nucleu
eucariotele unicelulare au genomul apropiat de cel al unor bacterii mari
drojdiile au un genom de circa 1,3x107pb
nematodele, precum C. Elegans au genomul de 8x107pb
amfibienii au genomul începând de la 109-1011pb
mamiferele au genomul în jur de 5x109pb (H. Sapiens 3,3x109)
Din aceste date se observă că nu există o bună corelaţie între mărimea
genomului şi complexitatea organismului şi se numeşte C-value paradox,
fiind datorat secvenţelor repetitive din genom.

Electroforeza în gel de agaroză

Electroforeza- tehnică de separare și analiză a macromoleculelor încărcate
electric care sub acțiunea unui câmp electric migrează diferit în funcție de
sarcina electrică globală, a mărimii, a conformației tridimensonale și a
vâscozității gelului de agaroză.
Acizii nucleici sunt macromolecule polianionice încărcate negativ la pH8 și
sub acțiunea câmpului electric vor migra la anod (+).

Aplicații
Estimarea masei moleculare a fragmentelor ADN după digestia cu enzime
de restricție;
Analiza ADN după amplificarea prin PCR
Separarea fragmentelor de ADN digerate cu enzime de restricție care
precede tehnica Southern blot sau a ARN în cazul Northernblot.

Avantaje:
-prepararea ușoară, rapidă și ieftină agelurilor de agaroză;
- agaroza este mai fermă și mai puțin toxică decât poliacrilamida;
- Nu denaturează probele și pot fi recuperate pentru analize ulterioare prin
topirea gelului.

Revelarea ADN-ului în prezența bromurii de etidiu (BE)

BE este adăugat în gel înainte de polimerizare într-o concentrație finală de
0,5μg / mL.
BE este un agent care se intercalează între perechile de baze.
Când este expus la UV,prezintă o fluorescență roșu-portocalie fiind de 20
de ori mai intensă în prezența ADN,datorită creșterii hidrofobicității
mediului.
Cei mai importanți factori care afectează migrarea fragmentelor ADN sunt
dimensiunea și conformația acestora.
Creșterea concentrației de agaroză reduce viteza de migrare și permite
separarea fragmentelor ADN mai mici.
Estimarea mărimii fragmentelor în pb se face prin interpolare pe porțiunea
liniară a curbei log pb=f (distanța de migrare)construită din valori obținute
prin migrarea simultană a marker-ului de pb cu probele ADN de analizat.

CAPITOLUL II STRUCTURA
ȘI FUNCȚIA ACIZILOR
NUCLEICI
MODELUL WATSON-CRICK: ADN B
Prin studierea radiografiilor obținute prin difracție cu raze X a
macromoleculelor de ADN,în 1953, Waston şi Crick au dedus structura
tridimensională a ADN dublu catenar,au intuit mecanismul replicării ADN
şi au propus următorul model structural:
-secvenţele de baze azotate poartă informaţia genetică
-cele două catene polinucleotidice helicoidale sunt antiparalele (una este
orientată 5’→3’ iar cealaltă 3’→5’),fiind răsucite spre dreapta (în sensul
acelor de ceasornic) în jurul unei axe comune;
-bazele azotate sunt orientate spre interiorul helixului în timp ce resturile
fosfat şi cele de deoxiriboză(scheletul pentozo-fosfat) se află către
exterior. Planurile bazelor azotate sunt perpendiculare pe axa helicală
iar ale deoxiribozei se află aproape la 90 ̊ faţă de cel al bazelor;
-diametrul helixului este de 20 Å.
-bazele vecine sunt separate printr-o distanţă de 3,4 Å(proiecţie pe
axa)şi rotite cu 36 ̊.Astfel, structura helicală are 10 resturi nucleotidice
per tură, iar fiecare tură are o proiecţie pe axă de 34Å.
- cele două catene sunt complementare fiind menţinute prin punţi de
hidrogen între perechile de baze complementare A=T şi G≡C.
- prezintă două fose, una majoră de 12Å şi una minoră de 6Å lăţime care
au rol în interacţiile specifice dintre proteine ce recunosc anumite
secvenţe de ADN și care sunt implicate în reglarea genelor.
-Catena 5’→3’se numește catena codificatoare(coding strand) ce poartă
informația genetică fiind identică ca secvență cu cea a transcriptului
ARN (cu excepția T→U).
Catena 3’→5’se numește template (matriță)sau catenă necodificatoare
și este copiată în ARN în procesul de transcripție.
Modul de împerechere al bazelor azotate din dublul helix ADN a fost
susţinut şi de descoperirile lul Chargaff (1950) care a studiat compoziţia
în baze a ADN şi a constatat:
•concentraţiile molare ale adeninei şi timinei sunt egale precum şi ale
guaninei şi citozinei:

•concentraţia molară a purinelor este egală cu cea a pirimidinelor:

• raportul R (procentul G+C)variază între specii dar este constant în
celulele unui organism precum şi în cadrul speciilor.

DENATURARE ŞI TEMPERATURĂ DE TOPIRE

(MELTING) Tm
•catenele complementare ale unui duplex ADN pot fi separate prin
încălzirea unei soluţii de ADN (ruperea punţilor de hidrogen) sau prin
adăugare de acizi sau baze (ionizarea bazelor azotate).
•prin creşterea progresivă a temperaturii se formează bucle deschise la
nivelul perechilor A– T a căror diametru creşte progresiv cu temperatura.
•la temperaturi de peste 70 ̊C catenele se separă fizic şi adoptă o
conformaţie random-coil, proces numit denaturare.
•absorbanţa la 260 nm creşte cu temp.
•Tm reprezintă temperatura la care jumătate din structura duplexului
ADN este distrusă şi depinde de procentul de perechi de baze G-C.
• răcirea lentă a soluţiei de ADN la pH și tării ionice fiziologice conduce
la refacerea structurii originale prin reformarea carectă a punţilor de
hidrogen, proces numit renaturare.
• răcirea bruscă conduce la formarea unor legături de hidrogen
aleatoare, ADN nu mai revine la structura iniţială.

Fragmentele ADN ce diferă prin lungime/ secvența de

nucleotide sunt caracterizate de Tm diferite.
Fragmentele bogate în perechi de baze G-C sunt caracterizate de Tm
mai mari.
Este un parametru utilizat în tehnica Real Time RT-PCR pentru
validarea specificităţii reacţiei PCR.
Factori chimici ce influențează Tm:
-creșterea concentrația cationilor monovalenți induce creșterea Tm-
aldehida formică destabilizează punțile de hidrogen dintre perechile de
baze scăzând Tm.
Utilizată în tehnicile de recombinare și secvențiere.
Estimarea Tm bazată pe compoziția fragmentelor în oligonucleotidele
componente:

In prezenta formamidei Tm se recalculează în funcție de concentrația

acesteia:
TIPURI DE NUCLEASE
Nucleasele sunt enzime capabile să hidrolizeze legăturile 3’→5’
fosfodiesterice din cadrul scheletului pentozo-fosfat al AN.
Nucleasele care recunosc specific și taie ADN se numesc
deoxiribonucleaze (DNases) iar cele ce recunosc și hidrolizează specific
ARN se numesc ribonucleaze(RNases).
Enzimele capabile să cliveze legături 3’,5’fosfodiesterice din interiorul
AN cu formare de capete 3'-OH și 5'-P terminale se numesc
endonucleaze.
Unele pot tăia doar o catenă(topo I) iar altele pot hidroliza ambele
catene (giraza, topo IV).
Endonucleazele care recunosc specific și taie o anumită secvență de
nucleotide se numesc enzime de restricție/modificare și sunt utilizate în
tehnicile de biologie moleculară.
Exonucleazele hidrolizează legăturile 3’,5’ fosfodiesterice prezente la
capetele lanțurilor de AN.
ADN polimerazele bacteriene pot avea funcție atât 3'→5‘cât și 5'→3‘
exonucleazică fiind implicate în corectarea erorilor din timpul replicării.

HIBRIDIZAREA
•fenomenul de denaturare-renaturare a stat la baza tehnicii de
hibridizare ce poate fi insitu (FISH) sau la nivelul unui suport (Southern
și Northernblot) precum şi a PCR.
•formarea heteroduplexurilor poate avea loc atât între fragmente ADN
cât şi între fragmente ADN-ARN cu structură primară complementară
sugerând mecanismul replicării şi transcripţiei ADN.
•la o anumită temperatură și concentrație salină,un fragment de acid
nucleic se va asocia strâns numai cu un fragment cu structură
complementară, bazată pe potrivirea exactă a perechilor de baze și pe
reformare a legăturilor H.
• cu ajutorul acestei tehnici s-a demonstratcă ADN celulelor eucariote
conţin secvenţe repetitive
•prin det. vitezei dehibridizare s-a stabilit omologia ADN dintre diferite
specii
•hibridizare a stat la baza dezvoltării tehnicilor Southern și Northern blot.

TEHNICI DE HIBRIDIZARE
Detectează specific fragmente deADN, ARN și proteine din amestecuri
de biomolecule pe baza utilizării unor sonde marcate sau a anticorpilor
specifici.
Sondele sunt secvențe scurte de ADN sau ARN care marcate cu o
nucleotide conținând 32P sau cu un fluorocrom obținute prin sinteză
chimică.
Aceste modificări (etichetarea cu 32P sau fluorocrom) nu modifică
proprietățile de hibridizare ale sondelor.
- Southern blot, detectează și cuantifică specific nr. de copii al unei
gene, deleții, inserții și mutații punctiforme
- Northern blot, determină mărimea și cuantifică specific mARN-
Westhern blot, detectează și cuantifică proteine pe baza recunoașterii lor
de către anticorpi.

Southern blot
ADN-ul izolat dintr-o linie celulară sau dintr-un țesut este digerat cu una
sau mai multe enzime de restricție și amestecul de fragmente obținute
este separat prin electroforeză.
ADN-ul din gel este apoi supus unei denaturări alcaline moderate prin
expunerea la o soluție de NaOH 0,5 M și NaCl 1,5 M înainte de a fi
transferat pe o membrană de nitroceluloză sau nailon prin tehnica
dezvoltată de Southern, producând astfel o replică exactă a profilului d
emigrare obținut prin electroforeză.
ADN-ul este atașat la membrană, de exemplu prin încălzire sau prin
expunere la UV.
Membrana este apoi expusă unei sonde ADNc marcată, care
hibridizează cu fragmentele care sunt complementare acesteia.
Hibridizarea are loc la 42ºC într-un tampon pH ~ 7 (SSC 6X, 100μg ADN
/ ml, 0,5% SDS și 50% formamidă).
După spălarea intensivă(SSC 2X,0,1% SDS; 52ºC),membrana este
expusă la un film sensibillaraze X sau la un ecran sensibil, care după
developare, va dezvălui câteva benzi specifice corespunzătoare
fragmentelor de ADN care au fost recunoscute de secvențele sondei
ADNc.

Formele topologice ale ADN

•ADN poate exista într-o formă relaxată sau superîncolăcită
•Superîncolăcirea este implicată în inițierea replicării, transcripției,
reparării și recombinării.
• reglată activ de topoizomerazele de tipul Iși II,care sunt diferite
la procariote și eucariote(procariotele au Topo I și girază iar
eucariotele au Topo I și II).
Implicații terapeutice:
Giraza (tipul II) este ținta quinonelor(ciprofloxacin, acid
oxolinic)și a aminocumarinelor(novobiocin)antibiotice ce inhibă
replicare.
Topotecanul inhibă Topoizomerazele I iar daunorubicina,
doxorubicina,etoposidele inhibă Topoisomeraza II și sunt utilizate
în chemoterapie.
Bacteriile, unii bacteriofagi sau virusuri au ADN-ul circular.
Circularizarea ADN nu distruge polaritatea moleculei ci doar
elimină capetele libere 3‘-OH și 5‘-P.
Superîncolăcirile pot fi introdu-se când:
-un ADN circular este răsucit/torsionat în jurul propriei axe;
- un fragment ADNdc cu cele două capete fixe (binding proteins)
este răsucit.
Acest proces care necesită energie pune molecula sub stres,și cu cât
numărul de superăsuciri este mai mare, cu atât mai mare este stresul
sau torsiunea moleculei.
Consecințele superîncolăcirilor depind de modul în care axa ADN este
răsucită în jurul său: în același sens cu cele două catene ale duplexului
ADN (în sensul acelor de ceasornic) sau în sens opus.
- Răsucirea în același sens produce superîncolăciri pozitive(cele două
catene sunt răsucite mult mai strâns una în jurul celeilalte,conducând la
creșterea nr. De pb/tură helix)
- Răsucirea în sens invers produce superîncolăciri negative(cele două
catene sunt răsucite mai puțin strâns una în jurul celeilalte, conducând la
scăderea nr. de pb/tură de helix).
Efectul final al superîncolăcirii negative este de a genera o regiuneîn
care cele două catene ale ADN-ului s-au separat și formal sunt
zero,perechi de baze pe tură de helix.
Manipularea topologică a ADN-ului este un aspect central al tuturor
proceselor funcționale în care este implicat ADN: recombinare,replicare,
transcriere,reparare precum și a organizării structurii sale de ordin
superior.
Toate activitățile in vivo sau in vitro care implică ADNdc au la bază
separarea celor două catene ale dublului helix.
Separarea celor două catene impune rotirea uneia în jurul celeilalte în
spațiu.
În cazul unui fragment cu capete fixe,separarea celor două catene pe o
anumită porțiune este compensată de apariția superîncolăcirilor în aval.
Relaxarea ADN ce prezintă superîncolăciri (- sau+) se poate face prin
introducerea unei crestături tranzitorii în interiorul unei catene prin
hidroliza unei legături fosfodiesterice ceva permite catenei cu un capăt
liber să se rotească în jurul catenei intacte.
O moleculă de ADN circulară sau cu capete fixe estecaracterizată de
numărul de legare (linking number) L.
L arată numărul de câte ori o catenă trece pe deasupra celeilalte în
spațiu.
Pentru un ADN circular este un număr întreg.
Valoarea lui L este invariabilă, indiferent dacă molecula circulară este
răsucită sau distorsionată,cât timp legăturile fosfodiesterice sunt intacte.
Moleculele de ADN circulare cu secvențe identice pot diferi prin L
(reflectă o diferență în nr. de superîncolăciri).
Moleculele de ADN care diferă doar prin nr. L se numesc topoizomeri.
L-linking number reprezintă suma a două componente: twisting number
(T) și writhing number (W).
În cazul unui ADN circular sau cu capete fixe: L=T+W; Twisting
number(T) este o proprietate intrinsecă a dublului helix și reprezintă
răsucirea unei catene în jurul celeilalte.
Altfel spus este egal cu numărul complet de ture ale dublului helix, fiind
determinat de nr. de pb per tură de ADN. Pentru un ADN circular în
formă relaxată T= nr.total de pb/ nr.de pb pertură.
Exemplu:în cazul unui B-ADN circular cu 2000 pb, T=2000/10=200
Writhing number(W) reprezintă rotirea axei duplexului în spațiu sau
numărul de superîncolăciri. În cazul unei molecule de ADN relaxată,W =
0 și L=T.
Un duplex ADN liniar cu capetele fixeîn formă relaxată are L=T+W=200
(T=200 W=0).
Desfășurarea a 2 ture de dublu helix liniar sau circular este compensată
de introducerea în aval de fragmentul desfășurat a 2 superîncolăciri
pozitive (T=198 și W=2, L=198+2=200).
În cazul unui ADNdc circular sau cu capetele fixe,răsucirile se
repartizează între T și W,astfel încât o modificareîn structura dublului
helix se compensează printr-o schimbare în nr de superîncolăciri în
spațiu.
În cazul ADNdc circular sau cu capetele fixe, L se poate modifica doar
prin clivarea unei catene sau a ambelor catene ADN, permițând rotirea
liberă a acestora una în jurul celeilalte, finalizându-se cu sudarea
crestăturii.
Enzimele care pot îndeplini aceste funcții modifică L cu un nr întreg.
O scădere a nr L corespunde cu introducerea unor superîncolăciri
negative/despiralizari și invers.

