METODE DE SPECTROMETRIE DE MASA PENTRU ANALIZA

ZAHARIDELOR
Electrospray Ionization (ESI) John Bennet Fenn, Koichi Tanaka Premiul Nobel pt. Chimie în
2002 -ESI – este o metodă de ionizare soft (moale) care permite formarea ionilor moleculari
(aproape exclusiv). În plus permite determinarea maselor moleculare pe baza unor probe foarte
mici. De asemenea permite detecția cationilor și anionilor. Se aplică în special compușilor
organici cu masă moleculară medie și mai ales moleculelor „biologice” (peptide, proteine,
zaharide, ologonucleotide, etc.). Gaz uscare Capilara Capilara eliminare solvent Analizorul de
masa Gaz uscare Pompa vid1 Pompa vid2 Sist. Focalizare (“lentile”) 1000-4000 V (produce
incarcarea particulelor % p=mz p1=Mr+z1z1 p2=Mr+(z1−1)z1−1 Electrospray mass spectrum %
𝑝 = 𝑚 𝑧 𝑝1 = 𝑀𝑛 + 𝑧1 𝑧1 𝑝2 = 𝑀𝑛 + 𝑧 1 − 1 𝑧1 − 1 p1 si p2 sunt doua picuri adiacente a caror
abundenta relative se citeste pe spectru  un sistem de doua ecuatii cu doua necunoscute  Mn si
z1 Mn = masa moleculara - Cunoscand secventele de aminoacizi din proteinele din bazele de
date se pot ide

Prezenţa grupelor funcţionale polare (-OH, -NH2), de multe ori conducelascăderea volatilităţii
compuşilor. Cîţiva compuşi cu moleculemici (aminoacizi,zaharide) nu pot fi analizaţi cu prea
mare uşurinţăprin GC datorită numărului marea grupelor polare.

Alte nume
 Zahă r;
 Zaharoză ;
 α-D-glucopiranozil- (1 → 2) -β-D-fructofuranozid;
 β-D-fructofuranozil- (2 → 1) -α-D-glucopiranozidă ;
 β- (2S,3S,4S,5R) -fructofuranozil-α- (1R,2R,3S,4S,5R) -glucopiranozidă ;
 α- (1R,2R,3S,4S,5R) -glucopiranozil-β- (2S,3S,4S,5R) -fructofuranozid;
 Dodecacarbon monodecahidrat;
 ((2R, 3R, 4S, 5S, 6R) -2 - [(2S, 3S, 4S, 5R) -3,4-dihidroxi-2,5-bis (hidroximetil) oxapent-2-il]
oxi-6- (hidroximetil) oxahexan-3,4,5-triol

 Zaharoza este comun zahă r. Este un dizaharidă , o moleculă compusă din

două  monozaharide: glucoză  și fructoză . Zaharoza este produsă natural în plante, din
care zahar de masa este rafinat. Are formulă moleculară  C12H22O11.
Spectrometria de masă este cea mai sensiilă metodă de analiză structurală. $a
diferăfundamental de celelalte tehnici spectrale uzuale #rezonan*a magnetică nucleară%
spectrometria îninfraroşu
% în ultraviolet etc& prin faptul că nu implică utilizarea radia*iilor electromagnetice.Spectromet
ria de masă este inclusă în tehnicile spectroscopice deoarece reprezentarea distriu*ieiunor
mase func*ie de aunden*ele relative este analogă cu reprezentarea intensită*ii unor
radia*iifunc*ie de lungimea de undă. Spre deoseire de celelalte tehnici spectrale%
spectrometria de masătransformă chimic proa care devine astfel nerecuperailă

Spectrometria de masă este o metodă fizică utilizată% în special% pentru analiza sustan*elor
organice ce constă% în esen*ă% în ionizarea sustan*ei investigate% urmată de separarea
ionilor o*inu*i în func*ie de raportul dintre masă şi sarcină. Spectrul de masă reprezintă
înregistrareamaselor şi a aunden*elor relative ale ionilor o*inu*i. Spectrul de masă este o
caracteristică afiecărui compus% iar identificarea ionilor rezulta*i în cursul fragmentării permite
% de multe ori%stailirea completă a formulei structurale.An cel mai simplu spectrometru de
masă #figura 1.1&% moleculele organice aflate în fază devapori sunt omardate cu un
fascicul de electroni% avBnd energia cuprinsă între 167(6 e@% pentru afi transformate în ioni
pozitivi cu energie înaltăC

