Studiul hemoglobinei cu ajutorul spectrelor de absorbtie

in vizibil si ultraviolet

Scopul lucrarii
Studierea comportarii hemoglobinii, prin intermediul absorbtiei raiatiilor
electromagnetice din vizibil si ultraviolet. Cunoasterea aplicatiilor biomedicale ale spectrelor
sangelui.

Materiale si dispozitive necesare

Material biologic-o suspensie diluata obtinuta din cateva picaturi de sange (arterial sau
venos) dispersate in apa

Cuve de sticla cu grosimea de 1cm.

Spectrofotometru de absorbtie in vizibil si ultraviolet.

Cuva de cuart cu grosime de 1cm , cuva martor fiind plina cu apa (lichid de referinta).

Pipete, pahare Berzelius

Fenomenologie
Compozitia sangelui

Fig 1. Sangele contine plasma si elemente figurate (celule rosii, albe si trombocite).
 Sangele se prezinta ca un fluid complex, format din doua faze , plasma si elemente
figurate (celule rosii, albe si trombocite), carte impreuna cu limfa si lichidele interstitiale
formeaza mediul intern al organismului. Celulele rosii numite si eritrocite sunt celule
anucleate (fara nucleu) care contin hemoglobulina. Hemoglobulina contine o componenta
proteica numita globulina si o componenta prostetica numita hem. Molecula de globina este
o molecula proteica alcatuita din secvente diferite de aminoacizi cu diferite continuturi de
sulf. Hemul este pigmentul care determină culoarea roșie a sângelui deoarece contine fier, cu
rol de fixare a oxigenului si are capacitatea de a absorbi lumina vizibila. Eritrocitele
elibereaza hemoglobina in prezenta apei din cauza presiunii osmotice .

Fig 2. Eritrocitele contin molecule proteice de globina si hem

Spectrele de absorbtie ale proteinelor

Moleculele absorb in domeniul UV si vizibil al radiatiilor electromagnetice

datorita electronilor moleculari ᴨ delocalizati (formati din orbitali pp), caracteristici
legaturilor intermoleculare nesaturate (duble, triple) si care sunt mai excitabile
decat electronii σ (formati din orbitali s, p) asociati legaturilor simple.
 Proteinele care absorb in domeniul UV si vizibil au in compozitie grupari
atomice, sub forma de

- resturi de aminoacizi aromatici (triptofan, tirozina) ce absorb in UV

- grupari peptidice –CONH- care absorb in UV

- cromoforii din hem ce absorb in vizibil

Fig 3. Spectrul de absorbtie al triptofanului

Globulina absoarbe in domeniul UV, in special datorita triptofanului din

compozitia sa care absoarbe la 280nm in UV apropiat.

Spectrul de absorbtie al hemoglobinelor

Hemul absoarbe la limita dintre UV si vizibil (banda Seret de 400nm) si in

vizibil unde prezinta 2 maxime principale.
 Fig 4. Spectrul de absorbtie al hemoglobinei (Soret)

Spectrul de absorbtie pentru hem prezinta diferente atat de la o specie la alta

cat si in cadrul aceleiasi specii de la o varsta la alta si de la o stare fiziologica la
alta.

Fig 9. Spectrele de absorbtie a sangelui arterial si respectiv venos

 Pentru aplicatiile medicale este foarte important faptul ca in spectrul
hemoglobinei, pozitia maximului din vizibil al oxihemoglobinei din sangele arterial
difera de cel al carbohemeglobulinei din sangele venos.

In primul caz, avem benzi de absorbtie la 545nm si 577nm pentru singele

arterial (oxihemoglobina) iar in al doilea caz , avem cele doua benzi contopite intr-
o banda larga cu maxim de absorbtie la 500nm pentru sangele venos
(carbohemoglobina). In cazul unor intoxicatii cu oxid de carbon, sangele care
contine carboxihemoglobina prezinta doua benzi situate foarte apropiat de cele ale
sangelui arterial normal.

Spectrofotometrul

Este un aparat ce permite obtinerea spectrelor de absorbtie a diferitelor

substante. Prin acest gen de analiza se determina cantitativ intensitatea de absorbtie
la fiecare lungime de unda din spectrul de radiatie electromagnetica ce trece prin
proba. Ele se pot clasifica in doua mari categorii

a) Spectrofotometre cu un singur fascicul de radiatii

b) Spectrofotometru cu doua fascicule de radiatii

Din prima categorie fac perte modelele SPEKOL si VSU-2P, iar pentru citirea
absorbantei se introduc pe rand cuva cu solventul (apa distilata) si apoi cuva cu
proba dizolvata in solvent, in fata aceluiasi fascicul. Compararea absorbantei
solventului cu proba facandu-se pentru fiecare lungime de unda fixta.

Din a doua categorie fac parte modelele PERKIN ELEMER si SHIMADZU, iar
citirea absorbantei se face introducand simultan si proba si solventul in fata
aceluiasi fascvicul. Compararea absorbantei solventului cu proba facandu-se
automat pentru toate lungimile de unda din spectrul de radiatii utilizat.
 Spectrofotometrul SPEKOL

Spectrofotometrul este un aparat prin care trece un singur fascilul de lumina. In

drumul fascicolului de lumina se gasesc : un monocromator, o cuva cu susbstanta
de analizat, un detector si instrumentul de masura. Fascicolul de lumina este produs
de o sursa (lampa de lumina UV si lumina vizibila). Monocromatorul este
reprezentat de o prisma care desface lumina incidenta in cele 7 componente si o
retea de difractie care separa exact lungimea de unda de interes din fiecare culoare.
Cuva cu solutie de analizat. Detectorul care contine o celula fotoelectrica care in
urma interactiunii cu lumina produce un fotocurent. Fotocurentul exprima gradul de
absorbtie al probei ce se gaseste in calea fluxului de lumina si se vizualizeaza pe
scara unui instrument de masura etalonat in unitati de absorbanta- extinctie.

Modul de lucru.

Procedeul prezinta avantajul unei mai bune rezolutii si al obtinerii simultane a spectrelor in
UV si vizibil.

Valorile absorbantei luminii se vor citi punct cu punct din aproape in aproape pe domeniul
spectral vizat.

-se regleaza spectrofotometrul in raport cu domeniul de lungimi de unda in care se

intentioneaza a se lucra

-se conecteaza lampa de vizibil sau cea de UV,

-se deschid sistemele de fotoreceptie (celule fotoelectrice si fotomultiplicatori) pentru UV sau
vizibil.

-probele se introduc in cuve de sticla pentru obtinerea unui spectru in vizibil sau in cuve de
cuart pentru un spectru in UV

-se inregistreaza valorile absorbantei pentru domeniul de lungimi de unda , obtinandu-se

spectrul de absorbtie pentru proba respectiva.

-se noteaza intr-un tabel valorile din maximele benzilor de absorbtie obtinuta pentru fiecare
proba

Tabelul cu benzile de absorbtie din vizibil si UV ale hemoglobinei

Lungime de unda Absorbanta

700
680
660
640
620
600
580
560
540
520
500
480

220