Topoizomerazele pot relaxa ADN

Topoizomerazele modifică L prin hidroliza legăturilor fosfodiesterice din
cadrul catenelor ADN modificând conformația dublului helix în spațiu,
resudând în final catenele.
Tipul I, acționează prin clivarea unei singure catene, modificând L cu o
unitate pe când tipul II taie ambele catene ale duplexului ADN,
modificând L cu două unități cu consum de ATP.
În vederea replicării sau transcripției, cele două catene ADN trebuie să
se despartă.
În cazul transcripției,mișcarea ARN polimerazei de-alungul duplexului
ADN, crează în aval superîncolăciri(+) și în amonte superîncolăciri(-).
Dacă superîncolăcirile(+) nu sunt detensionate vor împiedica mișcarea
ARN polimerazei și stoparea sintezei ARN.
Topoizomerazele sunt implicate în rezolvarea problemelor apărute în
urma replicării și transcripție;
-giraza detensionează sau îndepărtează superîncolăcirile pozitive
generateîn fața ADN sau ARN polimerazelor modificând L cu două
unități.
-topoizomerazele de tip I în general îndepărtează superîncolăcirile
negative,modificând L cu o unitate.
Formarea unui complex covalent ADN-Topo I conservă energia liberă a
legăturii fosfodiester din ADN printr-o legătură de același tip
(fosfodiester) dintre capătul 5’-fosfat rămas liber și OH tirozinei din
structura enzimei. Astfel clivarea și resudarea catenei ADN se face fără
consum de ATP.
Separarea celor două duplexuricirculare ADN de la sfârșitul procesului
de replicare la procariote are loc în prezența Topo IV (tipul II) cu consum
de ATP prin clivarea celor două catene ADN. Astfel,are loc finalizarea
diviziunii celulare și segregarea celor două celule fiice.
TIPURI DE ARN ȘI STRUCTURA ARN
ARN-polianion format din nucleotide purinice şi pirimidinice legate între
ele prin legături 3’,5’-fosfodiesterice ca în cazul ADN
-conţine riboză în loc de 2’-deoxiriboză şi uracil în locul timinei, timina
fiind prezentă doar în cazuri rare (ARNt). Apar baze modificate derivate
atât de la bazele purinice cât şi de la cele pirimidinice
-în general are o structură monocatenară dar prezintă pe anumite
porţiuni structură secundară de ac de păr sau hairpin datorită
complementarităţii dintre baze a fragmentelor antiparalele (cu polaritate
diferită)
-împerecherile standard (A-U şi G-C) sunt îmbogăţite în cazul ARN cu
alte împerecheri Watson-Crick (cuplul G-U) dar şi de împerecheri ne-
standard de tip A-I, U-I şi C-I foarte frecvente în cazul moleculelor ARNt.
De reţinut că afinitatea relativă a perechilor G-C, A-Uşi G-U este 1 000,
100, 1
- datorită faptului că ARN are o structură monocatenară fiind
complementară doar cu una din cele două catene ale ADN(matriţă),
concentraţiile molare ale adeninei şi uracilului nu sunt neapărat egale
precum nici cele ale guaninei şi citozinei.
-Majoritatea tipurilor de ARN sunt implicate în unele aspecte ale sintezei
proteice
- ARN mesager (ARNm) transferă informaţia genetică din structura unei
gene codificată sub formă de ADN la locul sintezei proteice
-ARN ribozomal (ARNr) contribuie la formarea şi funcţionarea
ribozomilor (locul sintezei proteice)
- ARN de transfer(ARNt) moleculă adaptor pentru translatarea
informaţiei conţinută în ARNm într-o secvenţă specifică a unei
polipeptide
- Ribozime sunt molecule de ARN care prezintă o activitate catalitică
intrinsecă implicateîn procesare, de exemplu a transcriptului primar al
genei la molecula matură de ARNm. Un alt exemplu de ribozime este
peptidil transferaza, care catalizează formarea legăturii peptidice la
nivelul ribozomului.
-Majoritatea ARN sintetizat având ca matriţă ADN în celulele eucariote
este degradat în nucleu şi până la această oră nu se cunoaşte dacă ar
avea un rol structural sau informaţional
-Small nuclear RNA (ARNsn) sunt molecule mici de ARN de 20-300
nucleotide prezente la eucariote implicate în procesarea ARN(splicing)
- ARN-virusuri (retrovirusuri) precum HIV prezintă informaţia genetică
sub formă de ARN care este copiată într-o moleculă de ADNdc cu
ajutorul unei revers transcriptaze (o ADN polimerază ARN dependentă).
ADNdc după sinteză se integreazăîn cromozomul gazdei și în funcție de
locus poate induce mutații în cadrul genelor(oncogene).

ARN mesager
-cea mai heterogenă clasă de ARN în ceea ce priveşte mărimea şi
stabilitatea moleculelor. Conceptul de mesager a fost formulat pentru
prima dată de F. Jacob şi J.Monod în 1961 pentru care au primit premiul
Nobel pentru fiziologie şi medicină în 1965.
-reprezintă copii ale genelor ADN ce conţin secvenţa proteinei care va
trebui sintetizată în limbaj genetic ternar (aminoacizii sunt codificaţi de
triplete de nucleotide numite codoni). ARNm se sintetizează în procesul
de transcripţie al ADN.
- la procariote ARNm este o moleculă policistronică(fiind copia unui
operon ce codifică informaţia unui cluster de gene).
- la eucariote ARNm este monocistronic (codifică doar ogenă) fiind
format din exoni şi introni.
- utilizarea ARN mesager permite celulei să separe stocarea de utilizare
a informaţiei. În timp ce genele rămân izolate în nucleu, unde sunt parţi
integrante ale moleculelor enorme de ADN, informaţia acestora poate fi
comunicată unei molecule de ARN mobilă, mult mai mică şi capabilă să
treacă în citoplasmă. La acest nivel,molecula serveşte drept model
pentru a dirija incorporarea aminoacizilor într-o ordine specifică,
codificată de secvenţa nucleotidelor în ADN.
- folosirea ARNm permite celulei să-şi amplifice puternic activitatea. O
moleculă de ADN poate servi drept model pentru producerea unui număr
mare de moleculede ARN care, toate vor reprezenta matriţe pentru
producerea unui număr şi mai mare de catene polipeptidice, o moleculă
de ARNm putând să fie translatată de mai multe ori.
-în nucleul eucariotelor,în urma procesului de transcripţie, moleculele de
ARN nuclear heterogen (ARNnh) formează o colecţie de transcripţi
pentru numeroase gene nucleare:
i) transcripţi primari, mărimea lor este identică cu cea a genei;
ii)molecule parţial maturate care sunt lipsite de un număr variabil de
introni.
-moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colecţii
complexe de precursori care au suferit un complex proces de maturare.
-precursorii ARNm de la eucariote sunt procesaţi în nucleu înainte de
transportul ARNm în citoplasmă.
Acest proces constă în:
i)adăugarea structurii “cap”;
ii) poliadenilare în poziţia 3’;
iii)înlăturarea intronilor şi sudarea exonilor („splicing”).
-durata de viaţă a moleculelor de ARN mesager este scurtă. La bacterii
durata de viaţăa unui ARNm este de numai câteva minute. La eucariote
aceste molecule sunt mai stabile durata de viaţă variind de la câteva
minute la câteva zile. ARNm se reînnoieşte foarte repede, aceste
molecule fiind permanent produse şi degradate. Cu toate
acestea,aceeaşi moleculă de ARNm poate fi citită de mai multe ori la
nivelul ribozomilor.
- ARNm matur prezintă la capătul 5’ terminal un “cap”şi anume un rest
de 7-metilguanozinătrifosfat legat la 2’-O-metil-adenozină. Această
structură este implicată în recunoaşterea ARNm de către ribozomi la
locul sintezei proteice şi în prevenirea scindării ARNm de către 5’-
exonucleaze. Translaţia ARNm în catena plipeptidică începe după
secvenţa cap. La capătul 3’ hidroxi-terminal, ARNm matur prezintă o
coadă poliA, a cărei lungime variază de la 20-250 de nucleotide AMP.
Coada poliA se pare că protejează ARNm de atacul 3’-exonucleazelor.
Unele specii de ARNm precum cele ale histonelor nu prezintă o coadă
poliA.
- din punct de vedere cantitativ ARNm nu reprezintă decât câteva
procente (5%) din totalul moleculelor de ARN din celulă.
-etapa de descifrare, pas cu pas,a mesajului purtat de ARNm de către
ribozomi, pentru traducerea acestuia în catenă polipeptidică,este reglată
de motive în formă de agrafă(ac de păr) sau,în anumite cazuri, de
pseudo-noduri terţiare.
-informaţia genetică copiată în structura ARNm, în urma procesului de
transcripţie,este tradusă în structura proteinelor prin intermediul codului
genetic care realizează traducerea mesajului dintr-un cod format din
înlănţuirea repetitivă şi aleatoare a trei nucleotideîn altul, reprezentat de
alternanţa a 20 de aminoacizi. Fiecare aminoacid este codificat de una
sau mai multe secvenţe de trei baze,numite codoni, din structura ARNm.
Codul genetic este format din 64 de combinaţii posibile (codoni) dintre
care 61 specifică aminoacizi şi trei (UAA, UGA și UAG) semnalizează
încheierea traducerii (STOP).
Codonul de iniţiere, AUG codifică formil-metionină la procariote şi
metionină la eucariote.Codul genetic este degenerat deoarece
majoritatea aminoacizilor sunt codificaţi de mai mulţi codoni. Codul
genetic standard este comun pentru procariote şi eucariote. Mici
diferenţe au fost evidenţiate în cazul codului genetic al mitocondrilor.

Codul genetic standard

Codonul AUG care codifică pentru metionină este cel mai comun codon
start.
Trei dintre codoni UAA, UGA şi UAG funcţionează drept codoni STOP.
Se poate observa degenerescenţa codului genetic deoarece numai
metionina şi triptofanul sunt codificaţi de un singur codon,restul
aminoacizilor fiind codificaţi de doi la şase codoni.

ARN de transfer (ARNt)

- au rolul de a adapta fiecărui codon, prezent în structura ARNm,
aminoacidul corespunzător.
- există cel puţin 20 de tipuri de ARNt, corespunzătoare celor 20 de AA-
sunt molecule polinucleotidice mici de 75-90 de resturi nucleotidice a
căror funcţionalitate se bazează pe existenţa a două situsuri strict
specifice:
i) capătul 3’ care asigură fixarea unuia din cei 20 de aminoacizi,într-o
formă activată;
ii) capătul anticodon, structură complementară codonului din structura
ARNm
- o moleculă de ARNt are o serie de caracteristici datorate structurii sale
primare:
a) conţine nucleotide atipice, neobişnuite, prin natura bazelor pe care le
conţine(hipoxantinaal cărei nucleotid corespunzător este IMP,
dehidrouridina şi pseudouridina)
b) prezenţa timinei, o bază specifică ADN şi a altor baze metilate.
-aceste baze nu sunt incorporate în momentul sintezei ARN, ele sunt
obţinute prin modificarea secundară a uneia dintre cele patru baze, A, U,
C, G,întâlnite în mod normal în structura primară a ARN. Astfel,
hipoxantina provine din deaminarea guaninei din GMP şi TMP provine
prin metilarea UMP. Aceste modificări se numesc post-transcripţionale.

Structura secundară ARNt-„frunză de trifoi”

-structura se compune din patru braţe elicoidale:
1)extremitatea 3’ACC (constituită din trei nucleotide AMP, CMP şi CMP)
reprezintă tija care constituie braţul acceptor al aminoacidului care se
leagă covalent la hidroxilul liber din poziţia 3’a AMP proces catalizat de
aminoacil-ARNt sintetaza;
2)braţul purtător al anticodonului este o structură sub formă de agrafă a
cărei buclă formată din şapte nucleotide poartă anticodonul. Numim
anticodon grupul de trei nucleotide care este situat la nivelul unei bucle a
ARNt şi are capacitatea de a se împerechea prin legături de hidrogen cu
codonul purtat de ARNm într-o manieră antiparalelă şi complementară.În
cazul codonului şi anticodonului este absolut necesară precizarea
sensului de scriere a secvenţei. Astfel, anticodonul „3’UAC 5’”va lega
codonul„5’AUG 3’”
3)braţele D şi TCîşi datorează denumirile şi simbolurile faptului că
buclele lor conţin baze rare precum dehidrouridina (D)și
pseudouridina().Brațul D reprezintă situsul de recunoaștere pentru
aminoacil-ARNt sintetaza iar brațul TC este implicat în legarea ARNt la
nivelul ribozomilor.
4)buclă suplimentară, care reprezintă regiunea cea mai variabilă a
moleculelor de ARNt.
În funcţie de structura, la acest nivel distingem:
i) moleculele de ARNt de clasă 1,cele mai bine reprezentate şi care
prezintă un braţ suplimentar scurt de 3 la 5 nucleotide;
ii)moleculele ARNt de clasă 2 care posedă un braţ suplimentar lung de
13 la 21 nucleotide dintre care 5 sunt complementare.Împerecherea
secundară a bazelor determină formarea de elice constante. Dacă
parcurgem structura din direcţia 5’ către 3’ numărul de perechi de baze
din care acestea sunt formate este 7, 3 (sau 4), 5 şi 5.Împerecherile
bazelor sunt de tip Watson-Crick cât şi de alte tipuri.
Sistemul de numerotare de la 5’la 3’ (de la stânga la dreapta)a fost
utilizat pentru prima dată în cazul structurii ARNt de 76 nucleotide şi a
fost adoptată prin convenţie pentru reprezentarea normală a unei
molecule ARNt. Diferenţe între structurile secundare ale diferitelor
molecule pot să apară la nivelul buclei braţului D dar acestea nu
depăşesc însă 4 baze.Compararea secvenţelor moleculelor de ARNt
evidenţiază conservarea în poziţii invariabile a unor baze pirimidinice
sau purinice.

ARN ribozomal. Ribozomii

-Sediul sintezei proteice și sunt agregate multi-moleculare necovalente,
mari şi compacte de proteine şi ARN. Sunt formaţi din două subunităţi
diferite, ca mărime şi compoziţie, care în cazul micşorării concentraţiei
de ioni de Mg2+ se separă reversibil.
-Ribozomii procariotelor sunt de 70S şi sunt formaţi din două
componente: o subunitate mare (50S)şi o subunitate mică(30S). S este
prescurtarea pentru unitatea Svedberg care reprezintă măsura vitezei de
sedimentare prin ultracentrifugare. Coeficientul de sedimentare depinde
nu numai de masa dar şi de rigiditatea particulei. Astfel, se explică de ce
asamblarea subunităţilor 50S şi 30S poate da particule caracterizate
printr-o constantă de sedimentare de 70S.
- Fiecare dintre aceste subunităţi sunt formate dintr-un amestec de
proteine, denumite proteine ribozomale şi ARN ribozomal (ARNr).
Subunitatea 30S conţine: i) o moleculă ARNr 16S de 1 542 nucleotide;
ii) 21 deproteine diferite, prezente într-un singur exemplar. Proteinele au
fost denumite de la S1 la S21.În cazul proteinelor ribozomale, S are
semnificaţia „small”şi desemnează proteinele care intră în constituţia
subunităţii mici. Ansamblul ARNr împreună cu proteinele ribozomale are
o masă de aproximativ 900 kDa.
Subunitatea 50S conţine: i) o moleculă ARNr 5S de 120 nucleotide;
ii) o moleculă ARNr 23S de 2 904 nucleotide;
iii) 34 proteine ribozomale denumite L1 la L31. Treizeci dintre aceste
proteine se găsesc într-un singur exemplar iar una dintre proteine în
patru exemplare. Ansamblul proteine-ARN al subunităţii mari are
aproximativ 1,6 milioane Da.În momentul asamblării subunităţii mici cu
cea mare între cele două subunități se formează o fosă la nivelul căreia
va trece ARNm în timpul traducerii sale în proteine.
La eucariote ribozomii sunt mai mari de 80S,cele două subunităţi fiind de
40S şi respectiv 60S.
Compoziţia acestora este diferită în ceea ce priveşte tipurile de ARNr şi
numărul proteinelor din care aceştia sunt constituiţi.
Subunitatea mică 40S conţine o moleculă de ARNr 18S şi 33 de proteine
ribozomale.
Subunitatea mare 60S conţine trei molecule ARNr (5S, 5,8S şi 28S) şi
50 proteine ribozomale.
Diferenţele structurale între ribozomii eucariotelor şi procariotelor sunt
importante deoarece antibioticele care acţionează la nivelul ribozomilor,
pot să aibă o acţiune specifică asupra ribozomilor bacterieni fără a
afecta ribozomii organismului gazdă.