-De-2e

→+

+⋅−

+atorită con*inutului energetic ridicat% ionul % denumit ion molecular sau ion7părinte%
vasuferi% în continuare% procese complee de fragmentare% ce vor conduce la formarea de
fragmenteionice şi neutreC

-mm sau -mm

D12D1 2

⋅+⋅⋅+⋅
=+=+

+intre acestea% spectrometrul de masă analizează numai fragmentele ionice. +eoarece ioniiau de
parcurs o distan*ă considerailă pBnă la colector% pentru a se evita ciocnirile dintre particulele
pozitive sau dintre acestea şi molecule neionizate% incinta aparatului este men*inută la o
presiunefoarte ;oasă #

16

7"

7 16

7(

mm >g&

Spectrometrele de masă de înaltă rezolu*ie permit% în principiu% determinarea directă

acompozi*iei elementale. +in păcate% rezolu*ia necesară creşte rapid cu creşterea masei
moleculare.+atorită creşterii numărului de atomi% creşte numărul de comina*ii posiile iar
diferen*ele întremasele moleculare ale diverselor comina*ii de atomi scad. +e eemplu%
pentru a face distinc*ieîntre '

20

>

15

 ? şi '

21

>

23

 ?S% ale căror mase sunt 321%1!1( şi% respectiv% 321%1!!1% este necesară orezolu*ie de
321=#321%1!!17321%1!1(& F 50.066. $istă pu*ine aparate comerciale capaile să atingăo
asemenea rezolu*ie.a utilizarea aparatelor cu rezolu*ie ridicată% compozi*ia elementală a
unei molecule poate fistailită cu certitudine dacă masa moleculară se situează în ;urul valorii
de 166 u.a.m. An acelaşitimp% utilzarea unor astfel de aparate permite şi stailirea compozi*iei
elementale a fragmentelor rezultate% ceea ce a;ută considerail la elucidarea structurii şi la
în*elegerea mecanismelor defragmentare.+e re*inut că în spectrul de masă al unei molecule
organice fiecare pic corespunde unui ioncu o anumită compozi*ie izotopică şi că valoarea m=e
se calculează cu masele izotopice din taelul!.1. şi nu cu masele atomice relative ale
elementelor.

 Sta;4rea 7tructur

Stailirea structurii peptidelor şi proteinelor este posiililă numai în condi*iile în care

ioniimoleculari suferă fragmentări. +eoarece tehnicile $SI şi -+I produc numai ioni
molecularistaili% este necesară utilizarea unei cantită*i suplimentare de energie pentru
fragmentare. +eşieistă diverse metode care permit acest transfer de energie% cea mai utilizată
este disocierea indusă prin coliziune #

)ollision Induced (ecomposition, )I(

&. )ragmentele rezultate sunt apoi analizate prin spectrometrie de masă în tandem #-S=-S&.An
principiu% această metodă constă în selectarea% cu a;utorul unui prim analizor% a unui
ion şiintroducerea acestuia într7o cameră de coliziune unde va intra în coliziune cu atomii unui
gazneutru. An acest mod% energia cinetică se va transforma par*ial în energie de vira*ie%
fragmentele produse fiind analizate de un al doilea spectrometru. +in acest motiv metoda se mai 
numeştespectrometrie de masă în tandem 'I+ #-S=-S 'I+&. :ezolu*ia primului analizor treuie să
fiesuficient de mare pentru a permite selec*ionarea picului ce corespunde izotopului

12

' al ionuluiinvestigat. An acest mod% spectrul de fragmentare o*inut nu va con*ine

picuri izotopice inutile.Spectrele de masă în tandem ale peptidelor şi proteinelor pot
fi înregistrate atBt pe aparate cuanalizoare magnetice% cBt şi pe aparate cu analizoare
9uadripolare. +iferen*a ma;oră dintre acesteaparate este legată de energia cinetică a ionilor. An
aparatele cu analizor magnetic% energia cinetică aionului precursor este de ordinul Le@% în
timp ce la aparatele 9uadripolare această energie este demaimum 166 e@. ceste diferen*e
au o influen*ă ma;oră asupra proceselor de fragmentare.naliza prin )/ -S=-S 'I+ a unui mare
număr de peptide ce con*ineau secven*ecunoscute de aminoacizi a permis identificarea tipurilor
principale de procese de fragmentare. +in punct de vedere practic% fragmentele pot fi clasate în
două categoriiCa& fragmente ce provin din scindarea a una sau două legături din catena
principalăE & fragmente ce suferă o scindare suplimentară a lan*ului aminoacidului.Primele
fragmente identificate au provenit în urma scindării legăturilor catenei principale.Scindarea unei
legături din lan*ul peptidic poate avea loc la nivelul a trei tipuri de legăturiC '

