Sunteți pe pagina 1din 9

C2

PRINCIPIILE FUNDAMENTALE ALE ADN

n conformitate cu modelul dublu helical al moleculei de ADN, aceast structur are la baz dou
caracteristici sau principii fundamentale:
principiul complementaritii i
cel al antiparalelismului.
Principiul complementaritii
Principiul complementaritatii : secvena bazelor din una dintre catene specific obligatoriu secvena
bazelor n catena opus
Fenomenul de complementaritate este determinat de faptul c cele dou catene polinucleotidice
sunt meninute mpreun prin legturi de hidrogen intercatenare, care se stabilesc ntre bazele
azotate:
A=T, T=A, respectiv GC, CG,
Prin acest principiu se nelege c nu exist nici o restricie n ceea ce privete succesiunea bazelor azotate
de-a lungul uneia dintre catene, dar secvena bazelor din una dintre catene specific obligatoriu secvena
bazelor n catena opus.
Astfel, cele dou catene ale ADN au, n mod obligatoriu, secvene complementare.
La nivel molecular, fenomenul de complementaritate este determinat de faptul c cele dou catene
polinucleotidice sunt meninute mpreun prin legturi de hidrogen intercatenare, care se stabilesc
ntre bazele azotate situate pe cele dou catene numai sub forma unor perechi riguros specifice.
Spre deosebire de ARN , care este format de regula dintr-o singura catena polinucleotidica,
ADN este alcatuit din 2 catene antiparalele legate intre ele intotdeauna printr-o legatura intre o
baza azotata purinica si una pirimidinica.
Ca urmare in molecula de ADN nu exista decat urmatoarele tipuri de legaturi:
AT; 2 leg de H
T A; 2 leg de H
G C ; 3 leg de H
C G . 3 leg de H

Adenina i timina se pot mperechea spaial prin stabilirea a dou legturi de hidrogen, iar citozina i
guanina prin trei legturi de hidrogen.
Datorit acestui fapt legturile G-C sunt mai stabile, ceea ce influeneaz proprietile fizice, chimice i
biologice ale moleculei.
Complementaritatea bazelor reprezint particularitatea cea mai important a moleculei de ADN.

1
Ea explic mecanismul de replicare corect a ADN, ct i capacitatea de transmitere fidel a informaiei
genetice.
Prin complementaritate se explic i mecanismele transcrierii i traducerii informaiei genetice.
Ea st la baza unor procese fundamentale cum sunt cele de recombinare genetic i de reparare a
leziunilor ADN produse de factorii de mediu.

Principiul antiparalelismului
A doua caracteristic fundamental a modelului Watson-Crick deriv din modul de orientare a
legturilor fosfodiesterice 3'5' n cele dou catene cu polaritate opus:
ele sunt orientate n direcii opuse, adic sunt antiparalele una fa de cealalt .

Antiparalele:cele dou catene polinucleotidice sunt orientate n direcii opuse,


5'3', 3'5'
2
Aceast particularitate explic i replicarea ADN a crui sintez ncepe de la extremitatea liber 5'
spre cea 3', pentru fiecare caten, determinnd o cretere a catenei n formare n direcia 5'3'.

Cele dou catene antiparalele (5'3', 3'5') sunt alctuite spre exterior din molecule de deoxiriboz
(componenta hidrofil) legate ntre ele cu grupri fosfat prin legturi fosfodiesterice.
Bazele azotate (componentele hidrofobe ale nucleotidelor), orientate spre interiorul dublei elice, de pe
cele dou catene sunt legate ntre ele prin legturi de hidrogen i de moleculele de dezoxiriboz prin
legturi -N-glicozidice .
Coloana vertebral a moleculei este alctuit din dou catene polinucleotidice, care formeaz o dubl
elice dirijat spre dreapta, n jurul unui ax imaginar comun. (FIGURA)

