CHIMIA și PATOCHIMIA

PROTEINELOR
Informația genetică
inmagazinată in
cromozomi:
- este transmisă
celulelor fiice prin
replicarea ADN;
- este exprimată in
ARN prin transcrierea
informației genetice;
- este folosită in sinteza
proteinelor pornind de
la ARNm (translație)
 Nivele de organizare structurală

Există 4 nivele de organizare structurală:

1.Primară,
2.Secundară,
3.Terțiară,
4.Cuaternară

Proteinele formate dintr-un singur lanţ polipeptidic posedă doar 3

nivele de organizare structurală.
 1.Structura primară
- succesiunea aminoacizilor
într-o catenă polipeptidică
1. 1.Succesiunea aminoacizilor este determinată genetic.
2. 2.Aminoacizii sunt uniţi prin legături peptidice.
Fragment al structurii primare
 2.Structura secundară
• Este forma, conformaţia pe care o ocupă
catena polipeptidică în spaţiu - proprietăţi
induse de legăturile de hidrogen.
• Tipurile principale de structură secundară:
- alpha helixul sau alfa-spirala;
- lanţurile beta (beta-structura).
 Structura secundară - alfa-Helix

1 Angstrom =
0.1 Nanometers
5A = 0.5 nm
1 Angstrom =
1.0×10-10 metri

• Structură helicoidală, sensul de răsucire către dreapta,

• Stabilizată prin legăturile de hidrogen formate între gruparea C=O a
aminoacidului n şi gruparea HN a aminoacidului din poziţia n+4 => structură
cilindrică al cărui perete este format din legături de hidrogen;
- Are 3,6 aminoacizi per spiră;
- Distanţa de înaintare/spiră= pasul spirei= 5,4 Å;
Structura secundară- alfa-Helix

• Radicalii proemină în
exteriorul helixului
• Unghiul de răsucire /
aminoacid= 100*
• Diametrul cilindrului =
5Å
1 Angstrom = 0.1 Nanometers
5A = 0.5 nm
1 Angstroms = 1.0×10-10 metri
 Foaie pliată beta

• Este alcatuită din fragmente învecinate spaţial, ale aceluiasi lanţ polipeptidic
sau ale diferitelor lanţuri, cu aşezare paralelă sau antiparalelă;
• Este stabilizată prin legături de hidrogen formate între grupările CO şi NH
aparţinând legăturilor peptidice din fragmentele învecinate;
• Legăturile de hidrogen sunt mai puternice în cazul asocierii antiparalele => o
structură mai stabilă!
 3.Structura terţiară - ambalarea,
aranjarea în spaţiul tridimensional al
catenei polipeptidice

• Formele structurii terţiare:

• - Globulară (mioglobina, hemoglobina, albumina,
etc.)
• - Fibrilară (colagenul, elastina, fibrina, keratina,
etc.)
 Structura terţiară
• Ambalarea spațială tridimensională a întregului lanţ
polipeptidic
• Conformaţia nativă, cu rol biologic
 Structura terţiară este stabilizată de anumite
Interacţiuni chimice. Care sunt acestea?
1. Legăturile
de hidrogen
2. Legăturile
disulfidice
3. Legăturile
ionice
4. Interacțiuni
hidrofobe
(tip van Der
Vaals)
 4.Structura cuaternară –

• Aranjarea, împachetarea spaţială într-o

moleculă unică a mai multor catene
polipeptidice (subunităţi, fiecare cu structura
sa primară, secundară si terţiară) cu
formarea conformaţiei native ale proteinei
oligomere.
Este nivelul de organizare cel mai înalt al
proteinelor.
Structura cuaternară a proteinelor
pe modelul hemoglobinei (Hb)
Structura proteinelor. Nivele de organizare
structurală
Structura domenică sau suprastructura
secundară

• Structura domenică este un fragment din lanţul polipeptidic

împachetat într-o unitate funcţională cu organizare secundară şi
terţiară proprie.
• Este o unitate fundamentală a evoluţiei şi diversificării
proteinelor .
 Structura domenică sau suprastructura
secundară

• Este format din mai multe structuri secundare sau

structuri supra-secundare de tipul “all α”, “all β”, α/β, α +
β.
• Este codificat de un exon.
• Proteinele mici au un singur domeniu.
• Proteinele mari au mai multe domenii (fiecare având o
anumită funcţie) legate prin regiuni cu structură neordonată.
 Împachetarea proteinelor - Caracteristici

• Împachetarea proteinelor este un proces dinamic.