7'% '7 ? sau ?7'

. An urma acestor fragmentări pot rezulta şase tipuri de fragmente notate cu a

%

n
%c

 dacăsarcina pozitivă rămBne pe fragmentul ?7terminal şi cu 

% ,

% z

 dacă sarcina pozitivă rămBne pefragmentul '7terminal. Indicele

arată numărul de aminoacizi ai fragmentului. An figura (.0 suntreprezentate principalele tipuri de

fragmentări ale unei catene polipeptidice.

160
 

  Izotopii elementelor chimice aran*aBi &n ordine alfa!eticC

"5ura *0$0

  9rincipalele moduri de fra#mentare ale unei peptide prin spectrometrie de masă &n tandem )I(

O45o6a:arde

8ligozaharidele sunt compuşi rezulta*i prin asocierea de molecule de monozaharide

prinintermediul legăturilor de tip glicozidic. Waharurile cele mai frecvent întBlnite sunt
heozeleCglucoză% manoză% galactoză% fructoză% ?7acetilglucozamină% ?
7acetilgalactozamină etc.Stailirea structurii complete a oligozaharidelor este o prolemă mai
dificil de rezolvat înraport cu atriuirea structurală a peptidelor şi proteinelor. +ificultă*ile
întBlnite sunt determinate denecesitatea stailirii naturii ciclului
% a prezen*ei sau asen*ei ramifica*iilor% a configura*ieianomerice a fiecăreia dintre
legăturile glicozidice.)/ -S=-S este tehnica cea mai utilizată pentru înregistrarea spectrelor de
masă aleoligozaharidelor naturale sau derivatizate prin peracetilare sau permetilare. ?
omenclatura pentru caracterizarea fragmentelor rezultate în cursul înregistrării spectruluide masă
a fost propusă de către +omon şi 'ostello şi are la ază tipul de legătură care scindează.stfel%
fragmentele la care sarcina este localizată în zona nereducătoare se

"5ura *0130

  9icuri importante din spectrul ionilor ne#ativi ai unei nucleotide de secvenă A=AA 

notează cu % / sau 'E fragmentele la care sarcina este localizată în zona reducătoare se notează
cuQ% Y sau W. Indicele inferior arată numărul de oze prezente în cadrul fragmentuluiE indicele
superior% prezent în stBnga fragmentelor  şi Q corespunde legăturilor scindate pentru formare
a acestor fragmente #legăturile sunt numerotate ca în figura (.10&. iterele

β
... ce înso*esc indicele inferior arată% acolo unde este cazul% ramifica*ia implicată în scindare.
An figura (.10 este eemplificatsistemul propus de +omon şi 'ostello pentru caracterizarea
fragmentelor.

"5ura *01$

  Eomenclatura (omon')ostello

Ionii de tip /% '% W şi Y% ce apar prin scindarea legăturii glicozidice% permit

determinareasecven*ei de lan*. )ragmentele ce apar cel mai frecvent rezultă în urma scindării leg
ăturiiglicozidice% atomul de oigen fiind preluat de către partea reducătoare a moleculei
#figura (.1!&.

111
 

  Izotopii elementelor chimice aran*aBi &n ordine alfa!eticC

+iferen*a de masă dintre ionii de acelaşi tip permite deducerea secven*ei unei oligozaharide.-
odul de determinare este ilustrat în figura (.1"a ce prezintă spectrul unei pentazaharide peracetilat
e #lacto7?7fucopentoza ?)7I&. Spectrul este dominat de seria de ioni ooniu de tip /.Ionii de
la m=z 2(3% !"1% 404% 113" şi 1020 corespund fragmentelor /

1 )uc7c3% /

2)uc7>e7c"%/

 )uc7>e7<lc?c7c4% /

 )uc7>e7<lc?c7>e7c11 şi /

 )uc7>e7<lc?c7>e7>e7c10.ceste fragmente permit atriuirea structurală a

secven*ei oligozaharidei investigateE nu este totuşi posiil să se discearnă între cei doi
diastereoizomeri% galactoză şi glucoză #>e F <al sau <lc&.

