UNIVERSITATEA „ ALEXANDRU IOAN CUZA” din IAŞI

FACULTATEA DE CHIMIE
Anul universitar 2020-2021
Semestrul I

DISCIPLINA
METODE SPECTRALE DE ANALIZĂ ÎN CHIMIA CLINICĂ

Spectroscopia de rezonanţă magnetică

nucleară a proteinelor

SAVIUC-PAVĂL ANA-MIHAELA

GRUPA: 1553 B
 Știm că proteinele sunt substanțe organice, macromoleculare, formate din lanțuri simple
sau complexe de aminoacizi, prezente în celulele tuturor organismelor vii, iar caracterizarea lor
din punct de vedre structural este destul de dificilă. Astfel, în ultima vreme RMN-ul este o a
doua metodă după difracția cu raze X utilizată pentru caracterizarea structurilor macromoleculare
și a interacțiunilor intermoleculare cu rezoluție spațială și temporală ridicată. Totodată
spectroscopia RMN și difracția cu raze X oferă informații complementare privind mobilitatea
moleculară internă, suprafețele moleculare ale proteinelor, hidratarea proteinelor și
caracteristicile structurale și dinamice legate de problema plierii în structurile lor caracteristice
tridimensionale. Utilizarea combinată a celor două metode poate aduce, prin urmare, informații
mai detaliate asupra bazei structurale a funcțiilor proteinelor și, astfel, poate oferi o platformă
mai fiabilă pentru proiectarea rațională a medicamentelor și ingineria unor funcții proteice noi.

În prezent, majoritatea probelor sunt examinate într-o soluție apoasă, dar sunt cunoscute
și metode de lucru cu probe solide. Colectarea datelor se bazează pe plasarea eșantionului într-un
camp magnetic puternic, pe trimiterea de semnale de radiofrecvență prin eșantion și pe
măsurarea absorbției acelor semnale. În funcție de tipul atomilor din cadrul proteinei, nucleele
acestora vor avea diferite frecvențe de absorbție al acestor semnale. Mai mult, aceste semnale pot
fi perturbate de nucleele adiacente. Aceste informații sunt utilizate pentru determinarea
distantanței dintre nuclee și implicit a structurii generale a proteinei.

Obținerea unei probe de proteine pentru un studiu RMN este o etapă inseparabilă a
procesului de obținere a unui model molecular, iar succesul final este condiționat de definiția
precisă a polipeptidelor care urmează să fie studiate, strategia de alocare a semnalului RMN,
precum și metoda de obținere a eșantionului.

Astfel, rezonanța magnetică nucleară a proteinelor se efectuează pe probe apoase cu o

concentrație cuprinsă între 0,1 și 3 milimolar. Proteina poate să fie naturală sau produsă în
laborator, utilizând tehnici de ADN recombinant prin inginerie genetică, care face posibilă
marcarea izotopică. Proteina purificată este de obicei dizolvată într-o soluție tampon și ajustată
la condițiile de solvent dorite, spre exemplu, să imite un fluid fiziologic. Pe de altă parte, soluțiile
pot fi schimbate și în condiții nefiziologice extreme, de exemplu pentru studii de denaturare a
proteinelor. În plus, pe lângă determinarea structurii proteinelor, tehnicile RMN includ și
investigații ale caracteristicilor dinamice ale structurilor moleculare, precum și studiile aspectelor
structurale, termodinamice și cinetice ale interacțiunilor dintre proteine și alte componente ale
soluției ( macromolecule, sau liganzi cu masă moleculară mică).

Pentru a obține informații despre proteine este utilizată rezonanță magnetică nucleară
multidimensională. Ideal ar fi ca fiecare nucleu distinct din moleculă să aibă un mediu electronic
distinct și astfel o deplasare chimică distinctă prin care poate fi recunoscut. Cu toate acestea, în
moleculele mari, cum ar fi proteinele, numărul de rezonanțe poate fi de câteva mii și un spectru
unidimensional prezintă inevitabil suprapuneri. Prin urmare, sunt necesare spectre
multidimensionale care corelează frecvențele nucleelor distincte. Dimensiunile suplimentare
scad șansele de suprapunere și au un conținut mai mare de informații, deoarece corelează
semnalele nucleelor dintr-o parte specifică a moleculei. Magnetizarea este transferată în probă
folosind impulsuri de energie electromagnetică (radiofrecvență), iar între nuclee folosind așa-
numitele secvențe de impulsuri. Secvențele de impulsuri permit experimentatorului să
investigheze și să selecteze tipurile specifice de conexiuni dintre nuclee.