3
Cele dou catene, denumite colocvial catena Watson, iar cea complementar caten Crick, sunt
rsucite una fa de cealalt formnd o dubl elice regulat cu diametrul de 2 nm, care prezint o incizur
mic de 1,2 nm i o incizur mare de 2,2nm (1nm = 10-9 m). (Figura de sus)
Distana ntre dou nucleotide este de 0,34 nm, iar un tur complet de spir are 3,4 nm.
Molecula de ADN dublu catenar este stabilizat de cel puin trei categorii de fore:
legturile de hidrogen care asigur mperecherea bazelor dei sunt slabe, contribuie la stabilizarea
moleculei datorit numrului lor mare. Se apreciaz c energia necesar pentru ruperea acestor
legturi de hidrogen este de aproximativ 5,6 cal/mol;
interaciunile electronice, respectiv legturile Van der Waals i atraciile dipol-dipol dintre
planurile bazelor suprapuse
- prile hidrofile ale moleculei (pentoza + fosfat) sunt ndreptate spre exteriorul dublei elice, iar cele
hidrofobe (bazele azotate) sunt situate spre interiorul ei, conferind maximum de stabilitate moleculei.

Studiul difraciei razelor X la trecerea prin soluii de ADN a demonstrat existena unor tipuri
conformaionale, uor diferite, care au fost notate cu A, B, i C.
Conformaia de tip B este cea mai apropiat de modelul Watson-Crick, avnd pasul elicei de
3,4 nm, 10 pb per tur de elice i planul de orientare al bazelor perpendicular pe axul dublului
helix.
Conformaia de tip A i conformaia de tip C prezint uoare abateri fa de conformaia de
tip B, ele ntlnindu-se la grupuri restrnse de sisteme biologice.
Pe lng conformaiile moleculare menionate, s-a mai descris i o a patra modalitate de rsucire a
catenelor de ADN: conformaia de tip Z. Conformaia Z corespunde unor molecule de ADN care
se abat de la modelul clasic descris de Watson i Crick .

4
In ceea ce privete scrierea secvenei de baze dintr-o anumit molecul de ADN exist o
anumit convenie:
de obicei, se utilizeaz literele corespunztoare bazelor azotate ce alctuiesc nucleotidele din
secvena de interes:
5 C A T G T G C 3
3 G T A C A C G 5
Uneori ns, n notaii se specific i legtura fosfodiesteric prin introducerea literei p ntre literele
ce specific bazele: CpApTpGpTpGpCp etc.
In anumite situaii este necesar s se scrie secvena de nucleotide de pe ambele catene dar, de cele mai
multe ori se noteaz numai succesiunea de nucleotide de o caten tiind c pe cealalt exist nucleotidele
complementare.
Notarea ncepe ntotdeauna cu nucleotidele de la captul 5 al ADN (n partea stng), nefiind
necesar specificarea captului 5 i 3.
Astfel, dac secvena de nucleotide precizat mai sus ar reprezenta o parte dintr-o gen, ea ar putea fi
scris direct sub forma: C A T G T G C (Elliott i Elliott, 1997).

Proprietile fizico-chimice ale ADN

Particularitile moleculelor de acizi nucleici, a ADN n special, pot fi determinate prin utilizarea
unor tehnici variate aplicarea acestora depinznd de scopul cercetrilor:
microscopie electronic,
ultracentrifugare,
electroforez, s
pectrofotometrie etc,

Masa molecular i dimensiuni


Sub raportul masei moleculare sunt cele mai mari molecule din sistemele vii, ajungnd la 107 4 x
109 daltoni.
In cazul ADN viral acesta poate conine cteva sute de perechi de baze, iar ADN al bacteriei
Escherichia coli are aproximativ 4 milioane de perechi de baze.
La om lungimea ADN per complement haploid (genom, n 23 cromosomi), corespunde la 3,3 x 10 9
perechi baze sau 3,3 x 106 Kbaze 1m lungime.
Dac inem cont c n organismul uman exist aproximativ 1013 celule diploide i se calculeaz
lungimea total a ADN coninut n aceste celule, se poate ajunge la o valoarea astronomic, de ordinul
diametrului sistemului solar (Elliott i Elliott, 1997).