• Proteinele se împachetează în etape, urmărind un anume“scenariu”.
• Primele se constituie structurile secundare, apoi se formează domeniile şi la
sfârşit structura terţiară.
• Din numeroasele structuri tridimensionale posibile, adoptate pe parcursul
împachetării, conformaţia finală va fi cea mai stabilă d.p.d.v. energetic.
 Proteine care “asistă” împachetarea proteinelor
Proteinele ​care asistă împachetarea (folding-ul- asamblarea) sau defolding-ul
(dezasamblarea) proteinelor se numesc chaperonine moleculare. Principala lor
funcție este de a preveni agregarea lanțurilor polipeptidelor nou sintetizate și a
subunităților asamblate greșit. Multe chaperonine sunt proteine ​de șoc termic,
adică proteine ​exprimate ca răspuns la temperaturi ridicate sau alte stresuri
celulare – stres osmotic, stres oxidativ, hipoxie, deprivare de nutrienți, depleție de
calciu, pH scăzut, hiperproliferare, infecție virală etc.
Proteine care “asistă” împachetarea proteinelor
• În reticulul endoplasmatic (ER) există chaperonine moleculare generale,
lectinice și non-clasice care asistă împachetarea proteinelor.
Chaperonine generale: Glucose-regulated protein 170 (GRP170), GRP78 /
BiP, GRP94.
Сhaperonine lectinice: calnexin și calreticulină - proteine chaperone ER care
asigură plierea și controlul adecvat al glicoproteinelor recent sintetizate.
Chaperonele moleculare non-clasice: HSP47 și ERp29.
Chaperonine pliabile:
• Proteina disulfid izomeraza (PDI)
• Peptidil prolil cis-trans-izomeraza (PPI)
• ERp57 chaperoninele
 Proteine care “asistă” împachetarea
proteinelor
• Proteinele de şoc termic(HSPs) sunt
chaperone moleculare importante care
reglează plierea proteinei. Familia HSP include
proteine cu masă moleculară diferită: HSP90
(81 până la 99 kD), HSP70 (65 până la 80 kD),
HSP60 (55 până la 64 kD), HSP40 (35 până la
54 kD) și mici HSP (<34 kD).
• HSP 70 se asociază de fragmentele
hidrofobe ale lanţului polipeptidic (în curs
de sinteză) prevenind asocierea lor.
• Chaperoninele “asistă” împachetarea
corectă a lanţului polipeptidic.
 Rolul proteinelor “Chaperone”

• Proteinele chaperone sunt

implicate în:
împachetarea corectă a
proteinelor;
oligomerizarea proteinelor;
“repararea” proteinelor
alterate;
translocarea proteinelor în
diferite compartimente
celulare.
Proteostaza - controlul de calitate al
proteinelor
Controlul de calitate al proteinelor - proteostază,
este constituit din reglarea sintezei proteice, plierea
(folding-ul), deplierea (misfolding-ul) și degradarea.
Este mediat de sistemele de chaperonine și proteaze
și de mecanismele clearance-ului celular, cum ar fi
autofagia și degradarea lizozomală.
Aceste sisteme de control al calității au un rol
esențial în viața celulelor, asigurând că proteinele sunt
asamblate corect și sunt funcționale la locul și timpul
potrivit.
Acestea sisteme de control al calității sunt esențiale
pentru atenuarea efectelor dăunătoare ale tulburării
asamblării, care, pot determina moartea celulelor în
bolile neurodegenerative și alte boli cauzate de
asamblarea incorectă a proteinelor.
Proteostaza - controlul de calitate al
proteinelor
• Menținerea homeostazei proteice
sau a proteostazei implică
asamblarea și degradarea
proteinelor deteriorate.
• Se crede că deprecierea legată de
vârstă a controlului calității
proteinelor afectează rețelele
generale de proteostază,
provocând agregarea sporită a
proteinelor incorect asamblate, care
pot fi toxice pentru celule și
scurtează durata de viață a
organismului.
Interacțiunea dîntre stresul oxidativ și sistemul de
proteostază.