În mod tipic, primul spectru care trebuie interpretat pentru o proteină marcată cu izotop
este un spectru de corelație cuantică unică heteronucleară 2D, HSQC (alte nuclee decât 1H). În
teorie, corelația cuantică heteronucleară unică are un vârf pentru fiecare H legat de un
heteronucleu. Astfel, în 15N-HSQC, cu o proteină marcată cu 15N, se așteaptă un semnal pentru
fiecare atom de azot din scheletul proteinei. Semnalele suplimentare 15N-HSQC sunt furnizate de
fiecare rest cu o legătură azot-hidrogen în lanțul său lateral. 15N-HSQC este adesea menționat ca
particularitate a unei proteine, deoarece fiecare proteină are un model unic de poziții ale
semnalelor. Analiza 15N-HSQC permite să evaluăm dacă numărul de vârfuri așteptat este prezent
și astfel să identificăm posibile probleme datorate conformațiilor multiple sau eterogenității
eșantionului.

Studierea clasică a unei proteine nemarcate, constă în înregistrare unui set de experimente
RMN homonucleare bidimensionale prin spectroscopie de corelație (COZY), care includ
spectroscopia de corelație convențională, spectroscopia de corelație totală (TOCSY) și
spectroscopia cu efect nuclear Overhauser (NOESY). Un experiment cu rezonanță magnetică
nucleară bidimensională produce un spectru bidimensional, în care unitățile ambelor axe sunt
deplasări chimice. Astfel experimentul COZY este capabil să transfere magnetizarea între
protoni pe atomii adiacenți, în timp ce în experimentul TOCSY, protonii sunt capabili să
retransmită magnetizarea, deci aceasta este transferată între toți protonii care sunt conectați de
atomii adiacenți. Astfel, aceste două experimente ne ajută să stabilim rezonanțele deplasărilor
chimice ale protonului peptidic, ale protonilor alfa și a tuturor protonilor din lanțul lateral al
fiecărui rest peptidic.

O problemă importantă a utilizării rezonanței magnetice nucleare homonucleare este

suprapunerea între vârfuri. Acest lucru se întâmplă atunci când diferiți protoni au aceleași
deplasări chimice sau foarte similare. Această problemă devine mai pronunțată pe măsură ce
proteina este mai mare. De aceea rezonanța magnetică nucleară homonucleară este de obicei
limitată la proteine mici sau la peptide.