ARN cu rol catalitic

- dogma că numai proteinele au activitate enzimatică a fost total
infirmată
-T. Cech,în 1981 studiind molecula ARNr 26S de la protozoarul termofil
Tetrahymena a demonstrat că acest ARN este derivat dintr-un precursor
ARN brut obţinut în urma transcrierii care suferă un proces de
maturare(„splicing”) prin înlăturarea unui intronde 400 baze. Reacţia de
maturare (înlăturarea intronului) este catalizată de însăşi molecula de
ARN iar intronul eliberat devine un catalizator activ în procesul de
maturare a altor molecule de ARN.
-în 1983, s-a demonstrat că ribonucleaza P, enzimă implicată în
maturarea unui precursor ARNt la bacterii are o structură neobişnuită
fiind compusă dintr-o proteină şi o moleculă de ARN. Activitatea
enzimatică era datorată moleculei de ARN iar partea proteică are numai
rol de structurare conformaţională a ribonucleazei.

Ribozime- molecule de ARN dotate cu activitate enzimatică care poate

fi direcţionată către substrate separate sau către propria moleculă(„auto-
splicing”sau auto-maturare).
Tipuri de ribozime:
a)Enzima ribonucleaza P, ribonucleoproteină formată dintr-o moleculă
de ARN cu activitate catalitică legată la o proteină
b)Introni care fie posedă capacitatea de a-şi realiza propria maturare din
pre-ARNm în care sunt conţinuţi fie conţin faze de lectură care pot fi
traduse în proteine/enzime precum maturaze şi endonucleaze.
d)Moleculele mici de ARNdin clasa viroizilor şi virusoizilor care au
capacitatea de a realiza reacţii de auto-clivare. Cu toate că aceste reacţii
sunt intramoleculare, molecula poate fi împărţită într-o parte „enzimatică”
şi o parte„substrat” ale căror funcţii sunt independente.
c)Molecule de ARN mici „snRNA-smallnuclear RNA” care participă la
reacţiile de înlăturarea a intronilor şi sudare a exonilor(„splicing”).În
procesul de„splicing”sunt implicate cinci molecule mici bogateîn
uracil(U1, U2, U4, U5,şi U6) cu dimensiuni cuprinse între 107 la 210
nucleotide. Asocierea secvenţială a acestora cu un număr de şase la
zece proteine formează„snRNP”(„smallnuclear ribonucleoprotein
particles”) care împreună cu pre-ARNm constituie complexul
ribonucleoproteic numit spliceozom. U3 se pare că este implicat în
maturarea transcriptului pre-ARNr la ARNr. U7 este implicat în
producerea corectă ca extremității 3' a histonelor lipsite de coadapoly(A).

Tipuri de ARN regulatori non-codificanți

(ARNnc): micro ARN (mi ARN),ARN mic de
interferență (si ARN)și ARN lung care nu
codifică(lnc ARN)
ARNc-urile constituie două clase mari în funcție de mărimea lor,cele
mari (50-1000 nt) și cele mici(20-22 nt) și au fost descrise în majoritatea
eucariotelor.
ARNnc mici numite miARN și siARN provoacă, în general, inhibarea
expresiei genice prin țintirea ARNm-urilor printr-un mecanism specific.
miARN-urile sunt derivate din maturarea nucleolitică specifică a
produselor genice distincte sau a unităților de transcripție.
Precursorii miARN, care au un cap în poziția 5’și sunt poliadenilate în 3’,
au dimensiuni cuprinse între 500 și 1000 nt.
Estimările sugerează că există aproximativ 1.000 de gene umane care
codifică miARN-uri. Si ARN-urile provin din scindarea enzimatică
specifică a ARN-urilor dublu catenare mari (dcARN), care provin fie din
alte ARN endogene, fie din ARN care au fost introduse în celulă, de
exemplu de către virusuri.
siARN și miARN formează deobicei hibrizi ARN-ARN cu un ARNm țintă.
Datorită specificitățiilor genetice perfecte, miARN-urile și siARN-urilere
prezintă noi obiective potențiale interesante pentru dezvoltarea de
medicamente.
siARN-urile sunt frecvent utilizate pentru a reduce nivelul de proteine
specifice sau pentru a le stinge (prin degradarea țintită a ARNm prin
omologia sa cu siRNA).

Biogeneza miARN-urilor și a siARN-urilor (ARN

de interferență)
Genele care codifică miARN trebuie să aibă propriul promotor,regiunea
lor de „codificare” și semnale determinare/poliadenilare.
Genele care codifică miARN sunt transcrise deARN pol II,transcriptul
primar (pri-miARN) are un cap în poziția 5’și este poliadenilat la fel ca
transcripții primari ARNm.
Pri-mi ARN suferă o maturizare nucleară sub acțiunea nucleazei
Drosha-DGCR8, care taie niște secvențe de la capetele 5 'și 3' generând
pre-miRNA.
Partea precursorului care conține o structură de ac de păr de tip ARN
este conservată și transportată prin porul nuclear cu ajutorul exportinei
5.
Odată ajuns în citoplasmă,suferă o maturizare suplimentară în prezența
complexului nucleazic Dicer-TRBP cu formarea unui duplex de 21 până
la 22 pb în lungime.
În cele din urmă,una dintre cele două catene este selectată pentru a fi
integrată în complexul RISC (RNA induced silencing complex), care este
compus dintr-una din cele patru proteine Argonaute (Ago1până la 4)
formându-se un miARN monocatenar matur funcțional de la 21 la 22 nt.
După ce întâlnește complexul RISC întâlnește ARNm-țintă are loc forma
un hibrid miARN-ARNm pe o anumită secvență specifică.
miARN funcțional poate modul afuncționarea acestui ARNm prin unul
dintre următoarele trei mecanisme: inhibarea translațională prin țintirea
factorului de translație eIF4 legat la capul 5'-metil,degradarea cozii poliA
a ARNm prin de-adenilare sau prin degradarea ARNm.
siARN funcționale provin din ARN-uri dublu-catenare mari formate fie
intracelular prin hibridarea ARN-ARN (inter sau intramolecular), fie din
surse extracelulare, cum ar fi ARN-uri virale.
Aceste ARNdc sunt maturate de către nucleaza Dicer heterodimerică în
segmente ARNdc de aproximativ 22 pb. Aceste ARNdc sunt înglobate în
complexul RISC ce conține proteina argonaut Ago2 și una dintre catene
este selectată pentru a genera siARN.
Acesta va localiza secvențele țintă din cadrul unui ARNm cu formarea
unu ihibrid si ARN-ARNm.
Acest complex ternar ARN- si RNA-Ago2 induce clivajul ARNm țintă,
care este inactivat.
Identificarea și caracterizarea ARN-urilor lungi necodificatoare sau a
LncARN constituie o altă descoperire interesantă recentă din domeniul
ARN.
LncARN, după cum sugerează și numelelor, nu codifică o proteină și au
dimensiuni de aproximativ 300 până la 1000 de nucleotide.
Aceste ARN sunt,în general,transcrise din regiuni mari ale genomului
eucariot care nu codifică o proteină.
Analizele transcriptomice indică faptul că peste 90% din ADN-ul genomic
eucariot este transcris.
ncARN constituie o parte semnificativă a acestei transcrieri.
ncARN-urile au multe roluri, de la contribuția la aspectele structurale ale
cromatinei, la reglarea transcrierii genelor în ARNm de către
ARNpolimeraza II.
În viitor,cercetările se vor axa pe caracterizarea suplimentară a acestei
noi clase importante de molecule de ARN.
Organizarea,Replicarea și
Repararea ADN
Importanța biomedicală
Informația ADN de la nivelul cromozomilor poate fi transmisă
descendenților întocmai prin procesul de replicare care are loc în
interfaza S a ciclului celular sau se poate modifica printr-un număr de
procese precum: crossing over (egal sau inegal),recombinare,
transpoziție și conversie.
Aceste procese asigură adaptabilitatea și diversitatea indivizilor din
cadrul speciei precum și evoluția speciilor,însă în cadrul acestor procese
este posibil să apară mutații sau aberații cromozomiale care constituie
baza maladiilor genetice.
Mutațiile se datorează modificărilor de la nivelul secvenței ADN și pot
rezulta dintr-o replicarea defectuoasă, din mișcarea incorectă a ADN
polimerazei sau din procesul de repararea a ADN-ului.
Mutațiile apar cu o frecvență de 1 la 106 diviziuni celulare.
Modificări ale funcției sau a nivelului de expresie unei proteine pot apare
dacă mutațiile au loc la nivelul secvențelor codificatoare sau reglatoare
ale genelor.
Mutațiile care survin în timpul diviziunii meiotice se transmit
descendenților(transmitere pe verticală).
Mutațiile care afectează doar celulele somatice(diviziune mitotică)
afectează doar celulele unui singur organism,fiind mutații cu transmitere
pe orizontală.Factorii externi ce pot induce mutații la nivel de ADN sunt:
virusurile, substanțele chmice, radiațiile UV și ionizate.
Majoritatea maladiilor genetice și a cancerele se datorează efectelor
combinate a transmiterii mutațiilor pe verticală și orinzontală.
CROMOZOMUL EUCARIOTELOR ESTE
CONSTITUIT DIN CROMATINĂ
Cromatina este formată din:
- moleculă lungă ADNdc
- o cantitate egală de proteine bazice cu masă mică numite histone
împlicate în condensarea ADN
-o cantitate mică de proteine acide nehistonice cu masă moleculară mai
mare decât a histonelor incluzând enzimele implicate în replicarea,
transcripția și repararea ADN
- o cantitate mică de ARN.
Lungimea ADNdc dintr-un cromozom este de mii de ori mai mare decât
diametrul nucleului unei celule.
Studiile de microscopie electronică a cromatinei au demonstrat existența
unor particule sferice dense numite nucleozomi de 10 nm în diametru
conectate prin filamente scurte de ADN dc.Nucleozomii sunt formați
dintr-un miez compus din histone și ADNdc ce se înfășoară în jurul
acestuia.
Unitatea organizatorică și structurală a cromatinei este nucleozomul.

Histonele
-o familie de proteine bazice cu structură și funcție asemănătoare.
-histonele H1 sunt cel mai slab legate de cromatină și pot fi îndepărtate
în prezența unor soluții saline.
-miezul nucleozomului este constituit din patru clase de
histone:H2A,H2B, H3 și H4.
Structura acestor proteine este înalt conservată în cadrul speciilor.
O treime din moleculă, situată la capătul amino terminal este bogată în
aminoacizi bazici (Lys, Arg,Hys) pe când două treimi din moleculă au o
compozițieîn aminoacizi aleatorie.
-structura și funcțiile cromatinei sunt reglate prin modificări covalente la
nivelul histonelor:
1. Acetilarea histonelor H3 și H4 este asociată cu activarea/inactivarea
genelor
2. Acetilarea histonelor ce constituie miezul nucleozomului este asociată
cu asamblarea cromozomilor din cadrul replicării ADN.
3.Fosforilarea histonelor H1 este asociată cu condensarea cromozomilor
care are loc înaintea diviziunii celulare.
4. ADP-ribozilarea histonelor este asociată cu procesul de reparare al
ADN
5.Metilarea histonelor este corelată cu activarea/represia genelor.
Histonele H3 și H4 formează un tetramer (H3/H4)2, care coordonează
formarea unui octamer histonic prin asocierea cu doi dimeri(H2A-H2B)
ce constituie miezul nucleozomilor (H3/H4)2(H2A-H2B)2.

Structura nucleozomului
ADN este superîncolăcit 1,75 ture către stânga pe suprafața octamerului
protejând astfel 146 pb de digestia nucleazelor.
Histonele ce constituie octamerul interacționează cu ADNdc pe fața
internă a superîncolăcirilor iar cozileamino-terminale ale histonelor ies în
a fara acestei structuri și sunt disponibile pentru modificările covalente
implicate în reglarea genelor și compactării cromatinei.
Tetramerul (H3/H4)2 are un rol central în formarea nucleozomului, iar
adiția celor doi dimeri stabilizează structura particulei.
Nucleozomii sunt legați între ei printr-o regiune ADNdc de 30 pb dând
naștere unei structuri asemănătoare cu un colier de perle “beads-on-a-
string” cu diametrulde 10 nm.
Asamblarea nucleozomilor este mediată de factori de asamblare sau
chaperoni precum proteina nucleară anionică nucleoplasmina.
Superîmpachetarea nucleozomilor în structuri din ce în ce mai compacte
în cadrul cromozomului se pare că este dependentă de interacția dintre
histonele H1 și nucleozomii adiacenți.
In cadrul cromozomilor din metafază,fibrele de cromatină sunt
organizate în domenii sau bucle de 30-100 kpb care sunt ancorate de o
matrice proteică (proteine de eșafodaj) cu diametru de300 nm.
Se pare că aceste bucle sau domenii formate din regiuni codificatoare și
necodificatoare corespund unor gene sau familii de gene înrudite, deci
dispunerea lor nu este aleatoare.
Fibrilele de cromatină cu diametrul de30nm se formează prin
superîncolăcirea în continuare a fibrilei de 10 nm având o tură formată
din 6-7 nucleozomi în prezența H1.
ADN din cadrul cromozomilor din metafază este aproape inert
transcripțional.
Cele cinci nivele de compactizare ale ADN-ului conduc la scăderea
lungimii ADNdc de aproape 104 ori în cadrul unui cromozom.
Decondensarea completă și recondensarea ADNdc liniar din cadrul
cromozomilor se produce în câteva ore în timpul interfazei S când are
loc replicarea ADN.

REGIUNILE ACTIVE ȘI INACTIVE ALE

CROMATINEI
Celulele metazoarelor conțin aceeași informație genetică.
 Diferențele dintre diferitele tipuri celulare dintr-un organism pot fi
explicate pe baza expresiei diferite a informației genetice comune
existentă în nucleu.
Cromatina genelor active transcripțional diferă de cea a regiunilor
inactive.
ADNdc din cadrul cromatinei active conține regiuni întinse de circa 100
kbp care sunt sensibile la digestia cu nucleaze cum ar fi DN-aza I
(hidrolizează nespecific legăturile 3’,5’-fosfodiesterice dintr-o singură
catenă fără o specificitate anume de secvență în nucleotide).
Regiunile active ale cromatinei sunt corelate cu lipsa 5-metil
deoxicitidinei din ADN precum și cu histone specific modificate covalent.
În cadrul regiunilor de cromatină activă există secvențe scurte de 100-
300 pb care prezintă în plus o sensibilitate de 10 ori mai mare la DNazaI
numite situsuri hipersensibile.
Aceste regiuni sunt localizate imediat în amonte de o genă activă
transcripțional la nivelul cărora se leagă proteinele cu rol reglator,numite
factori transcripționali, regini cu structură nucleozomală întreruptă.
Proteinele reglatoare implicate în controlul transcripției și cele implicate
în menținerea accesului la catena template sunt localizateîn regiuni
hipersensibile ale cromatinei.
Cromatina activă transcripțional este mai puțin densă și se numește
eucromatină.
Aceasta este replicată înaintea heterocromatinei în interfaza S a ciclului
celular.
Studiile de microscopie electronică au demonstrat că heterocromatina
sau cromatina inactivă transcripțional este foarte dens compactată în
timpul interfazei întîrziind astfel replicarea ei.
Există două tipuri de heterocromatină:
- heterocromatina constitutivă,care este în permanență condensată și
inactivă, fiind situată în general în imediata apropiere a centromerului și
la nivelul telomerelor.
-heterocromatina facultativă, care în funcție de tipul celular poate fi
activă sau inactivă transcripțional.
În celulele mamiferelor de sex feminin, unul din cei doi cromozomi X
este aproape în permanență inactiv transcripțional fiind heterocromatic.
Totuși în cadrul procesului de gametogeneză, cromozomul X
heterocromatic se decondenseză și devine activ transcripțional în
procesul de embriogeneză.