• Cantitatea redusă de specii reactive ale O2

(ROS) induce aparatul celular adaptiv, cum
ar fi răspunsurile șocului termic, răspunsul
proteinei asamblate eronat- unfolded
protein response (UPR) și autofagia (săgeți
verzi).
• Expunerea cronică la ROS conduce la
acumularea de proteine oxidate, precum și
a componentelor specifice ale controlului
calității proteinelor (PQC) care dăunează
(săgeata de inhibare roșie), ceea ce
exacerbează acumularea de proteine
dezasamblate / asamblate eronat.
 Boli determinate de împachetarea
incorectă a proteinelor
• Bolile neuro-degenerative ale SNC:
Boala Creutzfeldt-Jakob
(encefalopatia spongiformă).
Boala Alzheimer.
Boala Huntington.
Boala Parkinson.
 Amiloidoze

• Boli neurodegenerative cauzate de acumularea

agregatelor proteice (amiloide) formate din proteine
împachetate greşit.
- Împachetarea greşită poate fi:
- spontană, sau cauzată de mutaţii la nivelul genelor;
–proteoliza parţială, anormală;
• Exemple:
- Boala Alzheimer.
- Encefalopatia spongiformă (Boala Creutzfeldt-Jakob).
 Boala Alzheimer
Boală neurodegenerativă
determinată de acumularea
amiloidelor neurotoxice formate
prin agregarea spontană a
amiloidului β(Aβ) = peptidă cu 40-
43 AA.
Aβ rezultă prin clivarea proteolitică
de către β-secretază a proteinei
transmembranare APP (“amyloid
protein precursor”).

Amiloidul = agregat insolubil de

peptidă Aβ (structură foaie β- APP -amyloid protein
pliată). precursor
 Encefalopatia spongiformă (Boala
Creutzfeldt-Jakob)

Encefalopatia spongiformă Atrofie severă a creierului

Boală neurodegenerativă determinată de acumularea Prionilor anormali

(PrPSC) (acronimul pentru“proteinaceous infectious particles”) = izoforme anormale
ale PrPC, o glicoproteină din membrana neuronală, puternic exprimată în creier.
Prionii anormali (PrPSC) rezultă prin modificarea structurii secundare şi terţiare=>
rezistenţa la acţiunea proteazelor şi agregare=> amiloid insolubil care determină
degenerarea neuronală şi atrofia creierului (simptome asemănătoare bolii Alzheimer.
 Encefalopatia (Boala Creutzfeldt –Jakob)
• Modificarea conformaţiei PrPC poate fi determinată de:
- mutaţii ale genei PrPC (PRNP de pe cromozomul 20) care alterează structura
primară;
- interacţiunea prionilor endogeni normali cu prioni exogeni anormali.
Denaturare= alterarea structurii native
 Denaturare= alterarea structurii native

Prin denaturare sunt desfăcute interacţiunile care stabilizează structura terţiară şi secundară.
Denaturarea este reversibilă dacă după îndepărtarea agenţilor denaturanţi se reface structura
nativă. Ex. denaturarea cu: substanţe chaotrope (ex. uree), substanţe care desfac legăturile
disulfidice (ex. β-mercaptoetanol), solventi organici (etanol, acetona).
Denaturarea este ireversibilă dacă după îndepărtarea agenţilor denaturanţi nu se reface structura
nativă. Ex. denaturarea prin încălzire, acidulare sau alcalinizare excesivă (cu acizi si baze tari),
etc.
Proprietăţile fizico-chimice ale proteinelor