Proteinele mari sunt adesea alcătuite din mai multe domenii structurale, capabile să se plieze
singure [1]. Aceste domenii pot fi uneori asociate unor grupări funcționale specifice care își
păstrează caracteristicile și atunci când sunt studiate în afara contextului întregii proteine.
Aceaste grupări funcționale pot fi însă influențate de activitatea catalitică, de interacțiunea cu o
altă proteină sau de alte componente chimice ale celulei (ADN, carbohidrați, lipide, etc.).
Împărțirea în domenii funcționale este importantă, deoarece reduce studiul general al unei
proteine la cel al domeniilor individuale care o compun (care sunt în general de dimensiuni mici
de la câteva zeci până la câteva sute de aminoacizi). Plierea tridimensională a unui domeniu,
precum și gruparea funcțională a acestuia impun limitări asupra compoziției sale de aminoacizi.
Definirea unui anumit domeniu se bazează pe identificarea acestor aminoacizi conservați în
timpul evoluției proteinei. Această analiză constă în succesiunea secvențelor diferitelor proteine
similare (îndeplinind o funcție identică în diferite organisme), astfel încât să se identifice
aminoacizii identici sau care au proprietăți fizico-chimice similare. În majoritatea cazurilor, se
identifică unul sau mai multe domenii și se sugerează o posibilă „decupare” a proteinei. Cu toate
acestea, mici variații ale secvenței, în special în interiorul regiunilor marginale ale domeniului,
pot avea consecințe importante asupra acestuia în soluție și a calității spectrelor obținute. Prin
urmare, este necesară stabilirea unui anumit domeniu, pentru care să combinăm analiza secvenței
cu caracterizarea RMN a diferitelor polipeptide utilizând spectre de corelație 1H-15N. Aceste
corelații permit ca fiecare vârf de 1H-15N să fie legat de carbonul grupării carbonil precedent, iar
atribuirea secvențială poate fi apoi realizată prin corelarea deplasărilor atomilor de carbon proprii
și anteriori ai fiecărui sistem de spin. Dacă proteina este obținută în cantitate suficientă și este
marcată cu 13C și 15N, utilizarea tehnicilor de spectroscopie cu triplă rezonanță 3D, bazate pe
transferul polarizării spinului nuclear peste legătura peptidică și conectarea diferitelor sisteme de
spin prin legături, permite o simplificare considerabilă a spectrelor RMN și implicit o
automatizare parțială a procesului de atribuire. Acest lucru se face de obicei folosind unele dintre
următoarele experimente: HNCO , HN (CA) CO , HNCA , HN (CO) CA , HNCACB și CBCA
(CO) NH . Toate cele șase experimente constau dintr-un plan 1H-15N (similar cu un spectru
HSQC) extins cu o dimensiune de carbon. În HN (CA) CO, fiecare plan H - N conține vârfurile
carbonului carbonilic din restul său, precum și cel precedent din secvență. HNCO conține
schimbarea chimică a carbonilului carbonilic doar de la restul precedent, dar este mult mai
sensibilă decât HN (CA) CO. Aceste experimente permit ca fiecare vârf de 1H-15N să fie legat de
carbonul carbonil precedent, iar atribuirea secvențială poate fi apoi realizată prin potrivirea
deplasărilor carbonilor proprii și anteriori ai fiecărui sistem de spin. HNCA și HN (CO) CA
funcționează în mod similar, doar cu C α, iar HNCACB și CBCA (CO) NH conțin atât C α, cât și
Cβ. De obicei, mai multe dintre aceste experimente sunt necesare pentru a rezolva suprapunerea
în dimensiunea carbonului. Această procedură este de obicei mai puțin ambiguă decât metoda
bazată pe NOESY, deoarece se bazează pe transferul de sarcină. Prin utilizarea tehnicii NOESY
vor apărea vârfuri suplimentare corespunzătoare atomilor apropiați în spațiu, dar care nu aparțin
resturilor secvențiale, îngreunând astfel procesul de atribuire. Însă fiecare vârf poate fi
transformat într-o distanță între nuclee, cuprinsă între 1,8 și 6 Å, iar intensitatea unui vârf
NOESY este proporțională cu distanța până la puterea (- 6). După atribuirea inițială de rezonanță
secvențială, este posibilă extinderea atribuirii de la atomii de carbon Cα și Cβ la restul lanțului
lateral utilizând experimente precum HCCH-TOCSY, care este practic un experiment TOCSY
rezolvat într-o dimensiune suplimentară de carbon.

Se știe că geometria din jurul Cα afectează constantele de cuplare și deplasările chimice.

De aceea având în vedere constantele de cuplare sau deplasările chimice, se pot face presupuneri
referitoare la unghiurile de torsiune, iar prin determinarea orientării unui număr suficient de
legături în raport cu câmpul magnetic extern, se poate determina structura proteinei.

Cuplajul dipolar este utilizat în mod obișnuit în RMN-ul corpurilor în stare solidă și oferă
informații despre orientarea relativă a vectorilor de legătură în raport cu un singur cadru de
referință global. Suprapopularea ușoară a unei orientări indică o cuplare a resturilor dipolare
utilizate pentru ajustarea structurilor determinate anterior, dar și pentru determinarea structurii de
novo.

Deoarece spectroscopia RMN este specifică nucleului, cu ajutorul ei se poate realiza și o

diferențiere între hidrogen și deuteriu. Știm că între protonii amidici din proteină și cei din
solvent, au loc schimburi ionice, însă dacă solventul conține un izotop diferit, ca de exemplu
deuteriu, reacția poate fi monitorizată prin spectroscopie RMN. Viteza cu care are loc acest
schimb poate oferi informații cu privire la ce părți ale proteinei sunt diferite, legate de hidrogen,
etc. O aplicație în acest sens este compararea schimbului de protoni a unei forme libere cu un
complex [2].