TIPURI DE CROMOZOMI
În metafază, cromozomii sunt extrem decondensați și prezintă o simetrie
sagitală fiind format din două cromatine surori conectate printr-o regiune
numită centromer care poate fi localizată în diferite poziții.
În funcție de poziția centromerului, cromozomii pot fi: metacentrici,
submetacentrici, acrocentrici, telocentrici,acentrici.
Centromerul este bogat în secvențe AT depână la102pb (drojdii)și de
106pb (mamifere).
Centromerul leagă specific cu o mare afinitate anumite proteine formând
kinetochorul.
Acest complex are funcția de a ancora cromozomul la nivelul fusului de
diviziune.
Cromozomul se termină în structuri denumite telomere care sunt
constituite din regiuni scurte cu secvență repetitivă de tipul TG/AC.
Telomeraza,o enzimă înrudită cu RT virală este responsabilă de sinteza
și menținerea lungimii telomerelor.
Scurtarea telomerelor a fost asociată cutransformarea malignă și cu
procesul de îmbătrânire.
Astfel, telomerza este o țintă pentru medicamentele utilizateîn tratarea
diverselor tipuri de cancere.
GENOMUL-totalitatea materialului genetic al unui organism și este
format din întregul set de cromozomi al unui organism. Organismele
diploide 2 n-au două seturi complete de cromozomi (unul de la mamă și
unul de la tată).
Omul și șoarecele au genomul haploid format din~ 3 X 109bp subdivizat
în 23 și respectiv 20 de cromozomi.
Genomul șoarecelui este cu~14% mai mic decât al omului avînd rata
delețiilor mai mare.
Cele două genoame conțin gene similare, majoritatea genelor umane
având un ortolog corespunzător în genomul șoarecelui.
Genomul la șoarece conține 30.000 de gene ce codifică pentru proteine,
4000 pseudogene și 800 gene ce codifică pentru tipurile de ARN.
Pseudogenele față de genele normale nu sunt capabile să conducă la
sinteza unei proteine sau a unei molecule de ARN datorită prezenței
unor mutații care au condus la apariția unui codon STOP prematur sau
la modificarea cadrului de citire a informaiei genetice.
Genomul uman este constituit din~ 3.3 X 109bp, ce poartă informația
pentru 30000-40000 de gene(exoni plusintroni)ce reprezintă~25% din
genom.
Regiunile codificatoare (exonii)reprezintă~1.1%din genomul uman.~
60%din genele umane sunt supuse procesuluide spliceing alternativ,
conducând la sinteza a~50000-60000 de proteine.

Cromozomii sunt relativ săraci în gene, fiind

constituiți dintr-un procent mare de secvențe tip
balastru "deserts sequences”
Cu ajutorul tehnici de hibridizare/renaturareși pe baza determinării
vitezei de hibridizare/renaturare s-a demonstrat că ADN celulelor
eucariote conţine secvenţe repetitive prezenteîn mai mult de o copie per
genom haploid.
-eucariotele inferioare au 20% din genom secvenţe repetitive
-animalele au mai mult de 50% din genom format din secvenţe repetitive
-plantele au peste 80% din genom format din secvenţe repetitive
1.Secvenţe nerepetitive– se află într-o singură copie în genomul
haploid. În majoritatea lor sunt gene şi secvenţe alăturate implicate în
exprimarea acestora,şi au fost identificate ca având rata renaturării ce
mai mică.
2.Secvenţe repetitive–formate din secvenţe relativ scurte care se pot
repeta de zeci-mii de ori într-un genom haploid. Sunt dispersate în întreg
genomul şi sunt formate din gene ce codifică pentru ARNr,ARNt şi
histone precum şi din elemente transpozabile și secvențe simple
repetitive. Astfel,genle pentru ARN se aflăîn peste 100 de copii per
genom iar genele pentru histone la mamifere se repetă de 20 de ori.
3.Secvențe intergenice–separa secvențele genice.
Secvențele repetitive se pot clasifica în:
-secvențe moderat repetitive sau transpozoni 42-45%
-secvențe înalt repetitive: secvențe simple3-6%.

Transpozonii
-secvențe ADN care se pot muta într-un genom dintr-o locație în alta-se
mai numesc elemente ADN mobile sau elemente transpozabile
-“ADN egoist”- există doar pentru sine?
-procesul de transpoziție reprezintă procesul prin care o secvență de
ADN se mută dintr-o regiune în alta a genomului
-au avut un rol determinant în evoluția speciilor.
Elementele ADN mobile,în funcție de mecanismul de transpoziție sunt
clasificate în:
-transpozoni ADN
-retrotranspozoni.
Transpozonii ADN se mută dintr-un loc în altul în genom printr-un
mecanism de tipul "cut-and-paste".
Retrotranspozonii se mută dintr-un loc în altul în genom prin intermediul
unui ARN utilizând un mecanism de tipul "copy-and-paste", caracterizat
prin faptul că exemplarul original al transpozonului este păstrat.
Retrovirusurile precum HIV, reprezintă o subclasă a retrotranspozonilor
care se pot muta dintr-o celulă în alta deoarece au capacitatea de a
codifica proteinele capsidei virale.
Transpozonii ADN predomină la bacterii iar retrotranspozonii sunt
prevalenți la eucariote.

Elementele ADN mobile de la procariote

ADN transpozonii bacteriilor poartă numele de secvențe de inserție
„insertion sequences”(IS).
Elementele IS au o lungime de 1-2kbp de ADN care suferă procesul de
transpoziție în cadrul genomului bacterian.
Transpoziția este mediată de o enzimă codificată de scvența
transpozomului numită transpozază.
Inserția elementului IS în alt loc pe cromozomul bacterian induce de
regulă inactivarea unei gene având consecințe negative.
E. coli codifică pentru~20 de tipuri de elemente IS.
Acestea sunt tolerate în cromozomul bacterian datorită ratei mici de
transpoziție (1 la105-107 celule per generație).
Rata scăzută a transpoziției se datorează unei transcripții slabe a genei
transpozazei.
Elementele IS conțin la capetele secvenței codificatoare secvențe
repetate invers de circa~50bp care sunt cruciale în procesul de
transpoziție.
Mecanismul de transpoziție al elementelor IS
Procesul de transpoziție are loc în trei etape:
-Excizia elementului din cadrul ADN donor și inserarea acestuia în ADN
țintă este mediat de transpozază (etapa 1 & 2).
Aceasta leagă elementul IS la capetele 5’ ale ADNdc al țintei.
-ADN polimeraza ADN dependentă umple golurile rămase la capetele
3’ale ADN țintă după inserarea IS iar ligaza reface legătura 3’,5’-
fosfodiesterică dintre ADN țintă și IS (etapa3).
Transpozaza produce capete lipicioase la locul tăierii ADN țintă
conducând la formarea unor secvențe scurte direct repetate ce
flanchează elementul IS în ADN țintă la situsul de inserție.
ADN transpozonii eucariotelor au o lungime de 2-3 kpb și constituie 3%
din genom.
Mecanismul de transpoziție este același ca al IS. Uneori,în cadrul
procesului de transpoziție pot transfera și gene dintr-un loc în altul în
genom, iar dacă procesul are loc în timpul replicării are loc creșterea în
volum a genomului.

Procesul de revers transcriere la retrovirusuri

Genomul constă din două molecule de ARN monocatenar de sens
pozitiv cu structură cap în 5‘ și o coadă poliadenilată în 3'.
Gag- codifică proteinele structurale ale virusului
Pol-codifică o revers transcriptază,și o ADN integrază.
Env-codifică pentru o glicoproteină care recunoaște receptorii de
membrană ai celulei gazdă și inițiază procesul de infecție.
Procesul de RT este extrem de predispus la erori,iar în această etapă se
pot produce mutații.
Astfel de mutații pot provoca rezistență la medicamente.
Pe măsură ce HIV utilizează RT pentru a-și copia materialul genetic și
pentru a genera noi virusuri, au fost concepute medicamente specifice
pentru a întrerupe procesul de RT.
Aceste medicamente includ analogii nucleozidici și nucleotidici.
Tehnica PCR clasică poate fi aplicată numai ADNdc, dar, cu ajutorul RT,
ARN poate fi transcris în ADNc, făcând astfel posibilă analiza PCR a
moleculelor de ARN.
Tehnica se numește reacția în lanța polimerazei cu transcripție inversă
(RT-PCR).

Retrotranspozonii
Retrotranspozonii eucariotelor reprezintă42% din genom și pot fi:
-LTR retrotranspozoni (Long direct terminal repeats)
-non-LTR retrotranspozoni
Retrotranspozonii LTR au regiunea codificatoare flancată de secvențe
repetitive directe de circa 250-600bp.
LTR retrotranspozonii au o lungime de 6-11 kb și prezintă multe
asemănări cu retrovirusurile.
LTR retrotranspozonii se repetă în genom de 440.000 de
ori,reprezentând cam 8%din genom.
Ei codifică pentru revers transcriptază și o ADN integrază.
Aceștia au absente genele Gag și Env ce le permit retrovirusurile să
treacă de la o celulă la alta.
Transpoziția are loc printr-un ARN-intermediar transcris de către ARN-
polimeraza II care recunoaște promotorul regiunii codificatoare care se
află în cadrul secvenței repetitive de la capătul din stânga al regiunii
codificatoare lanivelul LTR.
Transcriptul ARN primar este poliadenilat formând ARN retroviral
genomic.
ARN al LTR retrotranspozonului este transcris în ADN cu ajutorul
reverstranscriptazei înainte de inserția elementului în ADN țintă.
ADN integraza inseră ADN retroviral sau al LTR retrotranspozonilor în
ADN țintă genomic printr-un mecanism asemănător cu cel descris în
cazul elementelor IS.
Astfel are loc producerea secvențelor direct repetate (5-10pb) la
capetele secvenței ADN retrovirale inserate în ADN țintă.
Majoritatea LTR retrotranspozonilor sunt nefuncționali datorită
recombinării dintre elementele LTR.

Retrotranspozonii non-LTR
Non-LTR retrotranspozonii sunt subdivizați în:
-long interspersed elements(LINEs, ~6 kb)cu o prevanență~9 x 105
copii/genom
-short interspersed elements(SINEs, ~300bp)cu o prevanență~1.6 x 10 6
copii/genom.
LINEs sunt grupate în trei familii L1, L2,și L3,însă doar L1 sunt active.
Elementele L1 au următoarele secvențe:
- regiunea netranslatată(un translate dregion-UTR)ce include regiunea
promotoare a ARN polimerazei II;
- două regiuni codificatore cu cadre de citire nesuprapuse(open reading
frames ORF1~1kb și ORF2~4kb), ORF 1 codifică pentru o proteină care
leagă ARN iar ORF 2 codifică o enzimă bifuncțională cu activitate
endonucleazică și revers transcriptazică, urmate de situsul poli(A).
Elementele SINEs nu codifică pentru o revers transcriptază pentru a-și
cataliza transpoziția, ele având capacitatea de a utiliza enzimele
elementelor LINEs.
Cele mai abundente SINE sunt elementele Alu, ce conțin în secvență un
situs de restricție pentru enzima AluI.
Elementele Alu sunt importante în duplicarea diferiților loci.

Mecanismul de Transpoziției
Transcriptul primar LINE este translatat în endonuclează și revers transcriptază la
nivelul citosolului.
Apoi, ARN-ul și enzimele se întorc în nucleu.
Endonucleaza și revers transcriptaza catalizează integrarea LINE într-o regiune
bogată în AT a ADN genomic.
Coada poly(A) a ARN LINE selectează situsul de integrare 3’TTTATG5’.

Multe din elementele LINE au o regiune a UTR terminală

trunchiată datorită reverstranscrierii incomplete a ARN a
elementului în ADN.
Astfel, la ora actuală doar 0.01%din elementele LINE sunt
funcționale(~100 pergenom).
Rata transpoziției elementelor LINE & SINE este în jur de~1 la 8
indivizi dintr-o populație.
Elementele LINE & SINE și transpoziția lor au fost și sunt
implicate în:
-apariția bolilor genetice,1/600 mutații care conduc la boli
genetice sunt datorate transpoziției elementelor LINE & SINE
-fenomenul de transpoziție a fost crucial în evoluția genomurilor și
a speciilor.
-proteinele codificate de ORF 1 și ORF 2 LINE se pare că sunt
responsabile de inserția pseudogenelor procesate la nivelul ADN
genomic.

Elementele ALU
Majoritatea sunt derivate din ARNt;
Alu sunt 7S-ARN;
Sunt dependente de alte enzime pentru transpoziția lor,fiind paraziți
(ARN Pol II pe de o parte și endonucleaza și revers transcriptaza
elementelor LINE pe de alta);

Recombinarea exonilor prin crossing over inegal

dintre geneneomoloage datorat omologiei
secvențelor elementelor repetitive
Evoluția genelor a implicat amestecarea exonilor aparținând
regiunilor codificatoare din genom.
Prevalența mare a transpozomilor în geom a favorizat acest
proces.
Secvența elementelor LINE și SINE înalt conservtă a favorizat
fenomenul de crossing over dintre gene neomoloage conducând
la formarea de noi gene care sunt translatate în proteine ce au o
altă constelație a domenilor proteice.
Acest fenomen este important în duplicarea genelor și exonilor.
Crossing-over normal:are loc recombinarea genică în profaza I
ameiozei.
Crossing-over inegal:cromozomii omologi nu se împerechează
corect,astfel ia naştere un cromozom cu o genă duplicată şi unul cu o
deleţie totală sau parţială a unui segmentde ADN. Duplicaţia a avut un
rol însemnat în evoluţia eucariotelor.

Recombinarea exonilor cu ajutorul

transpozonilor ADN
Fenomenul de amestecare a exonilor are loc și prin mecanismul
de cut-and-paste transpositions mediat de transpozonii ADN.
Acest fenomen are loc dacă un exon este flancat de două copii
ale unui transpozom.
Dacă transpozaza taie doar la unul dintre capetele celor doi
transpozomi la nivelul secvențelor repetate în sens invers, cei doi
transpozomi și exonul mărginit de aceștia vor suferi fenomenul de
transpoziție în bloc.
Astfel, Gena 1 va pierde un exon iar Gena 2 va avea un exon în
plus.

Recombinarea exonilor datorat transpoziției

elementelor LINE
Când un element LINE are un semnal (secvență) slabă poly(A),
polimeraza ARN II va transcrie în aval de capătul elementului
LINE, putând continua procesul la următorul exon.
Dacă exonul transcris în ARN are un semnal poly(A) puternic,
transcripția se oprește iar capătul ARN transcris este poliadenilat.
Elementul LINE+ exonul în prezența endonucleazei și revers
transcriptazei proprii este inserat la nivelul ADN la locusul țintă
care poate fi o altă genă care va conține un exon nou dând
naștere unei proteine cu un domeniu suplimentar.

Secvențe ADN înalt repetitive

Secvențele înalt repetitive au o lungime de 1–500pb,se repetă de mii de
ori în genom și reprezintă~ 6%din genomul mamiferelor.
 Datorită unităţilor scurte de nucleotide care se repetă şi a structurii lor
simple au fost denumite secvenţe simple repetitive (SSRs).
Au cea mai mare rată de renaturare dintre toate secvențele repetitive.
Aceste secvențe ADN nu sunt transcrise în ARN și nici nu sunt
translatate la o catenă polipeptidică.
Repetarea în tandem a acestor secvenţe scurte crează o fracţie ADN cu
o compoziţie în nucleotide şi cu proprietăţi fizice diferite de restul
genomului şi pot fi separate prin ultracentrifugare în gradient de
densitate într-o fracţie numită ADN satelit.
La eucariote se disting ADN satelit uşor, cu un procent ridicat în AT şi
ADN satelit greu cu un procent ridicat în GC.
Funcția SSRs este obscură, ele fiind prevalente la nivelul centromerului
și telomerelor cromozomilor, formând zone de heterocromatină.
În funcţie de numărul de perechi de baze care se repetă în tandem,
SSRs sunt împărţite în 3 categorii:ADN satelit clasic, formate din unități
de secvențe de14-500 bp care se repetă în tandem în ADN genomic pe
distanțe de peste 20-100 kb în lungime.
-ADN minisatelit,formate din secvențe de 15-100 pb care se repetă în
tandem pe lungimi de peste1-5 kb în ADN genomic.
-ADN microsatelit sunt secvențe de 1-13 bp care se pot repeta de până
la 150 ori într-un locus pe cromozom.
Cele mai comune și frecvente repetiții sunt cele dinucleotidice de
tipul(CA)n, (AC)n, (GA)n sau trinucleotidice precum(CAG)n, (CGG)nand
(CTG)n.
La un anumit locus pe cromozomii omologi,numărul acestor repetiții
poate varia, conducând la heterozigoți a acelui locus într-o populație sau
la polimorfismul microsateliților.
Variabilitatea SSRs apare în timpul replicării prin fenomenul de
alunecare a polimerazei “backward slippage” sau princrossing overul
inegal în timpul meiozei.
Secvența SSRs este foarte conservată în cadrul speciilor însă diferă prin
numărul de repetiții la un anumit locus.
SSRs sunt utilizate ca markeri ADN datorită numărului variabil de
repetiții la un anumit locus.