 - Masa moleculară mare

1. - Solubilitatea
2. - Proprietăţi amfotere
3. - Sarcina electrică
Masa moleculară a proteinelor
 Soluţiile proteice
1. Soluţii coloidale specifice
2. Viscozitate înaltă
3. Viteză de difuziune mică
4. Efect optic (Tindal)
5. Proprietăţi osmotice
6. Proprietatea de a forma geluri
7. Stabile în absenţa stabilizatorilor
Factorii de stabilizare a
moleculei proteice:

1. Membrana hidrică

2. Sarcina electrică
 Membrana hidrică
Apa interacționează cu grupările polare ale
proteinelor cu formarea unei membrane hidrice
 Sarcina electrică
depinde de 2 factori:

1. Componenţa aminoacidică a proteinei

2. pH-ul soluţiei în care este dizolvată proteina

I. Grupele acide

-COOH → -COO- + H+

II. Grupele bazice

-NH2 + H+ → -NH3+
I. La un pH acid (cantităţi excesive de H+ în soluţie) ionul
H+ se adiţionează la grupele bazice: -NH2 + H+ → -NH3+;
=> toate proteinele au sarcină pozitivă

II. La un pH bazic (insuficienţă de H+) disociază grupele

acide: -COOH → -COO- + H+
=> toate proteinele au sarcină negativă

III. La un pH neutru ambele grupe funcţionale ale proteinei

disociază cu formarea ionilor => sarcina netă a
proteinei depinde de raportul dintre aminoacizii acizi şi
cei bazici
 Astfel,
# dacă predomină aminoacizii acizi =>
-COO- > -NH3+
proteina are sarcină negativă
# dacă predomină aminoacizii bazici =>
-COO- < -NH3+
proteina are sarcină pozitivă
# dacă numărul aminoacizilor acizi şi bazici este practic
egal
-COO- ≈ -NH3+
proteina este neutră
 Starea izoelectrică și Punctul
isoelectric al proteinei
A. O proteină se află în stare izoelectrică atunci
când sarcina electrică sumară a proteinei este
egală cu zero.
B. Valoarea pH-ului soluţiei la care proteina se află
în stare izoelectrică se numeşte punct izoelectric.

C. Proteinele care se află in stare izoelectrică au o

solubilitate scăzută, ele ușor pot să se precipite.
 Punctul izoelectric

• al proteinelor acide se află în mediu

acid;
• al proteinelor neutre – în mediu neutru;
• al proteinelor bazice – în mediu bazic.
Metodele de separare şi purificare ale
proteinelor

• 1. Salifierea
• 2. Electroforeza
• 3. Cromatografia
• 4. Dializa
 1. Salifierea
• Salifierea este separarea unei substanțe coloidale (proteice) dintr-o
soluție prin adăugarea sărurilor metalelor neutre - sulfat de amoniu -
(NH4)2SO4, acetat de sodiu - CH3COONa.
1. Salifierea
• Fracționarea cu săruri neutre: în soluțiile
concentrate de sare, cum ar fi sulfatul de amoniu,
proteinele precipită din cauza disponibilității
scăzute a moleculelor de apă care le mențin în
soluție. Acest fapt este utilizat pentru a izola
proteina de interes. De exemplu, globulinele
precipită la concentrație de (NH4)2 SO4 de 25% -
30%, iar albuminele precipită în soluția de sulfat de
amoniu saturat.
 Precipitarea cu solvenți organici
Solvenții organici, precum metanol, etanol, acetonă etc., sunt agenți
de deshidratare, care elimină apa necesară pentru menținerea
proteinelor în soluție, rezultând precipitarea lor.
Majoritatea enzimelor precipită cu acetonă în intervalul 20 - 50% vol /
vol.
Temperatura trebuie menținută foarte scăzută în jurul valorii de 0 ˚C
pentru a evita denaturarea proteinei.
Adăugarea solventului în apă determină eliminarea căldurii datorită
hidratării moleculelor solventului, de aceea, adăugarea solventului
trebuie să fie lentă cu răcire eficientă. Concentrația de proteine ar
trebui să fie de aproximativ 5 - 30 mg / ml.
 Electroforeza proteinelor