"5ura *01(

  0ecanismul formării ionilor de tip  +i L 

"5ura *01)0

Spectrele  0S80S )I( a două oli#ozaharide peracetilate, izomere de catenă

  Izotopii elementelor chimice aran*aBi &n ordine alfa!eticC

% la m=z 2(3 #/
1

% )uc7c3& şi 331 #/

% >e7c0&E în schim% lipsesc ionii dizaharidici de tip /

de la m=z !"1. Ionii de masă ridicată de la m=z 404 #/

C >e7

)uc

7<lc?c7c4&% m=z 113" #/

C>e7

)uc

7<lc?c7>e7c11& şi mz 1020 #/

C >e7

[
)uc

7<lc?c7>e7>e7c10& permitstailirea secven*ei restante% secven*ă ce nu

mai con*ine ramifica*ii.'ele mai une rezultate se o*in cu ionii pseudomoleculari

-D>

 ai oligozaharidelor normale sau derivatizate. Spectrele oligozaharidelor normale con*in frecvent

fragmente interne%apărute în urma scindării concomitente a două legături glicozidice
% situa*ie care complicădeterminarea ordinii secven*iale.Ionii de tip  şi Q% ce rezultă prin
scindarea a două legături din ciclul glicozidic% şi ionii detip % ce rezultă prin scindarea dintre
atomii de caron ! şi "% permit stailirea izomeriei de
pozi*iea fiecărei legături glicozidice prezente în oligozaharidele liniare sau ramificate. -odul defr
agmentare ce produce aceşti ioni este prezentat în figura (.1(. Sunt posiile două moduri
defragmentare% unul furnizBnd ioni de tipul

1%!

Q%

1%3

 şi

3%!

% iar celălalt ioni de tipul

6%2

Q%

6%0
 şi

2%0

.ipurile de fragmente ce sunt utilizate pentru determinarea izomeriei de pozi*ie a

legăturilor glicozidice sunt prezentate în taelul (.0. +e eemplu% o legătură glicozidică de tip
1%0 nu va permite decît formarea unor ioni de tipul

1%!

Q%

6%2

Q%

3%!

 şi

2%0

.

"5ura *01*0

  0ecanismul formării ionilor de tip  +i O 

Ta;e4u4 *0$0

Picuri utilizate pentru diagnosticarea izomeriei de pozi*ie a legăturilor

glicozidice ipul de ipul de fragmentlegătură

i6%2

i1%!

i6%0


i1%3

i2%0

i3%!

1727DD7D771737DD7DD71707DD77DD17"7DDD77DAn figura (.14 este prezentat

spectrul )/ -S=-S 'I+ al aductului #-D?a&

al uneioligozaharide.
+eterminarea configura*iei anomerice a legăturilor glicozidice se azează pe oidareaselectivă
% cu trioid de crom% a anomerului

 al heozelor derivatizate cu formarea unui ceto7ester #figura (.15&.

+iferen*a între greutatea moleculară a oligozaharidei înainte şi după oidare permitedeterminar
ea numărului de legături

7glicozidice prezenteC o creştere a masei cu 10? u.a.m. indică prezen*a a ? legături de tip

7glicozidic. Pozi*ia legăturilor oidaile poate fi stailită func*ie defragmentele de tip /% '%
Y şi W rezultate.+eterminarea maselor moleculare ale amestecurilor de oligozaharide poate fi
realizată cua;utorul tehnicii -+I. Prin această metodă oligozaharidele sunt identificate su
forma aduc*ilor sodici. An figura (.26 este reprezentat spectrul -+I al unui amestec de
0 oligozaharide% rezultatela scindarea unei glicoproteine.

113
 

  Izotopii elementelor chimice aran*aBi &n ordine alfa!eticC

6%2

11%!

16%0


11%3

12%0

13%!

<al 170 <lc?ac16655417777325<lc?ac 172 -an46!(3"77!4677-an 17" -an7!32002(!677((4-an 170 
<lc3!"3247777542

"5ura *01,0

Spectrul  0S80S )I( al 0PEa<

  al unei oli#ozaharide

"5ura *01?0

idarea selectivă a le#ăturilor

β 

'#licozidice

110
 

  Izotopii elementelor chimice aran*aBi &n ordine alfa!eticC

"5ura *020

Spectrul 0-(I al unui amestec de 4 oli#ozaharide

https://www.academia.edu/32301766/Spectrometria_de_Masa