Amprentarea genică„DNA Fingerprinting”

Amprentarea genetică este o metodă utilizată în vederea identificării
individuale bazată pe studierea variabilității microsateliților.
Tehnica este utilizată în criminalistică, în efectuarea testelor de
paternitate,pedigree,conceptul„farm-to-fork”-trasabilitatea alimentelor și
în cercetare(filogenie).
Metoda constă în amplificarea prin PCR a fragmentelor de ADN genomic
ce conțin zone de microsateliți utilizând primeri ce se leagă la secvențe
unice de ADN ce flanchează zonele de microsateliți(cu secvență
conservată la indivizii unei specii).
Produșii PCR obținuți sunt separați prin electroforeză iar benzile sunt
comparateîn pb la fiecare locus analizat.

Rolul repetiților trinucleotidice în inducerea

bolilor genetice
Creșterea numărului de repetiții trinucleotidice la un anumit locus pe
cromozom este răspunzătoare de apariția unor zone numite de
instabilitate, asociate cu apariția diverselor boli genetice.
Secvența repetitivă instabilă p(CGG)este asociată cu sindromul
cromozomului X fragil.
Creșterea numărului de repetiții p(CGG) afectează gena„Fragile X
mental retardation 1”(FMR1)de la nivelul cromozomului X al cărui produs
este necesar pentru dezvoltarea neuronală normală.
În funcție de numărul de repetiții trinucleotidice, alelele de la acel locus
sunt clasificate ca normale, asociate cu riscul apariției sindromului și
afectate de sindrom.
Jumătate din copii diagnosticați cu acest sindrom au elemente grave de
autism.
Sindromul se manifestă cu precădere la băieți, manifestând retard
mental, o față și urechi alungite precum și mișcări stereotipice.
Alte secvențe repetitive trinucleotidice asociate cu dezvoltarea unor
sindroame:
-Sindromul HuntingtonCorea (CAG)n,
-distrofia miotonică(CTG)n,
-atrofia musculară și spinobulbară(CAG)n.

ADN mitocondrial
Metazoarele au 100-10.000 de copii per celulă reprezentând~1% din
ADN total.
La mamifere, ADNmt bicatenar circular conține15-17kbp.
Catena ADNmt bogată în Geste denumită catena grea„heavy strand”(H-
strand)iar catena bogată în C, este denumită catena ușoară
„lightstrand”(L-strand).
Catena H codifică 28 de gene iar catena L codifică 9 gene,în total 37 de
gene.
13 dintre ele sunt translatate în catene polipeptidice, 22 sunt transcrise
în ARNt iar două în ARNr.
Codul genetic diferă puțin de cel standard,codonul UGA STOP codifică
Trp iar AGA și AGG ce normal cofifică Arg sunt citiți drept codoni STOP.
Rata mutațiilor este de 5-10 ori mai mare decât în cazul ADN genomic.
În general, ADNmt este transmis non mendelian pe cale maternă
precum și bolile genetice datorate mutațiilor.
Majoritatea proteinelor mitocondriale,54 din totalul de 67 sunt codificate
degene nucleare, restul de 13 sunt codificate de ADNmt.

REPLICAREA ADN
În vederea menținerii stabilității geneticeîn cadrul organismului și
speciei,ADN trebuie să se replice complet și corect.
Procesul de replicare al ADN este complex și implică multiple funcții
celulare și proceduri de verificare pentru a asigura fidelitatea procesului.
În cazul Ecoli mai mult de 30 de proteine sunt implicateîn replicarea
cromozomului, la eucariote procesul find mai complex.
Prima observație enzimologică cu privire la replicarea ADN a fost făcută
în 1955de către Kornberg când a descris în E coli prezența unei enzime,
denumită astăzi ADN polimeraza I implicatăîn replicare.
ADN polimerazele sunt enzime complexe, cu activități catalitice multiple
formate din mai multe subunități, având capacitatea de a realiza legături
fosfodiesterice doar în direcția5’→3’.
În vederea desfășurării activității lor catalitice ADN polimerazele
necesită:
1.dNTPs:dATP,dTTP,dGTP,dCTP(deoxiribonucleotide5’-trifosfat)
2.matriță ADNmc
3.ARN primer cu gruparea 3’-OH liberă
4. Mg2+(optimizează și reglează activitatea ADN polimerazelor)

Principalele etape implicate în replicarea eucariotelor:

1.Identificarea originii replicării.
2. Despiralizarea(denaturarea) ADNdc la ADNmc .
3. Formarea furcii de replicare.
4. Inițierea sintezei ADN și elongarea catenei.
5. Formarea buclelor de replicare ce conțin catenele ADN parentale cât
și cele în curs de sintetiză.
6. Reconstituirea structurii 3D a cromatinei.

Originea replicării
În funcţie de organism,originile replicării sunt segvențe de ADN unice
care conţin mai multe unităţi repetitive scurte ce sunt recunoscute de
proteine multimere specifice denumite„Origin Binding Proteins”,
adiacente unei regiuni bogată în AT.
Originea replicării la E coli este un segment de 245 pb numit locusori.
Proteina Dna A,recunoaşte şi se leagă la un segment de 9 pb care se
repetă de 4 ori la nivelul locusului ori.
Dna A distorsionează dublul helix și orientează legarea proteinelor DnaB
şi DnaC formând complexul de prepriming ce desface legăturile de
hidrogen a trei segmente de 13 pb care se repetă în tandem bogate în
AT localizate la stânga regiunii Ori, energia fiind furnizată de hidroliza
ATP.
La drojdii au fost identificate secvențe similare cu cele de la E coli cu
replicare autonomă„autonomously replicating sequences”(ARS).
Secvențele ARS conțin o secvență degenerată de11 pb numită
elementul originii replicării„origin replication element”(ORE) la care se
leagă un set de proteine similare cu Dna A find situat adiacent de o zonă
de 80 pb bogatăîn AT de la care începe despiralizarea ADN.
În cazul ADN circular(~6×106bp)replicarea începe de la un singur
locusori. Replicarea este completă în aproximativ 30 min. cu o rată a
replicării de3×105pb/min.Întregul genom la mamifere se replicăîn 8-9h.
Dacă genomul mamiferelor(~3×109bp) s-ar replica de la o singură
secvență ori la aceiași rată ca agenomului bacterian, replicarea
completă arține 150h.
Această problemă este rezolvată prin două strategii:
1.replicarea este bidirecțională.
2.Replicarea are loc simultan de la mai multe origini în fiecare cromozom
(~100 om)una la fiecare 3-300 kpb.
Cu înaintarea replicării se generează bulelede replicare.Secvențele ori la
eucariote cu excepția drojdiilor nu sunt așa bine definite. Se pare însă că
domeniile funcționale ale cromatinei sunt replicate ca unități întregi
sugerând că originile ori sunt localizateîn acord cu regiunile transcrise.

Formarea furcii de replicare

Etapele formării furcii de replicare:
1.Helicaza despiralizează un fragment scurt de ADNdc;
2.Proteinele SSBs se leagă de ADNmc pentru a preveni renaturarea la
ADNdc.
3.ADN primaza inițiază sintezaunui primer ARN care este esențial în
procesul de replicare, ADN polimerazele nu pot începe sinteza ADN
plecând de la două NTP.
4.ADN polimeraza inițiază sinteza catenei fiice plecând de la primerul
ARN;
5.Giraza, relaxează superîncolăcirile induse de helicază.
La E.coli ADN polimeraza III (pol III ) face parte dintr-un complex
multiproteic care se leagă la ADN împreună cu alți factori
(ß,γ,δ,δ‘șiτ).Toate ADN polimerazele sintetizează ADN doar în direcția
5‘→3‘, dar doar ADN pol III este implicată la nivelul furcii de
replicare.Deoarece cele două catene ale unui duplex ADN sunt
complementare și antiparaele (cu polaritate opusă)și datorită faptului că
ADN pol III sintetizează ADN doar în direcția 5‘→3‘, cele două catene
fiice sunt sintetizate în directii opuse și prin mecanisme diferite.
Catena leading (sens),este replicată în mod continuu de către ADN pol
III pornind de la un primer ARN ce posedă un 3’-OH terminal liber
sintetizat de ARN polimeraza ADN dependentă sau deprimază.
Catena lagging (antisens),este sintetizată în fragmente scurte de 0.1–5
kb,numite fragmente Okazaki care încep cu un ARN primer.La nivelul
furcii de replicare se sintetizează mai mult de 250 fragmente Okazaki.
Complexul mobil dintre helicază și primază formează primosomul care
permite sinteza ARN primer și ADN pol III să replice catena parentală.
Funcționarea primosomului este etapa cea mai importantă a inițierii
sintezei ADN,polimerazele nefiind capabile să inițieze sinteza ADN de
novo. După ce un fragment Okazaki este complet sintetizat, ADN pol IIIîl
eliberează și un nou primer este sintetizat. ADN pol III rămâne asociată
la furca de replicare și sintetizează un nou fragment Okazaki.După ce
sunt generate peste 250 de fragmente Okazaki, complexul de replicare
(RN-aza la eucariote sau polimeraza I la procariote)îndepărtrază primerii
ARN, iar polimeraza I umple golurile rămase cu nucleotide
complementare cu catena parentală(matriță). Fragmentele sunt sudate
de o ADN ligază care reface legăturile fosfodiesterice.

ADN polimerazele sunt caracterizate prin:

1.Capacitate de elongare-viteza/rata cu care are loc polimerizarea(nt/s).
2.Procesivitatea–numărul de nucleotide adăugate la lanțul în creștere
înainte de disocierea de catena matriță.
3.Capacitate de corectare a erorilor- identificarea erorilor din timpul
replicării și corectarea lor. La E coli. Pol III este un complex proteic (>1
MDa),format din 10 subunităi. Cele două subunități identice ß înconjoară
catena matriță ca o clemă fiind răspunzătoare de stabilitatea întregului
complex și de înalta procesivitate a enzimei.
Pol III funcționează la furca de replicare și are rata de elongare cea mai
mare de1000nt/spre cum și cea mai mare procesivitate, putând să
polimerizeze circa 0.5 Mb într-un singur ciclu la nivelul catenei
leading.Posedă o activitate 3’→5’exonucleazică(abilitatea de a îndepărta
nucleotidele de la capătul 3’al lanțului).Dacă pol III nu ar avea capacitate
de corectare a erorilor, rata mutațiilor ar fi de 1 x 10-6,însă rata erorilor
este de1 x 10-9.
Pol δ a mamiferelor este capabilă să polimerizeze cu o rată de 100 nt/s,
mai mică de 10 ori decât cea a pol III, dar posedă o procesivitate
nelimitată. Rata scăzută se corelează cu faptul că la eucariote ADN este
compactizat în cadrul nucleozomilor care se depliază pe măsură ce
furca de replicare înaintează.
Polimeraza II (pol II) este implicată în identificarea erorilor și corectării
lor, deci în repararea ADN posedând o activitate
3’→5’exonucleazică.Polimeraza I (pol I) umple golurile lăsate de
îndepărtarea primerilor ARN din cadrul catenei lagging finalizând sinteza
fragmentelor Okazaki. Posedă atât activitate 3’→5’cât și
5’→3’exonucleazică, putând îndepărta primerii ARN.
Inițierea sintezei ADN necesită un fragment scurt ARN de circa 10–200
nt și implică atacul nucleofil al grupării libere 3'-OH de la nivelul
primerului ARN asupra restului fosfat α din cadrul primei dNTP, ruperea
legăturii de tipanhidridă acidă și eliberarea pirofosfatului(P~P).Gruparea
3‘-OH liberă a nucleotidei nou atașată va ataca nucleofil gruparea α
fosfat a următoarei dNTP, având loc eliberarea unei alte molecule de
P~P.
Selectarea corectă a deoxinucleotide ce urmează a fi selecționată să fie
incorporată în lanțul ADN în creștere se face conform principiului
complemntarității cu catena matriță.

Reconstituirea stucturii cromatinei

Nucleozomii se reasamblează pe baza histonelor parentale reciclate și
ale celor noi sintetizate.Tetramerii parentali(H3/H4)2 segregă aleator în
cadrul nucleozomilor corespunzători catenelor parentale și nou
sintetizate. Modalitatea prin care dimerii parentali H3/H4 sunt transferați
la nivelul furcii de replicare este neclar, dar complexul de întreținere a
minicromozomilor (MCM) are un anumit rol împreună cu proteinele
chaperon ale histonelor ASF1 și FACT.
Histonele nou sintetizate diacetilate H3/H4 sunt transferate la factorul de
asamblare acromatinei 1 (CAF1) de către ASF1 printr-o cale de
transport în care sunt implicate următoarele proteine: proteina
autoantigenică nuclearăa spermei (NASP), proteina de asamblare a
retinoblastomei p46 (RBAP46), acetiltransferaza histonelor 1 (HAT1)și
importina 4 (IMP4). CAF1 este recrutat de noul ADN de către antigenul
nuclear celularde proliferare (PCNA) atât la nivelul catenei leading cât și
a catenei lagging. La nivelul catenei lagging, PCNA trebuie să integreze
CAF1 odată cu procesul de maturare al fragmentelor Okazaki. După
asamblarea tetramerilor(H3/H4)2, dimerii H2A–H2B sunt adăugați
formând nucleozomul.
Cromatina nou formată este înalt acetilată și este nevoie să fie
procesată în continuare pentru a-și redobândi structura compactă.
În general acest fapt implică deacetilarea histonei H4 de către
deacetilazele(HDAC) 1, 2and 3, metilarea ADN de către metil
transferazele1 (DNMT1–UHRF1), remodelarea nucleozomului și
adăugarea histonei H1.Factorii de maturare a cromatinei HDAC1,
DNMT1și SMARCAD1 (SWI/SNF-relatedmatrix-associatedactin-
dependent regulator of chromatin subfamily B member 1),folosesc
PCNA ca pe un pad de aterizare.În final, PCNA ghidează acetilarea
inelelor de coezină după ce trec de furca de replicare, proces necesar
pentru stabilitatea coeziunii cromatidelor surori.