5
Conformaia molecular a moleculelor poate fi determinat prin utilizarea electroforezei n gel de agaroz
i a microscopiei electronice.
Datorit metodelor brutale de purificare a ADN, lungimea corect a unei molecule se poate aprecia numai
prin corelarea datelor obinute prin dou trei metode, dintre care sunt de amintit:
microscopia electronic,
autoradiografia,
coeficientul de sedimentare,
densitatea de plutire.
Compoziia n baze a ADN i semnificaia acesteia
Absorbia radiaiilor ultraviolete cu lungimea de und de 260 nm, folosit pentru determinri
cantitative de ADN din soluii, nu este aceeai pentru formele monocatenare i bicatenare ale acestuia.
S-a constatat n mod experimental c absorbia UV este cu 3040 % mai mare n cazul formelor
monocatenare, fa de cele bicatenare la care are loc o mascare a bazelor azotate (implicate n absorbie)
ca efect al structurii sale.
Analiza coninutului n baze azotate din ADN de diferite origini, a artat o variaie relativ a
cantitii acestora n funcie de sursa de provenien a materialului genetic.
Compoziia n baze se exprim n general n procente de G+C din cantitatea total de ADN, sau
sub forma raportului A+T/G+C.
Dei raportul este variabil de la o specie la alta, la organismele pluricelulare acest raport este acelai
indiferent de natura celulelor sau esutului de origine
Unele dintre proprietile ADN sunt puternic influenate de procentul G+C. Astfel, densitatea unei
soluii de ADN este cu att mai mare cu ct cantitatea de G+C crete.
Ca urmare, se poate determina acest coninut G+C i indirect n funcie de densitatea de plutire.
Aprecierea coninutului n G+C se mai poate face i prin determinarea punctului de topire (Tm
melting point temperature).
Temperatura medie de topire (Tm) este influenat de mai muli factori dintre care cel mai important este
proporia bazelor GC.
Aceste baze azotate, fiind legate prin legturi triple de hidrogen asigur structurii dublu catenare o mai
mare stabilitate, deci ruperea lor necesit o temperatur mai ridicat (un punct de topire mai ridicat)
comparativ cu bazele AT.
Valoarea punctului de topire va da deci indicaii asupra proporiei de baze GC ce intr n compoziia ADN
dublu catenar, variind n funcie de specie i constituind astfel un criteriu taxonomic, cel puin pentru
bacterii.
Denaturarea i renaturarea ADN
Moleculele de ADN dublu catenar pot suferi modificri ale proprietilor lor fizice ca rezultat al
aciunii unor factori fizici sau chimici.
6
Experimental s-a demonstrat c prin nclzirea la temperaturi cuprinse ntre 63C i 100C a
soluiilor ce conin ADN, n funcie de natura i proveniena moleculelor de ADN acestea sufer o rupere
a legturilor de hidrogen care leag n mod normal bazele.
In consecin, cele dou catene ale ADN se separ, moleculele devenind monocatenare.
Fenomenul se numete denaturare termic, el fiind denumit i topire, deoarece este nsoit de o
fluidizare a soluiei, iar cldura furnizeaz energia necesar pentru ruperea legturilor de hidrogen.
Fenomenul de denaturare se realizeaz n mai multe etape.
Iniial, cele dou catene se deruleaz parial dar rmn reunite prin anumite segmente dublu
catenare n care bazele continu s formeze perechi.
Cnd temperatura a atins punctul de topire are loc separarea complet a celor dou catene.
Temperatura de denaturare este influenat de mai muli factori dintre care cel mai important este
proporia de GC.
Cele trei legturi de hidrogen dintre bazele azotate, asigur n mai mare msur stabilitatea structurii
dublu catenare.
Dovada o constituie faptul c topirea termic, derularea i denaturarea ncep n regiuni bogate n legturi
A-T i continu cu cele cu coninut crescut n G-C.
Temperatura de topire este cu att mai mare cu ct procentul GC este mai ridicat.
Efectul hipercromic nsoete procesul de denaturare termic i se manifest printr-o cretere progresiv a
capacitii de absorbie a radiaiilor UV cu lungimea de und de 260 nm.
Aceast cretere este corelat cu coninutul n baze de tipul A-T i va fi n final cu aproximativ
40% mai mare fa de absorbia moleculelor normale bicatenare.
Dac soluia de ADN denaturat este rcit brusc, catenele complementare rmn separate, ceea ce
nseamn c procesul de denaturare a devenit permanent.
n schimb, dac rcirea este lent, are loc procesul de refacere a legturilor de hidrogen dintre bazele
complementare ale catenelor i deci refacerea moleculelor dublu catenare. Procesul a fost numit
renaturare.