2.Electroforeza este metoda curenta

pentru separarea proteinelor serice.
• Se utilizeaza suporturi solide si pH
alcalin (pH=8,6), la care toate
componentele proteice sunt incarcate
negativ si migreaza spre polul pozitiv.
• Pe electroforegrama, dupa
colorare, proteinele apar sub forma de
benzi carora li se masoara densitatea
optica, fiecare banda avand un maxim
de absorbtie.
 Electroforeza proteinelor

• Prin electroforeza, se
obtin cinci
fractiuni: albumina
serică, a1, a2, b, g –
globuline. Unele sisteme
de electroforeza pot
diferentia zona b in 2-ă
benzi distincte b1 si b2 ,
rezultand astfel 6 fractiuni
proteice.
 Tipurile de proteinograme
1. Tipul răspunsului
întârziat - delayed
response pattern (c).
2. Sindrom nefrotic (g).
3. Tipul normal (a).
4. Ciroza hepatica -“Gama-
patia policlonală (e).
5. Hipogama-
globulinemia (d)
6. Enteropatia cu pierdere
de proteine(h).
7. Tipul răspunsului imediat
- imediat response
pattern (b).
8. Tipul paraproteinic -
Gamapatia
monoclonală(f)
 Metodele cromatografice
Cromatografia este o metoda de separare si analiză a substantelor chimice din
amestecuri, care se bazeaza pe interactiunea a doi sau mai multi compusi cu
doua faze cromatografice: faza mobila si faza stationara.
În functie de mecanismul separarii, metodele cromatografice se clasifica în:
- Cromatografie de adsorbtie, în care fenomenul principal care sta la baza
separării este adsorbția, iar afinitatea componentelor pentru cele două faze este
în functie de coeficientii lor de adsorbtie.
- Cromatografie de repartitie, în care fenomenul principal care sta la baza
separării este extractia si separarea componentelor în funcție de diferența dintre
coeficientii lor de repartiție între cele două faze.
- Cromatografia de schimb ionic, în care separarea componentelor se face în
functie de sarcinile lor electrice, constantele de disociere si diametrul efectiv al
ionilor.
- Cromatografia de bioafinitate, în care separarea are loc datorita unor
interacțiuni biochimice specifice cu asa-numitele grupări de afinitate.
 Cromatografia pe gel

• Fenomenul principal este difuzia, iar

separarea se face în functie de
marimile efective ale moleculelor
componentelor. Pentru a separa
proteinele în funcție de greutatea
moleculară, dimensiunea și forma lor
sunt utilizate coloane împlute cu
geluri de porozitate variabilă.
Proteinele cu greutate moleculară
mai mare trec prin coloană mai
repede, decât cele mai mici, care
sunt prinse în matricea gelului.
Sinche Serra, Marco. (2009). Aislamiento,
purificación parcial y caracterización cinética de las
proteasas presentes en el látex de los frutos de una
planta del género Vasconcella.
 Metodele cromatografice