Ciclul Celular. Sinteza ADN are loc în faza S

În celulele animale, replicarea genomului ADN apare numai la un anumit
timp pe durata de viață a celulei,în faza sintetică sau S a interfazei.
Aceasta este separată temporar de faza mitotică prin perioade ADN
nesintetice denumite etapa de creștere 1-G1 și etapa de creștere 2- G2.
Celula se pregătește pentru sinteza ADN în G1 și pentru mitoză în G2.
Celulele neproliferative ale eucariotele multicelulare intră, în general, în
starea G0 de repaus din G1 și pot rămâne în această stare pentru
perioade lungi de timp sau pe termen nelimitat(neuroni).
Acest lucru este foarte frecvent în cazul celulele pe deplin diferențiate
sau senescente.
Două clase cheie de molecule de reglare, ciclinele și kinazele
dependente de ciclină(CDK), determină progresul ciclul celular.
CDK-urile sunt exprimate în mod constitutiv, în timp ce ciclinele sunt
sintetizate în stadii specifice ale ciclului celular, ca răspuns la semnalele
moleculare. Ciclinele sunt subunitățile reglatoare și CDKs subunitățile
catalitice ale unui heterodimer activat; ciclinele nu au activitate catalitică
și CDK-urile sunt inactive în absența ciclinelor. Complexul ciclină-CDK
activează sau inactivează proteinele țintă prin intermediul fosforilării.
Clinele D activează CDK4 și CDK6. Complexul ciclină D-CDK4 -CDK6
format în faza G1, este o kinază serin-treonin activă. Un substrat al
acestui complex kinazic este retinoblastomul (Rb), un reglator al ciclului
celular,care leagă și inactivează un factor de transcripție(E2F)necesar
anumitor gene pentru a fi transcrise ce codifică pt. cicline (E, A, B),
histone și proteinele implicateîn replicarea ADN.Fosforilarea Rb de către
complex are ca rezultat eliberarea E2F din Rb și progresia ciclului
celular. Ciclina E și CDK2 formează un complex la sfârșitul fazei G1.
Ciclina E este degradată rapid, iar CDK2 eliberat formează apoi un
complex cu ciclina A. Această secvență este necesară pentru inițierea
sintezei ADN în faza S.Complexul format între ciclina B și CDK1
limitează vitezei tranziției de la G2 la M în celulele eucariote inducand
MPF.
Având în vedere importanța ADN-ului normal și a funcției cromozomilor
în supraviețuire,celulele eucariote au dezvoltat mecanisme elaborate
pentru a monitoriza integritatea materialului genetic. Un număr de
sisteme enzimatice complexe multi-subunitare au evoluat pentru a
repara ADN-ul deteriorat la nivelul secvenței nucleotidice.În mod
similar,neregulile detectateîn cadrul mitozei sunt, de asemenea,
monitorizate și reparate. Cele patru etape specifice la care are loc
această monitorizare au fost numite puncte de control.
Dacă sunt detectate probleme la oricare dintre aceste puncte de control,
progresia ciclului se întrerupe până la repararea deteriorării. Supresorul
tumoral p53, o proteină de 53 kDa, joacă un rol-cheieîn cadrul punctelor
de control din G1și G2.În condiții normale, p53 este o proteină foarte
instabilă. p53 este un factor de transcripție care se stabilizeazăîn urma
legării la ADN deteriorat. Nivelele crescute de p53 activează transcripția
unor gene implicate în a întârzia progresia ciclul celular. Una dintre
aceste proteine induse este p21 este un inhibitor potent al complexelor
ciclină-CDK. Inhibarea CDK-urilor va opri progresia ciclul celular. Dacă
leziunile ADN-ului sunt prea extinse pentru a fi reparate, celulele
afectate suferă apoptoză prin p53. Celulele care nu au p53 funcțional nu
intră în apoptoză ca răspuns la leziunile ADN. Gena p53 este una dintre
cele mai frecvente gene mutante în cancer.

Mecanismele implicateîn repararea ADN

Tipuri de leziuni ale ADN induse de factori fizici și chimici
I.Mutații punctiforme
A. Depurinare
B. Deaminarea citozinei la uracil și a adeninei la hipoxantină
C. Alchilarea bazelor
D. Insertia sau deletia
E. Incorporarea de baze analoage
II.Alterarea a două baze
A. Formarea dimerilor de timină induși de UV
B.Înrețelarea bazelor prin agenți alchilanți bifuncționali
III. Ruperea lanțurilor ADN
A. Radiații ionizante
B. Dezintegrarea radioactivă a at radioactivi incorporați
C. Specilor reactive de oxigen (radicali liberi)
IV.Înrețelare
A.Între baze azotate
B.Între baze azotate și proteine (histone)
Erorile în replicare, chiar și cu un sistem de reparare foarte eficient, duc
la acumularea de mutații.
La mamifere, mai mult de o mutație la 106 pb scapă mecanismelor de
reparare. Din fericire, cele mai multe dintre acestea vor apărea
probabilîn ADN care nu codifică proteinele sau nu vor afecta funcția
proteinelor codificate.În concluzie, leziunile induse spontan sau prin
agenti fizici/ chimici la nivelul ADN trebuie reparate.
Regiunile anormale ale ADN-ului, induse de erorile de copiere sau
deteriorarea ADN,sunt înlocuite prin cinci mecanisme:
1)repararea nepotrivirii,
2)repararea exciziei de bază,
3)repararea exciziei nucleotidelor,
4)repararea intreruperii catenei ADNdc prin legarea capetelor
neomoloage,
5)repararea ADNdc prin recombinare între secvențe omoloage.Regiunea
defectă dintr-o singură catenă poate fi readusă în forma sa originală pe
baza informației complementare codificată în catena intactă.

Repararea nepotrivirii “Mismatch Repair”

Acest mecanism repară nepotrivirile de nucleotide care apar în timpul
procesului de replicare a ADN, de exemplu, dacă pe catena fiică apare
C în loc de T, pe catena matriță fiind A sau ADN polimeraza alunecă sau
se încurcă și apare insertia de 2-5 nucleotide.
Catena parentală(matrița)este metilată, iar catena nou sintetizată ce
poartă mutația nu este modificată. Această diferență permite enzimelor
de reparare să identifice catena care conține mutația, ce necesită
înlocuire. Dacă apare o neconcordanță sau o buclă, o endonuclează
GATC taie catena care poartă mutația la un situs corespunzător
secvenței GATC. O exonuclează digeră catena nou sintetizată din
dreptul secvenței GATC până după mutație, eliminând astfel ADN-ul
defect.Acest lucru se poate realiza de la oricare dintre capete, dacă
defectul este flancat de două secvențe GATC. Golul rămas este umplut
cu ajutorul enzimelor celulare pe baza principiului complementarității. La
E. coli, trei proteine Mut S, Mut Lși Mut H sunt necesare pentru
recunoașterea mutației și îndepărtarea ei și alte enzime
celulare,incluzând ligază, polimeraza și SSB-uricon lucrează la
înlocuirea segmentului defect.În cazul mamimerelor, procesul este mult
mai complex,în prima etapă fiind implicate 6 proteine.

Repararea exciziei de bază„Base Excision-

Repair”
Citozina,adenina și guanina pot suferi reacții de deaminare spontane cu
o rată de5.000-10.000/celulă/zi la 37°C cu formare deuracil, hypoxatină
și xantină. N-glicozilazele specifice recunosc aceste baze anormale și le
îndepărtează hidrolizând legătura N1 sau N9 glicozidică dintre
deoxiriboză și baza azotată lăsând intactă legătura fosfodiesterică dintre
nucleotide.Aceste situsuri sunt recunoscute de endonucleaze apurinice
sau apiridinice care îndepărtează restul nucleotidic. O ADN polimerază
ADN dependentă adagă nucleotidele corespunzătoare lanțului
complementar și o ligază reface legătura 3’,5’- fosfodiesterică.Printr-un
mecanism similar bazele azotale alchilate pot fi îndepărtate din lanțul
ADN.Aceste mecanisme pot corecta însă doar mutațiile punctiforme nu
regiuni mai extinse.

Reparare prin exciziei

nucleotidelor„NucleotidesExcision-Repair”
Acest mecanism este folosit pentru a înlocui regiuni de ADN deteriorat
cu până la 30 de baze în lungime. Radiațiile UV, radiațiile ionizante,
fumatul, agenții utilizați în chemoterapie și o varietate de substanțe
chimice provoacă modificări ale bazelor azotate, fragmentarea ADN,
legături încrucișate între baze aflate pe lanțuri ADN complementare sau
dintre bazele azotate și proteine. Acest mecanism implică un număr mult
mai mare de proteine decât în cazurile precedente. După recunoașterea
defectului (indicatprinXXXX)și de spiralizarea lanțului ce conține defectul
o exinuclează hidrolizează lanțul în amonte și în aval de
defect,îndepărtându-se astfel 27-29 de nucleotide. Acest gol este apoi
umplut de o polimerază (δ/ε la mamifere)și o ligază reface legătura
fosfodiesterică.

Repararea intreruperii catenei ADNdc Double-

Strand Break Repair
Ku,un heterodimer format din două subunități una de70kDa și alta de 86
kDa, recunoaște și se leagă de capetele libere ale ADNdc, având și o
activitate helicazică ATP-dependentă latentă. Capetele ADN ce au legat
proteinele Ku recrutează o altă proteină ADN-dependentă cu funcție
kinazică(ADN-PK).ADN-PK are un situs care leagă capetele libere ale
ADN și un altul care leagă porțiuni de ADNdc conducând la apropierea
celor două capete. Cele două ADN-PK cu activitate kinazică se
fosforilează reciproc și de asemenea fosforilează proteina Ku. Proteinele
DNA-PK fosforilate disociază din complezul ADN-Ku-ADN-PK iar Ku
fosforilată are activitate helicazică conducând la despiralizarea celor
două capete ale ADNdc. Capetele despiralizate ale celor două lanțuri
ADN se apropie prin refacerea legăturilor dehidrogen dintre bazele
complementare iar capetele monocatenare sunt îndepărtate de o
exonuclează. Golurile rămase sunt umplute de o polimerază iar ligaza
reface integritatea ADNdc.
Mecanismul de reparare a al ADNdc prin recombinarea cromozomilor
omologi în metafaza I a meiozei.
Complexul MRX esteun complex proteic heterotrimeric format din
proteinele Mre11,Rad50 și Xrs2 descoperit la drojdii.Acesta este un
omolog al complexului de reparare al ADN-ului deteriorat de la mamifere
MRN compus din proteinele Mre11,Rad50 și Nbs1.
APLICAŢII ALE
TEHNICILOR DE BIOLOGIE
MOLECULARĂ
Cu ajutorul tehnicilor de biologie moleculară se pot determina:
•proveniența materiilor prime
•organisme modificate genetic
•patogeni din alimente (Salmonella,Vibrio,ListeriaşiE.coli)și probe
biologice
•boli cu determinism genetic datorate-mutaţiilor punctiforme care pot fi:
tranziţii la nivelul purinelor când A→G sau invers
tranziţii la nivelul pirimidinelor când C→T sau invers
transversii care sunt substituţii între purine şi pirimidine A→T sau G→C
-mutaţii frame shift (se modifică cadrul de citire al secvenţei) care au loc
în timpul replicării prin fenomenul de slippage(alunecare) sau prin
crossing-over inegal datorate transpozitiei elementelor moderat
repetitive şi pot fi:
inserţii: inserarea uneia sau a mai multor noi perechi de baze
deleţii: dispariţia uneia sau a mai multor perechi de baze
•predispoziţie genetică la anumite boli(ex.Scrapie)•boli virale, bacteriene
şi parazitare
•teste de paternitate-pedigree.

Două provocări majore:Există MULTE alte secvențe

într-un genom pe care nu dorim să le detectăm(de care
nu suntem interesați). Cantitatea de ADN din
probele(eșantioanele)de care suntem interesați este
foarte mică.

Problema:specificitate
•Genomul uman cuprinde 3,4 miliarde bp
•Dacă bazele ar fi scrise cu caractere standard cu
10puncte Time NewRoman, pe o bandă de
măsurare......banda s-ar intinde pe 8.635 km!
•Identificarea unei secvențe de 500pb într-un genom ar
fi ca și cum ai găsi o parte a acestei benzi care are
doar 1,22 m lungime.
Distanța cuprinsă între coasta de est și coasta de vest
a Statelor Unite este de 4.000-5.000km, în funcție de
traseu.

Problema:amplificare
De câte molecule de ADN avem nevoie pentru a le
putea detecta?
•Pentruca ADN-ul să fie vizibil peun gel de agaroză în prezența
bromurii de etidiu,sunt necesare aproximativ 10ng de ADN.
•Câți moli există în 10ng de ADN de 500pb?
•Câte copii ale unui fragment de 500bp sunt în 10ng de
ADN?

Cele două probleme:specificitatea și

amplificarea
•Cum să identificăm și să detectăm o
secvență specifică într-un genom?
Două provocări majore:
•Există MULTE alte secvențe într-un
genom care nu neinteresează și pe care
nu vrem să le detectăm.
(SPECIFICITATE)
•Cantitatea de ADN din eșantioanele de
care suntem interesați este foarte mică.
(AMPLIFICAREA)
•PCR rezolvă aceste două probleme!!!

Istoria PCR –Invenția

Oamenii de știință au numit-o cea mai mare realizare în biologia
moleculară modernă. Kary B. Mullis a dezvoltat reacția în lanț a
polimerazei (PCR)în1983.
Pentru dezvoltarea reacției PCR,Mullis a primit premiul Nobel
pentru chimie în 1993.
PCR permite sinteza rapidă a unor fragmente ADN țintă. Folosind
această tehnică, peste un miliard de copii a unui fragment țintă
pot fi sintetizate în câteva ore. Cetus Corporation, angajatorul lui
Mullis la momentul descoperirii sale, a comercializat pentru prima
dată procesul PCR. În1991, Cetus a vândut brevetul PCRlui
Hoffman-La Roche pentru 300 de milioane de dolari. Mullis a
părăsit Cetus în 1986. În prezent este un instrument esențial
pentru dezvoltarea biologiei moleculare și pentru ingineria
genetică.
Reacția de polimerizare în lanț(PCR)
Realizează copii multiple ale unei secvenţe ADN țintă prin replicări
succesive având la bază proprietate ADN polimerazelor de a sintetiza în
direcţia 5’-3’o secvenţă de nucleotide complementară cu secvenţa ADN
ţintă(matriţă) pornind de la un primer cu capăt 3’-OH liber. Astfel,
numărul de copii a secvenţei ţintă este dublat la fiecare replicare (ciclu),
acesta crescând exponenţial cu fiecare ciclu de amplificare.Succesul
realizării practice a unei reacţii PCR constă în alegerea corectă a unor
primeri(molecule monocatenare, scurte de ADN, desemnaţi artificial pe
bază de complementaritate cu secvenţa ADN ce urmează a fi
amplificată),capabili să hibridizeze la capetele secvenţei ADN ţintă şi în
optimizarea condiţiilor de reacţie. Permite cercetătorilor sa “ţintească”
secvenţe ADN specifice din structura unui genom.

ETAPELE PCR
1.Denaturarea termică a macromoleculei dublucatenare ADN
matriţă:temperatura amestecului de reacţie, care conţine ADN matriţă,
este ridicată pânăla 95ºC,ducând la ruperea legăturilor de hidrogen
stabilite pe bază de complementaritate între cele două catene iar în
soluţie vom regăsi ADNmonocatenar.
2. Hibridizarea(anelarea)primerilor pe bază de complementaritate la
matriţa ADN:hibridizarea primerilor se efectuează prin scăderea
temperaturii amestecului de reacţie pănâ la o valoare care permite
refacerea punţilor de hidrogen dintre aceştia şi catena ADN matriţă în
regiunea complementară.
3. Polimerizarea sau sinteza unei noi catene avănd drept matriţă catena
veche ADN:are loc sinteza unei noi catene de ADN complementară cu
secvenţa ADN matriţă pornind de la capătul OH liber al primerilor cu
ajutorul unei ADN polimeraze în prezenţa deoxinucleotidelor trifosfat
(dNTPs).
La finele acestei etape,în amestecul de reacţie, moleculele de ADN sunt
dublucatenare. Dublarea cantităţii de ADN ţintă se poate realiza prin
reluarea celor trei paşi,iar acest fapt reprezintă intrarea într-un nou ciclu
de amplificare. Fiecare catenă nou sintetizată devine matriţă pentru un
nou ciclu de amplificare, astfel încât secvenţa ţintă de ADN este selectiv
amplificată după fiecare ciclu de reacţie.
•Primii produşi rezultaţi prin copierea catenelor originale au o lungime
diferită faţă de secvenţa ţintită(ciclul 1şi 2).În al treilea ciclu de
amplificare apar primele 2 fragmentele dc cu lungimea definită,
corespunzătoare distanţei dintre primeri.
• Numărul de copii al secvenţei ţintă creşte exponenţial începând cu
ciclul 4.
În final în amestecul de reacţie se obţin (2n-Z) * Y copii ale secvenţei de
interes ( n-nr de cicluri de amplificare, Z-nr produşi cu lungime nedefinită
şi Y-nr de copii al secvenţei originale).
• După un număr finit de cicluri de amplificare(35-40) reacţia PCR intră
într-o fază de platou deoarece:
-cantitatea de polimerază activă se diminuează datorită denaturării
termice şi valoarea activităţii enzimatice totale scade.
-are loc rehibridarea catenelor matriţă cu o viteză mai mare atunci când
concentraţia ampliconilor depăşeşte o anumită valoare ce va duce la
scăderea eficienţei de hibridizare a primerilor.
-are loc scădere concentraţiei de dNTP şi a eficienţei tamponului de
reacţie.
- se formează o cantitate mare de produși secundari precum pirofosfatul.