7
DENATURAREA TERMIC a ADN este insotita de EFECTUL HIPERCROMIC
adica de cresterea intensitatii absorbtiei razelor UV de catre solutia de ADN denaturat datorita
expunerii bazelor azotate la exterior, in contact direct cu radiatiile UV.
se manifest printr-o cretere progresiv a capacitii de absorbie a radiaiilor UV cu
lungimea de und de 260 nm.
Aceast cretere este corelat cu coninutul n baze de tipul A-T i va fi n final cu aproximativ 40%
mai mare fa de absorbia moleculelor normale bicatenare.
RENATURAREA TERMIC a ADN este insotita de EFECTUL HIPOCROMIC adica de scaderea
absorbtiei razelor UV datorita refacerii structurii dublu catenare.

Hibridarea molecular
Una dintre cele mai importante aplicaii ale procesului de denaturare renaturare este hibridarea
molecular.
Ea permite renaturarea prin combinarea unor molecule de ADN monocatenare sau de ADN
monocatenar i ARN.
Se formeaz molecule hibride de tip ADN ADN sau ADN ARN, indiferent de proveniena
lor, cu condiia existenei unui grad de nrudire, respectiv de complementaritate n secvena bazelor.
In cazul hibridarii ADN-ARN: ADN dublu catenar este transcris intr-o molecula de ARN
monocatenar (transcript), complementar cu una dintre cele 2 catene ale ADN.Denaturarea termica
a ADN si racirea lenta impreuna cu ARN.

Importanta

8
Fenomenul de denaturare-renaturare ADN, se poate utiliza in studiul relatiilor filogenetice dintre
specii sau in tehnologia ADN- recombinat.
Astfel s-a stabilit ca procentul de renaturare intre monocatene de ADN de la om si monocatene
ADN de la cimpanzeu este de 75%. Omul are in comun cu cimpanzeul 75% din ADN, cu
soarecele 25% si numai 5% cu pestii.

Hibridarea molecular poate fi utilizat pentru a aprecia gradul de similaritate n secvena


bazelor ntre ADN provenit de la dou organisme diferite.
Detectarea moleculelor hibride se poate face prin microscopie electronic deoarece regiunile dublu
catenare prezint un contur mai gros.
In tehnologia ADN recombinant, hibridarea moleculara ajuta la stabilirea exacta si rapida a
transferului unei gene eucariote in celula bacteriana (prin marcarea radioactiva a unei moncatene de
ADN sau ARN complementare segmentului genei eucariote transferate).
Studiul hibrizilor ADN-ARN a permis elucidarea unor aspecte legate de funciile acizilor nucleici,
de particularitile de structur ale genelor (de exemplu structura discontinu a genelor de la eucariote)
sau de localizarea unor gene la nivelul ADN (de exemplu a genelor pentru ARNr 28S, 18S, 5S).
Cercetrile efectuate asupra acestor hibrizi a demonstrat rolul de matri al ADN pentru sinteza
ARNm

Categoriile de tehnici de biologie molecular, bazate pe reacii de hibridare-amplificare:


reacia de amplificare (multiplicare) genic n lan mediat de ADN polimeraz sau de ADN
ligaz (Polimerase Chain Reaction -PCR),
hibridizrile ADN-ADN (de tip Southern)
Hibridizarile ARN-ADN (de tip Northern)