Pe de altă parte, încetinirea mișcărilor de difuzie rotațională a proteinei duce la o lărgire a

liniilor de rezonanță sub efectul relaxării mai eficiente a dipolului. Eficacitatea relaxării poate fi
redusă prin scăderea densității de protoni folosind probe de proteine îmbogățite uniform cu
deuteriu și marcate cu 15N și 13C. Acest lucru combinat cu utilizarea experimentelor de corelație
de tip TROSY („spectroscopie optimizată de relaxare transversală”), care exploatează
proprietățile de relaxare ale anumitor nuclee pentru a reduce lățimea semnalelor de rezonanță,
face posibilă obținerea spectrelor la rezoluție mare pentru structuri mari (mai mult de 200 de
aminoacizi). Cu toate acestea, aglomerarea spectrală rămâne adesea o problemă de atribuire care
poate fi rezolvată prin implementarea unor tehnici particulare, cum ar fi marcarea specifică a
anumitor tipuri de aminoacizi sau marcarea unor fragmente [3].

Când dimensiunea proteinei sau a complexului proteic devine foarte mare (până la 1
MDa), încorporarea selectivă și stereospecifică a unui 13C pe grupările metili ale leucinelor și
valinelor a unei proteine distribuite uniform devine singura modalitate de a obține informații
despre structura și dinamica acesteia. Această încorporare se bazează pe utilizarea precursorilor
biosintetici ai acestor aminoacizi, cum ar fi acidul α-cetoisovaleric, marcat în poziții specifice
[4]. Un exemplu al utilizării cu succes a acestui tip de abordare este oferit de studiul soluției
proteazomului, un complex multiproteic de 670 kDa [4]. Astfel, marcarea proteinelor izotopice
arată că modul de obținere a probei este în strânsă legătură cu studiul structural al unei proteine
prin RMN. În plus în afară de informații referitoare la structură, rezonanța magnetică nucleară
ne poate da și informații despre dinamica diferitelor părți ale proteinei prin măsurarea timpilor de
relaxare care pot furniza informații despre mișcările unei molecule la nivel atomic. În studiile
RMN ale dinamicii proteinelor, izotopul 15N este nucleul preferat de studiat, deoarece timpul de
relaxare al acestuia este relativ simplu de raportat la mișcările moleculare, însă rezultatele
obținute din aceste măsurători pot să nu fie reprezentative pentru întreaga proteină. De aceea sunt
utilizate și măsurători ale timpilor de relaxare a 13C și a deuteriului care permit studii sistematice
ale mișcărilor lanțurilor laterale de aminoacizi din proteine.

Determinarea structurii prin RMN a fost în mod tradițional un proces care consumă mult
timp, necesitând o analiză interactivă a datelor de către un specialist. Cele două procese care
consumă cel mai mult timp sunt atribuirea de rezonanță specifică secvenței (atribuirea scheletului
principal și a lanțului lateral) și sarcinile de atribuire NOE. De aceea a existat un interes
considerabil în automatizarea procesului pentru a crește capacitatea de determinare a structurii și
pentru a face spectroscopia RMN accesibilă și non-experților . În acest sens au fost dezvoltate
diferite programe care vizează părți individuale ale procesului general de determinare a structurii
RMN într-un mod automat. Cele mai multe progrese au fost realizate pentru atribuirea automată
de sarcina NOE.

BIBLIOGRAFIE:

1. Wüthrich K., (2001), Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy of Proteins New
York: Wiley. ISBN   978-0-471-82893-8;
2. GS Rule, TK Hitchens, (2006),  Fundamentals of protein NMR spectroscopy Berlin Springer,
ISBN   978-1-4020-3499-2;
3. Cavanagh J, Fairbrother WJ, Palmer AG III and Skelton NJ (1996) Protein NMR
Spectroscopy, Principles and Practice. New York: Academic Press;
4. Wüthrich, K. (1986) NMR of Proteins and Nucleic Acids (Wiley, New York).