Cromatografie de lichide de înaltă

performanță -HPLC - High Performance Liquid
Chromatography) este metoda de separare și
analiză utilizată pentru separarea, identificarea
și cuantificarea diferitor compuși. Un sistem
HPLC tipic utilizează o coloană încărcată cu
diferite materiale (faza staționară), o pompă ce
împinge faza mobilă prin coloană și un detector
ultraviolet. Presiunea înaltă forțează
componentele analitului să se deplaseze prin
coloană în funcție de polaritatea lui relativă. High performance liquid chromatography
Există 4 categorii diferite: cromatografie în fază (Blum et al., 2014)
normală, cromatografie în fază inversă,
cromatografie de interacțiune hidrofilă și
cromatografie cu schimb de ioni.
 Dializa proteinelor
• Metoda se bazează
pe separarea
macromoleculelor din
soluţiile coloidale de
substanţele
micromoleculare cu
ajutorul membranelor
semipermeabile, care
pot fi traversate de
micromolecule, dar
sunt impermeabile
pentru
macromolecule.
 CLASIFICAREA PROTEINELOR
• Există mai multe tipuri de clasificarea proteinelor, cum ar fi cea bazată pe funcțiile,
natura chimică, solubilitatea și importanța nutrițională.
• A. Clasificarea funcțională a proteinelor:
1. Proteine structurale : Keratina părului și unghiilor, colagenul din oase.
2. Enzime sau proteine catalitice : Hexokinase, pepsin, ALT, AST, LDH.
3. Proteine de transport : Hemoglobina, albumina serică.
4. Proteine hormonale: insulina, glucagon, hormon de creștere.
5. Proteine contractile: actină, miozină.
6. Proteine de stocare: ovalbumină, glutelină.
7. Proteine genetice: nucleoproteine.
8. Proteine de apărare: veninuri de șarpe, imunoglobuline.
9. Proteine receptori pentru hormoni, viruși.
 Clasificarea proteinelor
1.Simple (holoproteine) sunt 2.Complexe (heteroproteine)
proteine formate numai din AA: sunt formate din 2
a. Protamine componente - partea
proteică şi cea prostetică:
b. Histone
a. Nucleoproteine
c. Scleroproteine
b. Glicoproteine
d. Proteine fibrilare
c. Lipoproteine
e. Prolamine
d. Cromoproteine
f. Albumine
e. Metaloproteine
g. Globuline
f. Fosfoproteine
h. Gluteline
Holoproteinele (proteine simple) - sunt proteine formate
numai din aminoacizi si cuprind 7 grupe dintre care
primele 4 se găsesc numai in regnul animal:

1. Protamine - sunt proteine cu MM mica; se gasesc în celulele spermatice

la unii pesti;
2. Histone - sunt proteine cu o MM mai complexa, ce intra in structura
timusului si a pancreasului;
3. Scleroproteine - sunt proteine cu structura fibrilara cu rezistenta
mecanica, ce includ colagenul, elastina, keratina, fibrina;
4. Proteine fibrilare - miozina din muschi, fibrinogenul din plasma;
5. Prolamine - sunt proteine care intra in compozitia cerealelor;
6. Gluteline - globulinele din plasma, tuberina din cartofi;
7. Albumine – serumalbuminele din plasma, ovalbuminele din ou,
lactalbuminele din lapte, leucozina din grau.
 Proteinele complexe (conjugate)
sau heteroproteine

• Nucleoproteinele sunt cele mai importante proteine

complexe datorită faptului că gruparea lor prostetică
este reprezentata de un acid nucleic. Ele se împart în:
• Ribonucleoproteine (nucleoproteine ce conţin ARN)
si Dezoxiribonucleo-proteine (ce conţin ADN în
calitate de grupare prostetică).
• Cromoproteinele conţin în molecula lor o grupare
prostetică de natura protoporfirinică (ex.
hemoglobina, mioglobina, citocromii, catalaza,
peroxidaza etc).
 Proteinele complexe (conjugate)
sau heteroproteine
• - Fosfoproteinele. Grupările prostetice ale proteinelor din
aceasta grupa sunt reprezentate de resturi de serina esterificate
cu acid fosforic. Cele mai cunoscute fosfoproteine sunt cazeina,
vitelina, fosvitina şi altele.
• - Glicoproteinele contin grupări prostetice de natura
glucidică (galactoza, manoza, unele hexozamine, acidul N-
acetilneuraminic etc.). Cele mai bine studiate sunt γ-globulinele,
orosomucoidul seric, glucoproteinele serice ce determina grupele
sanguine şi altele.
• - Metaloproteinele contin unii ioni metalici (Fe2+, Fe3+,
Cu2+, Zn2+) în calitate de grupare prostetică. Din aceasta grupa
fac parte: feritina, transferina, ceruloplasmina şi altele.