Componentele reacţiei PCR

Rezultatul reacţiei PCR este dependent de determinarea experimentală
a concentraţiei optime a componentelor amestecului de reacţie.
1.Matriţa ADN poate fi: ADN genomic, mitocondrial, viral, ADNc (caz
particular ARN total–RT-PCR),concentrație mai mică de1μg/reacție.
2.Tamponul de reacţie: furnizează pH optim polimerazei şi o
concentraţia optimă de ioni Mg2+(0,5și3,5 mM/reacție), acivatorii ADN
polimerazei (cantităţile insuficiente deMg2+ duc la amplificări slabe, iar
cantităţile crescute conduc la acumularea de produşi de amplificare
nespecifici). Cel mai comun tampon (pH 8,3) folosit conţine: Tris-
HCl(100 mM) , KCl (500 mM)şi detergenți (Triton X-100sauTween20).
3. dNTP: sunt livrate fie sub forma a patru soluţii stoc individuale, fie sub
forma unui amestec al celor patru nucleotide (10mM, pH 7,0).
Concentraţia optimă de dNTP depinde de: concentraţia de MgCl2, conc.
primerilor, lungimea fragmentului ce urmează să fie amplificat şi numărul
de cicluri de reacţie.În general sunt adăugate într-o concentrație finală
de 20-200μM/reacție.
4.ADN polimeraza: iniţial s-a folosit fragmentul Klenow al ADN
polimerazei din E.Coli. Ulterior au fost descoperite şi utilizate ADN
polimeraze termostabile ca:-Taq/Amplitaq ADN polimeraza– izolată din
Thermus aquaticus. Viteza optimă de polimerizare este de 35-100
nucleotide/s la 70-80°C .Enzimele au o activitate 5’-3’exonucleazică care
permite înlăturarea nucleotidelor situateîn faţa lanţului de creştere. Sunt
utilizate într-o concentratie de 1 U/reacție.
5. Apa: se utilizează exclusiv apă ultrapură, nuclease-free, livrată de
firme specializate.
6. Primerii:în desemnarea primerilor trebuie respectate câteva reguli
generale:
- lungimea primerilor trebuie să fie cuprinsă între 20şi 35 de nucleotide,
acest lucru permiţând selectarea unei temperaturi de hibridizare ridicate.
- primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru
baze azotate,evitându-se pe cât posibil regiunile cu repetiţii de
nucleotide (evitare structuri hairpin).
-perechile de primeri trebuie alese astfel încât să nu prezinte
complementaritate la nivel intra-şi interindividual (evitarea dimerlor de
primeri).-distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai
mică de 5-10 kpb, dar s-a observat o eficienţă foarte scăzută a reacţiei
în cazul în care lungimea produsului de amplificare depăşeşte 3 kpb.-
determinarea cu exactitate a temperaturii optime de
hibridizare(annelare) prin realizarea unei reacţii PCR în gradient de
temperatură.
-concentratia finală poate varia între 0,05–1,0μM (pMol/μl).

Parametrii de timp şi de temperatură ai reacţiei

PCR
La ora actuală se folosesc aparate de PCR total automatizate,în care
etapele de temperatură se parcurg automat.
•În prima etapă are loc denaturarea matriţei ADN prin ridicarea rapidă a
temperaturii la 95°C pentru o perioadă de timp suficientă pentru
separarea totală a dublei catene (5-10 min în etapa iniţială de
denaturare şi 30-120s la începutul fiecărui ciclu).
•În cea de-a doua etapă are loc hibridizarea primerilor iar temperatura
scade rapidde la 95°C la o valoare determinată practic, prin PCR în
gradient de temperatură. În general temperaturile de hibridizare variază
între 50 şi 65°C timp de 30-60s. O temperatură de anelare scăzută
conduce la hibridizări nespecifice şi la obţinerea unor produşi nespecifici
de amplificare iar o temperatură crescută poate anula procesul.
Temperatura depinde exclusiv de secvenţa şi de lungimea primerilor.
• Etapa a treia, de extensie, se realizează la 70-72°C, reprezentând
temperatura optimă de activitate a ADN polimerazelor termostabile.
Timpul necesar aceastei etape variază în funcţie de lungimea
fragmentului de amplificat (30-180s). În practică este prezentă şi o etapă
finală de elongare la72°C,în care are loc extensia totală a tuturor
ampliconilor acumulaţi (5-10 min).

TEHNICA PCR CONSTITUIE BAZA:

• tehnicii PCR-RFLP prin care se detectează
mutaţii punctiforme şi SNPs
•tehnicii de secvenţiere prin care se pot
detecta mutaţii punctiforme și SNPs
• tehnicii de genotipare sau de analiză a
fragmentelor marcate fluorescent prin care se
realizează teste de paternitate şi detectarea
deleţilor şi inserţilor.

TEHNICA POLIMORFISMULUI FRAGMENTELOR

DE RESTRICŢIE(RFLP–Restriction Fragment
LengthPolymorphism)
•Principiul se bazează pe compararea profilelor de restricţie
rezultate în urma digestiei cu anumite enzime de restricţie a unor
produşi PCR obţinuţi prin amplificarea unei secvenţe ţintă din
ADN de la nivelul aceluiaş locus a unor indivizi diferiţi.
•Posibilele mutaţii care apar la nivelul secvenţei ADN se pot
datora:
-deleţiilor
-inserţiilor
-substituţiilor
-rearanjamentelor
•Mutatiile pot avea ca rezultat:
-pierderea situsuri de restricţie
-apariția de noi situsuri de restricție
-relocalizarea unor situsuri de restricție
•Consecința: apariția unor fragmente de restricţie de dimensiuni
diferite.

Etapele tehnicii RFLP:

1.pentru o anumită zonă din ADN, se identifică posibilele situsuri de
restricţie.
2.se verifică dacă mutaţiile pe care dorim să le identificăm afectează un
astfel de situs.
3.realizarea reacţiei PCR prin care se va amplifica fragmentul de interes
cu primerispecifici desemnaţi.
4.ampliconul rezultatîn reacţia PCR va fi supus acţiunii enzimelor de
restricţie,
5.Dimensiunea fragmentele rezultate vor fi analizate prin electroforeză.
RFLP este o metodă relativ ieftină şi se realizează într-un timp
relativ scurt când reacţiile sunt optimizate.
RFLP este folosită pentru:
-identificarea mutaţilor responsabile de anumite maladii genetice;
-a evidenţia diferenţele care pot apărea între indivizii aceleiaşi
familii,rase, specie, putându-se determina proveniența materiilor
prime;
-diferenţierea unor alele responsabile de caracterele morfo-
productive ale raselor de animale domestice fiind utile în
selecţionarea indivizilor valoroşi asistată de markeri moleculari.
Mutaţiile identificate prin RFLP trebuie confirmate prin
secvenţiere.

Determinarea provenienței caviarului prin RFLP

Identificarea corectă a speciilor de sturioni este foarte importantã
pentru evitarea fraudelor comerciale.
Principalele tipuri de caviar sunt beluga,osietra și sevruga,
produse de Huso huso(Morun), Acipenser
gueldenstaedtii(Nisetru) și respectiv,Acipenser
stellatus(Păstruga).
Aceste tipuri de caviar diferă prin gust, preț și disponibilitate pe
piață.
În scopul identificării speciilor de sturioni din Dunăre, a fost
amplificat un fragment de 462pb de la nivelul regiunii
mitocondriale ARNt Glu/citocrom butilizând o singură pereche de
primeri. Primerii folosiţi se ataşează la zone conservate
interspecific şi astfel este posibilă amplificarea fragmentului de
interes la toate speciile analizate.
Optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor s-a realizat
printr-o reacţie PCR în gradient de temperatură,între 55 şi 65ºC.
Ampliconii obţinuţi au fost vizualizaţi prin electroforeză în gel de
agaroză 2%. Temperatura de hibridizare selectată a fost de 60ºC.

Diagnosticarea maladiilor genetice la animale de

interes economic prin tehnica PCR-RFLP
•În majoritatea cazurilor, cauza maladiilor genetice este reprezentată de
mutaţii la nivelul unor gene autozomale.
•Manifestarea unei mutaţii recesive implică prezenţa a două gene
recesive mutanteîn genotipul animalului afectat. Răspândirea acestor
maladii poate fi atent monitorizată prin limitarea împerecherilor naturale
şi mărirea numărului de masculi de elită utilizaţi în programe de
inseminare artificială.

Deficiența de adeziune leucocitarã bovinã

(BLAD–Bovine LeukocyteAdhesion Deficiency)
• taurul responsabil de răspâdirea acestei maladii la rasa Holstein a fost
Carlin-MIvanhoe Bell. Acesta a avut peste 79 000 de fiiceşi peste 1200
de fii cu fiicele sale înregistrați oficial în sistemul USDA. Acelaşi taur Bell
a fost purtator şi al malformației vertebrale complexe (CVM).
• gena mutantă a fost moştenită de Bell de la bunic, Osborndale
Ivanhoe, prin tatăl său Pennstate Ivanhoe Star. S-a determinat că şi
Pennstate Ivanhoe Star era heterozigot pentru CVM, maladie moştenită
probabil de la mamă. Astfel, jumătate dintre urmaşii lui Bell erau
heterozigoţi pentru BLAD şi jumătate dintre ei pentru CVM. Aceste
maladii au fost evidenţiate când urmaşii masculi ai lui Bell au fost
împerecheaţi cu urmaşe femele, tot ale lui Bell.
• BLAD este o boală autozomală recesivă congenitală.
• e caracterizată prin:
-infecţii recurente bacteriene (pneumonii)
-întârzierea vindecării asociată cu neutropenie
-ulcere severe la nivelul mucoaselor
- paradontoză şi pierderea dinţilor
- diaree recurentă sau cronică
- mortalitate crescută la vârste mici datorată complicaţiilor.
• baza moleculară a maladiei BLAD o reprezintă o mutaţie punctiformă, o
tranziţie A→Gîn poziţia 383 a genei CD18
•mutaţia determină substituţia acidului aspartic cu glicina în poziţia 128 a
proteinei de adeziune CD18 care face parte din familia integrinelor β2.
• pentru expresia corectă a integrinelor β2 este nevoie de asocierea
intracelulară a subunităţilor CD11 şi CD18.
•defecte la nivelul genei CD18 împiedică expresia integrinelor β2 care
sunt molecule de adeziune ce mediază interacţiile celulă-matrix
extracelular şi celulă–celulă.
•la bovinele afectate de BLAD,în cazul neutrofilelor izolate s-a evidenţiat
un nivel scăzut al expresiei integrinelor β2 ce conduce la scăderea
abilităţii neutrofilelor de a agregaca răspuns la stimuli chemotactici şi la
scăderea abilităţiilor de a migra de-a lungul endoteliului celular. Astfel,
deficienţa de adeziune leucocitară duce la scăderea imunităţii de la
nivelul mucoasei, iar bovinele afectate de BLAD manifestă infecții severe
şi dese la acest nivel.
•în vederea identificării specimenelor normale şi purtătoare s-a utilizat
tehnica PCR-RFLP.
•iniţial s-a realizat amplificarea PCR a ADN genomic cu primeri specifici
desemnaţi pentru amplificarea unei regiuni de 136pb care conţine situsul
pentru enzima de restricțieTaq I şi care conţine şi mutaţia punctiformă
răspunzătoare de BLAD.
•Pentru diagnosticarea BLAD produsul PCR este supus digestiei cu
enzima de restricţieTaq I.
Diferenţele între bovinele afectate şi cele sănătoase sunt evidenţiate
astfel:
- genotipul homozigot normal prezintă două benzi de 108şi 28 pb
- genotipul heterozigot purtător are trei benzi de108, 28şi 136 pb
- genotipul homozigot recesiv o singură bandă de136 pb.

DEFICIENŢA ÎN URIDIN MONOFOSFAT SINTAZA

(DUMPS)
•Deficienţa în uridin monofosfat sintaza este o maladie autozomală
recesivă care este letală în stadiu embrionar,în a 40 a zi după
concepţie,în cazul homozigoţilor recesivi, pe cândîn cazul heterozigoţilor
maladia nu este letală.
•Mortalitatea se datorează insuficientei activităţi a UMP-sintazei, enzimă
care catalizează conversia acidului orotic în UMP. UMP este precursorul
tuturor pirimidin nucleotidelor, molecule care intră în constituţia ADN şi
ARN; fiind astfel indispensabile creşterii şi dezvoltării normale, precum şi
un constituent normal în laptele de vacă şi în laptele altor rumegătoare.
•DUMPS a fost observată în cazul vitelor de lapte în special al celor din
rasa Holstein-Friesian din Statele Unite. S-a constatat faptul că anumite
exemplare din ferma Universităţii Illinois produceau lapte ce conţinea de
5 până la10 ori mai mult acid orotic decât normal. Aceste concentraţii ale
acidului oroticîn lapte s-au evidenţiat în toate stadiile lactaţiei şi persistau
de la o lactaţie la următoarea,afectând calitatea laptelui. Nivelul acidului
orotic era ridicatatât în urina cât şi în sângele acestor animale în
perioada lactaţiei. Câţiva autori au înaintat ipoteza conform căreia dacă
activitatea enzimei UMP sintaza este deficitară, are loc acumularea de
acid orotic.
•Baza moleculară a acestei maladii a fost evidenţiată în 1993 ca fiind o
mutaţie în gena UMP-sintazei.
•cartarea genomului bovin a evidenţiat că gena UMP sintaza se află pe
cromozomul1(q31-36).DUMPS este cauzată de o mutaţie punctiformă și
anume de tranziţia C→T la nivelul codonului 405,în exonul 5.
•prin PCR se va amplifica un fragment de 108 pb din ADN, ce poate
conţine mutaţia. Produsul obţinut va fi digerat cu enzima de restricţie
AvaI care are două situsuri de restricţie în cadrul fragmentului de 108 pb
pentru indivizii normali. În cazul mutaţiei dispare un situs de restricţie.
•în cazul indivizilor homozigoţi normali se vor obţine în urma digestiei trei
benzi de 53, 36 şi 19 pb.
•pentru heterozigoţi se vor obţine patru benzi de 89, 53, 36 şi 19 pb
•în cazul homozigoţilor recesivi se vor obţine două benzi de 89 şi 19 pb.
SINDROMUL SPIDER LAMB LA OVINE
•condrodisplazia moştenită a ovinelor
• boală semi-letală la rasele de ovine Suffolk şi Hampshire şi a fost
pentru prima dată observată la sfârşitul anilor ’70 în America de Nord.
•este caracterizat prin creşterea excesivă a oaselor lungi, precum şi de
alte deformări la nivelul membrelor şi a scheletului.
• polimorfismul care stă la baza declanşării acestei boli este localizat la
nivelul domeniului tirozin-kinazei II al receptorului 3 al factorului de
creştere fibroblastic(FGFR3). FGFR3 este un reglator negativ al creşterii
osoase, având un rol important în proliferarea condrocitelor şi în
diferenţierea acestora în timpul osificării endocondrale iar mutaţia
evidenţiată la nivelul genei FGFR 3 induce elongarea oaselor.
•mieii care prezintă SLS sunt avortaţi sau născuţi morţi,iar dacă trăiesc
prezintă deformări la nivelul scheletulu.În prima lună de viaţă dezvoltă
semne tipice ale bolii, incluzând membre lungi, disproporţionate, un corp
de dimensiuni reduse,picioare tip”păianjen”, scolioză şi/sau cifoză,
deformări ale sternului.
•în urma analizei genei FGFR3 au fost evidenţiată mutaţia TA la
nivelul exonului 17, care determină substituţia valinăacid glutamic
(V743E)în cazul domeniului II tirozin-kinazic al FGFR3.
• a fost desemnată o pereche de primeri pentru amplificarea unui
fragment de 432 pb de la nivelul exonului 16 până la nivelul intronului
17, fragment ce corespunde regiunii 476-908 de la nivelul genei FGFR3
de la ovine (GenBankAY737275),la nivelul căruia poate fi evidenţiată
transversia TA (poziţia 743).
•produşii de amplificare de 432 pb rezultaţi au fost supuşi digestiei cu
enzima de restricţie BtgI, care recunoaşte situsul palindromic la nivelul
căruia poate fi identificată mutaţia punctiformă(T/A).
•polimorfismul mononucelotidic incriminat modifica unul din cele doua
situsuri de restricţie ale enzime BtgI putându-se astfel diferenţia între
animalele purtătoare şi cele nepurtătoare. Astfel,în urma digestiei
enzimatice produşii de restrictie migraţi în gelul de agaroză vor avea
următoarele profile:
în cazul animalelor afectate se vor obţine două fragmente de 369şi 63
pb
în cazul animalelor sănătoase se vor obţine trei fragmente de 203, 166
și respectiv 63 pb
în cazul animalele purtătoare ale mutaţiei se vor obţine toate cele patru
fragmente de 369, 203, 166 şi 63 pb.

Tehnica Real-Time PCR cantitativ

•Reacţia PCR este o reacţie în lanţ, deci produsul unui ciclu de
amplificare serveşte ca substrat pentru următorul ciclul.
•Cantitatea de produs de reacţie (amplimer) creşte exponenţial şi nu
linear
•In condiţii teoretice,ideale, cantitatea de produs se dublează la fiecare
ciclu de amplificare, conform ecuaţiei 1:

N = numărul de molecule amplificate după n cicluri

N0 =numărul iniţial de molecule ADN
•Abateri de la ecuaţia (1) sunt datorateîn principal eficienţei
amplificării(E).
•Eficienţa amplificării (E): fracţia de amplimer replicată în decursul
fiecărui ciclu de amplificare.
Experimental s-a determinat că eficienţa amplificării este mai mică decât
100% şi ca urmare s-a introdus în ecuaţia procesului PCR(1)subforma:

Eficienţa amplificării poate fi influenţată de:

natura secvenţei ţintă(structuri secundare locale care defavorizează
replicarea)
natura primerilor(temperatura de hibridizare a acestora,
complementaritatea faţă de secvenţa recunoscută şi stabilitatea legării la
această secvenţă)
lungimea secvenţei de amplificat,
prezenţa impurităţilor
calitatea ADN polimerazei termostabile folosite.
În condiţii experimentale identice, apar variaţii de la reacţie la reacţie,
aşa numitele variaţii tube-to-tube, datorate variaţiilor de transfer termic.
Experimental E variază de la 0,46 la 0,99 pentru gene diferite şi între 0,8
şi 0,99 în cazul în care aceeaşi genă a fost amplificată în condiţii
identice.
Pentru fiecare pereche de primeri şi ADN ţintă trebuie determinată
eficienţa amplificării.

Principiul reacţiei Real-Time PCR

•Cinetica reacţiei PCR (amplificarea unui fragment ADN ţintă)
poate fi urmărită în timp real (Real-Time PCR) prin introducerea
în amestecul de reacţie a unor fluorocromi (compuşi fluorescenţi
care se excită şi emit cuante de energie la anumite lungimi de
undă).
• Tehnică permite cuantificarea cantităţii iniţiale a ADN ţintă dintr-
o probă.
• Marcarea specifică fluorescentă a ADNdc se poate realiza prin
mai multe metode, cea mai simplă metodă este utilizarea unui
fluorocrom, de exemplu SYBR Green I, care se intercalează între
bazele azotate ale ADNdc şi astfel intensitatea fluorescenţei
creşte direct proporţional cu acumularea ampliconilor în timpul
reacţiei PCR.

Fazele reacţie Real-Time PCR

 Prima fază sau faza liniară durează aproximativ 10-15 cicluri în funcţie
de cantitatea de ADNdc iniţială şi/sau nivelul de exprimare al genei ţintă.
Fluorescenţa emisă nu depăşeşte valoarea zgomotului(background).
În faza exponenţială timpurie, nivelul fluorescenţei atinge un prag
(threshold)care depăşeşte considerabil nivelul background-ului. Ciclul la
care fluorescenţa ampliconului depăşeşte considerabil nivelul de
background se numeşte„threshold cycle”(Ct sau CP).
Valoarea Ct este invers proporţională cu cantitatea iniţială de
ADNdc ţintădin proba de analizat.
În timpul fazei trei-exponenţială sau logaritmică liniară, cantitatea de
amplicon se dublează la fiecare ciclu în condiţii ideale
În ultima fază, cea de platou, reactanţii devin limitaţi şi măsurarea
fluorescenţei nu se mai justifică.

Ce tip de instrumente sunt folosite pentru PCR în

timp real?
Instrumentul PCR în timp real CFX-Touch Bio-Rad este un exemplu de
astfel de instrument. Un număr de 6 fotodiodediode sau LED-uri(Light-
EmittingDiodes) care emit lumină cu o anumită lungime de undă sunt
grupate într-un mecanism culisant care se depasează într-un plan
paralel cu placa PCR,atât pe axa Ox cât și pe axa Oy, putându-se
poziționa deasupra fiecărui godeu,astfel încât fiecare să fie excitat
independent.
Șase LED-uri și șase fotodioduri sunt utilizate pentru excitație și
detectare. Lumina este filtrată într-o bandă îngustă,asigurându-se că
doar lungimea de undă de emisie specifică unui anumit compus
fluorescent este colectată.
Lumina emisă de fluoroforii excitați este detectată de ale 6 fotodiode care fac
parte din același dispozitiv mobil. O fotodiodă este un tip de fotodetector
(gamă spectrală largă, dimensiuni destul de compacte) care, atunci când este
expus la lumină,determină apariția unui curent curgerea, care este interpretat
de software-ul instrumentului. Intensitatea curentului electric este direct
proporțională cu intensitatea fluorescenței emise.
Fresnel este o lentilă plană formată din mai multe inele concentrice
pentru a reduce aberațiile sferice.

Ce tip de software este folosit cu PCR în timp

real?
Software-ul folosit cu PCR în timp real convertește semnale
fluorescente din fiecare godeu în date digitale (unități relative de
fluorescență).
Etape programare termociclor:
1. Configurarea protocolul PCR.
2.Desemnarea poziția standardelor, probelor și controale în
plăcuță
3.Colectarea datelor.
4.Analiza datelor.

Cuantificarea cantităţii de ADN ţintă dintr-o probă

• se generează o curbă de calibrare utilizând diluţii seriale ale
unui standard având un număr de copii ADNdc ţintă cunoscut şi
presupunând că fiecare probă ADN se amplifică cu aceeaşi
eficienţă se reprezintă grafic:

• numărul de copii iniţiale de ADNdc ţintă din proba de analizat se

determină prin extrapolarea pe curba standard a valorii de Ct
obţinută în cazul probei sau utilizând ecuaţia dreptei.
•într-o reacţie PCR, cantitatea de ADN ţintă se dublează cu
fiecare ciclu, astfel o probă care are o cantitate iniţială de 4 ori
mai mare de copii ADN ţintă faţă de o alta, cea din urmă necesită
2 cicluri în plus pentru a atinge aceeaşi cantitate de ADN ţintă ca
prima, deci va avea o valoare a Ct cu două cicluri peste
prima(Ct+2).
Tehnica Real Time PCR este utilizată în principal în
determinarea:
 numărului de particule virale şi de celule bacteriene
dintr-o probă (de exemplu Salmonella enterica poate fi
detectată la o limită de 7x102celule/100 ml extract),
putând discrimina între diferite tulpini în funcţie de
primerii aleşi.
expresiei genice la nivel de ARNm sau a ARN
viral(coronavirusuri, influenza, virusul hepatitei C, etc.),
dar în aceste cazuri metoda este precedată de o etapă
de revers transcriere, când se obţine ADNc (matriţa
ARN este copiată în ADNdc).

Real Time RT-PCR One-Step versus Two-Step

Tehnica Real-Time RT-PCR de cuantificare a ARNm sau ARN
viral, poate fi realizată:
într-o singură etapă–ONE STEP(întreaga reacţie de la sinteza
ADNc până la amplificarea PCR este realizată într-un singur tub)
are avantajul că minimalizează variaţiile experimentale și reduce
posibilitatea contaminării deoarece ambele reacţii enzimatice au
loc într-un singur tub,dar prezintă dezavantajul că matriţa ARN de
la care se porneşte este susceptibilă la o degradare rapidă, dacă
nu se lucrează cu o foarte mare atenţie și cantitatea de ADNc nu
poate fi variată.
în două etape–TWO STEP(revers-transcrierea şi amplificarea
PCR se realizează în tuburi separate) separă reacţia de revers-
transcriere de cea de amplificare, ceea ce permite realizarea unor
diluţii ale ADNc şi optimizarea reacției. Este preferată când se
foloseşte un agent intercalant fluorescent(precum SYBR Green I),
deoarece eliminarea dimerilor de primeri este mai uşor de
realizat. Fenomenul de contaminare a ADN în timpul reacţiei de
real-time PCR este mai des întâlnit în cazul reacţiei în 2 etape.

Reacţia de revers-transcriere (RT-PCR)

•Macromolecula ARN nu poate servi drept tipar pentru reacţia PCR,
astfel primul pas este revers transcrierea matriţei ARN în ADNc
•Cele mai utilizate reverstranscriptaze sunt AMV-RT (avian
myeloblastosis virusreverse transcriptase)şi MMLV-RT (moloney murine
leukaemia virus reversetranscriptase).
Reverstranscriptazele, pe langă activitatea ADN polimerazica au si o
activitate 5’-3’ exonucleazică, care după formarea hibridului ARN-ADN
vor degrada matrita ARN.

Primerii utilizaţi în reacţia de revers-transcriere:

•random hexamer primeri (hexanucleotide aleatorii formate din
combinaţii a celor patru baze azotate), care se pot ataşa la diferite
secvenţe de-a lungul fiecarei matrite ARN,ceea ce duce la sinteza mai
multor molecule ADNc pentru fiecare molecula ARN(această reactie
este liniara pe undomeniu limitat, afectand acuratetea cuantificarii)
•oligo(dT)primeri,care se ataşează la coada poliA a macromoleculei de
ARNm. Este cea mai buna metoda de aplificare a unor molecule ARNm
ținta atunci cande le segase scîn cantitati reduse în probă, dar nu se
poate utiliza pentru transcrierea ARN predispus fragmentarii deoarece
metoda necesita molecula de ARN integrala (necesită coadă poliA),
pentru studiul histonelor și a ARN viral.
•amestec de primeri hexanucleotidici aleatori şi oligo(dT), este cea mai
buna variantă pentru sinteza ADNc cu o lungime mai mică de 1kpb,
plecând de la o concentraţie extrem de mică de ARN de cel puţin 100fg-
1μg.

Variante de detectare cantitativă a produşilor

amplificaţi
SYBR Green: SYBR Green I este un agent fluorescen care se
intercalează între bazele azotate ale ADNdc. În timp ce produsul
PCR dublu catenar se acumulează, se leagă din ce în ce mai mult
agent fluorescent, conducând la emiterea unei fluorescenţe direct
proporţională cu cantitatea de amplicon care se generează în
reacţie, care la rândul ei este proporţională cu cantitatea de ADN
ţintă de la începutul reacţiei (N0). Folosirea metodei pe bază de
agenţi intercalanţi fluorescenţi are avantajul că este mai puţin
costisitoare, utilizând doar primeri specifici, iar testarea
specificităţii reacţie se face analizând curba de melting. În
schimb,specificitatea nu este foarte mare, datorită potentialei
contributii la valoare fluorescentei a produsilor de amplificare
nespecifica(dimeri de primeri)şi imposibilităţii realizarii unei reactii
multiplex.

Obţinerea şi analza curbei de melting

•Agenţii intercalanţi precum SYBRGREENI au afinitate pentru
toate speciile de ADNdc şi nu doar pentru amplimerul specific.
Astfel, este necesară testarea specificităţii reacţiei PCR.
•Specificitatea se realizează prin aşa numita curbă de
melting(topire)care este determinată automat la sfârşitul reacţiei
PCR.
•Amestecul de reacţie este încalzit din 0,5 in 0,5 oC,de la 50 pană
la 95ºC şi este citită intensitatea semnalului fluorescent. Pe
masură ce temperatura creşte are loc denaturarea ADNdc şi ca
urmare fluorescenţa scade. La un moment dat se ajunge la
temperatura de melting a amplimerului şi are loc o scădere
bruscă a fluorescenţei. Reprezentând derivata inversă a
fluorescenție în funcţie de temperatură, se obţine curba de
melting.
• Reactia este specifică dacă se obţine un singur pic pe curba de
melting.
Hydrolysis probe
Sonda(o secvenţă scurtă de oligonucleotide complementară cu
secvenţa ţintă de ADNc) are la capătul 5’un fluorocrom(reporter
fluorochrome) iar la 3’ un stingător de fluorescenţă
(quencherfluorochrome) care absoarbe fluorescenţa emisă de
reporter cât timp sonda este intactă. În timpul amplificării
secvenţei ţintă,sonda este hidrolizată de o polimeraza care are și
o funcție 5’-3’ exonucleazica şi astfel fluorocromul este separat de
stingătorul de fluorescenţă iar fluorescenţa acestuia devine
detectabilă. Polimeraza utilizată trebuie să funcționeze optim la o
temperatură de maxim 60ºC,pentru a evita desprinderea sondei.
Cu fiecare ciclu PCR,fluorescenţa creşte exponenţial, datorită
acumulării fluorocromului liber.

Evaluarea prin qPCR-tehnologie

TaqManagradul de contaminare cu E. coli a
brânzei de vaci prelevată din piețele și din
supermarketurile din București
ETAPE:
1.Extracția ADN din probele de brânză cu ajutorul Instagene
Matrix (vezi PV92/GMO)
2.Pregatirea mixului de reacție PCR-componentele kitului
3.Programarea aparatului Real-Time PCR
4.Colectarea și interpretarea datelor.
În fiecare godeu se adaugă15μL mixși 5μL ADN probă/diluții seriale
Control pozitiv și se agită prin pipetări repetate evitând formarea bulelor.
Hybridisation probes
Se utilizează două sonde: una are legat la capatul 3’un donor de
fluorescenţă iar cealaltă are la capătul 5’un acceptor de
fluorescenţă. Când sonda donor se leagă la secvenţa ţintă la o
distanţă de 1-5 nucleotide de sonda acceptor, fluorescenţa emisă
de donor excită acceptorul care emite la rândul lui fluorescenţă
(FRET-fluorescence resonance energy transfer). În acest caz,
emisia de fluorescenţă se detectează în etapa de hibridizare. În
etapa de elongare, temperatura crește la 72ºC iar sondele se
desprind de matriță. După fiecare ciclul PCR, se obţin mai multe
copii ale secvenţei ţintă şi se vor lega din ce în ce mai multe
sonde, conducând la creşterea semnalului fluorescent.

Genotiparea mutației G845A (C282Y)răspunzătoare de

hemocromatoză utilizând analiza curbei de topire a
sondelor FRET
Hemocromatoza este o boală autosomală recesivă moștenită. Se
caracterizează prin absorbția intestinală excesivă a fierului alimentar,
rezultând o creștere patologică a stocurilor totale de fier din organism.
Mamiferele nu posedă mecanisme de eliminare a fierului din organism.
Proteina hemocromatozei reglează absorbția fierului circulant prin
controlul interacțiunii dintre receptor și transferină.
Panoul superior:reprezentarea RFU = f (T) pentru cele trei genotipuri.
Sunt prezentate trei curbe de topire diferite pentru cele trei genotipuri
posibile. Acestea reprezintă modificările fluorescenței complexelor FRET
pe parcursul încălzirii și atingerii temperaturii de topire,etapă care se
realizează la sfârșitul amplificării PCR.
Panoul inferior:reprezentarea (-d (F) /dT= f (T). Vârful curbelor reprezintă
punctul de topire al complexelor fluorescente. Sondele FRET se leagă la
ambele alele pentru a forma un complex fluorescent; totuși, acestea sunt
perfect complementare alelei G, dar nu corespund aleii A printr-o
bază.Temperatura de topire a complexului fluorescent sonde-alelă
Geste mai mare decât cea corespunzătoare complexului sonde-alelă A.
Hetiozigoții au două maxime,unul pentru cele două complexe (sonde-
alelă A și sonde-alelă G).

Determinarea eficienţa unei reacţii Real-Time PCR

Strategii de Cuantificare a datelor obtinute prin q

Real-Time PCR
Model Matematic de Determinare a Expresiei
Genice Relative
Rezultatele unui experiment de detectare a OMG
folosind PCR în timp real
Genotiparea animalelor susceptibile la scrapie
prin Real Time PCR
Gradul de susceptibilitate la scrapie conform
Department for Environment,Food and Rural
Affairs (DEFRA)
ETAPELE DETECȚIEI SUSCEPTIBILITĂȚII LA
SCRAPIE
Threshold Cycle (Ct)
SYBR Green(compus fluorescent care se
intercalează între bazele ADNdc)

Când putem folosi SYBR Green?