Sunteți pe pagina 1din 76

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA

VETERINARA BUCURESTI
FACULTATEA DE MEDICINA VETERINARA
MASTER - SPECIALIZAREA IGIENA SI CONTROLUL
ALIMENTELOR

LUCRARE DE DIZERTATIE

EVIDENTIEREA SPECIEI LISTERIA


MONOCYTOGENES IN UNELE PRODUSE
ALIMENTARE

CONDUCATOR STIINTIFIC:
Prof. Dr. BOGDAN TASBAC

ABSOLVENT:

Bucuresti
2007

CUPRINS
INTRODUCERE

CAPITOLUL 1. Genul Listeria. Specia Listeria


monocytogenes……………………………………………………7
1.1.Genul Listeria, specia Listeria monocytogenes…………….7
1.2.Taxonomie……………………………………………………..8
1.3.Morfologie……………………………………………………11
1.4.Conditii de cultivare si caractere culturale……………….12
1.5.Proprietati biochimice………………………………………15
1.6.Structura antigenica…………………………………………17
1.7.Ecologie………………………………………………………19
1.8.Patogenitate………………………………………………….21

CAPITOLUL 2. Listerioza umana de origine


alimentara………………………………………………………..31

2.1.Epidemii majore de listerioza umana de origine


alimentara…………………………………………………………31
2.2.Cazuri sporadice de listerioza umana de origine
alimentara…………………………………………………………37

CAPITOLUL 3. Metode de izolare, identificare si


determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes în
produsele alimentare de origine animala…………………..40

2
3.1.Metode bacteriologice………….………….………………40
3.1.1. Procedeul FDA ………………………………………..41
3.1.2. Procedeul USDA-FSIS…………………………..…….42
3.1.3. Procedeul USDA-NGFIS……………………..……….43
3.1.4. Metodologia de izolare utilizata în tara noastra ..…44
3.1.5. Detectarea celulelor bacteriene Listeria afectate de
diferiti factori stresanti la un nivel subletal …………….……46
3.2.Metode biochimice………………………..………………..50
3.3.Metode imunochimice……………………………..……....51
3.4.Metode imunofizice………………………….....………….52
3.4.1. Testul Imuno-Latex…………………………….…….…52
3.4.2. Flow-citometria …………………..…………….…..…..54
3.4.3. Imunocaptarea…………………………………..………54
3.5.Metode fizice………………………………………………..56
3.5.1. Impedansmetria………………………………………..56
3.6.Metode de biologie moleculara……………………….....56
3.6.1. Hibridarea cu sonde nucleare ……………….………..56

CAPITOLUL 4. Incidenta speciei Listeria monocytogenes în


UNELE PRODUSE ALIMENTARE............ ………………..58

CONCLUZII……………………………………………………..69
RECOMANDARI ……………………………………………….70

3
BIBLIOGRAFIE…………………………………………………72

INTRODUCERE

Listerioza este o maladie infectioasa, frecvent de origine alimentara,


comuna omului si numeroaselor specii de animale (în particular
rumegatoare), intalnita in special in tarile industializate.
Apare preferential la subiectii cu un sistem imunitar perturbat sau
imatur, adica, la femeile insarcinate, la nou nascuti, la persoanele in varsta
4
si la pacientii imunodeprimati ca urmare a unei afectiuni sau a unui
tratament imunosupresor. Aceasta infectie se traduce prin forme invazive :
bacteriemie/septicemie si infectii ale sistemului nervos central la noul
nascut si la adult iar la femeia insarcinata prin avort.
Incidenta este scazuta mai putin de 4 cazuri la un million de
locuitori in 2000, caracterizata printr-o mortalitate crescuta de 20-30% cu
exceptia femeilor insarcinate si 40% de cazuri raman cu sechele
neurologice. Mai recent in unele tari au fost descrise gastro-enterite
datorate speciei Listeria monocytogenes.
În unele tari ca Australia, listerioza este numita “boala învârtirii in
cerc” (circling disease).
Pentru prima data listerioza a fost decrisa la om în 1929 de catre
Nyfeldt. În tara noastra primul caz de listerioza la om a fost descris de
Rosca si col. în 1960, iar la animale primele cazuri au fost descrise în
perioada 1956-1958 la bovine, ovine, porci, boboci de rata si pastravi.
Boala este mai cunoscuta si mai studiata în SUA, Canada, Franta,
Germania si Elvetia, tari în care frecvent cauza este reprezentata de
alimente contaminate cu bacteria Listeria monocytogenes.
În perioada 1929-1950 numarul cazurilor de listerioza la om a fost
de 70, în perioada 1950-1972 numarul cazurilor de listerioza a crescut
ajungând la 5000.
O crestere semnificativa a incedentei acestei boli s-a realizat dupa
anul 1980, odata cu aparitia episoadelor de origine alimentara.

5
CAPITOLUL 1

GENUL LISTERIA. SPECIA LISTERIA


MONOCYTOGENES

1.1. GENUL LISTERIA


SPECIA LISTERIA MONOCYTOGENES

Descrierea pentru prima data a unei boli produsa de un bacil Gram-


pozitiv si care se presupune a fi fost listerioza s-a realizat în 1891. Totusi,

6
descrierea completa a Listeriei monocytogenes s-a realizat în lucrarile
publicate de Murray, Webb si Swann în anul 1926, cand inoculata
intravenos la iepuri a determinat cresterea monocitelor motiv pentru care a
fost denumita Bacterium monocytogenes. În 1927, Pirie publica cercetarile
sale facute în Africa de Sud cu privire la o epizootie la unele animale de
stepa, epizootie produsa de un bacil Gram-pozitiv, mobil care prin
inoculare la diverse animale de laborator determina focare necrotice
hepatice, numindu-l astfel Listeria hepatolytica. Prin compararea datelor
obtinute de Pirie, Murray si col. sai, agentului cauzal respectiv i s-a dat
numele de Listerella monocytogenes. În 1940 se propune de catre Pirie
schimbarea denumirii în Listeria monocytogenes, denumire valabila si
astazi.
Dupa ce a fost descrisa la om în 1929 de catre Nyfeldt, boala a fost
diagnosticata la mai multe specii de animale domestice cum ar fi: capra,
oaie, vaca, iepure de casa, cal, gaina, curcan, gâsca, la animale salbatice
ca: soarece, sobolan si iepure de câmp si la animale acvatice.

1.2.TAXONOMIE

Pozitia taxonomica a Listeria monocytogenes nu este înca precizata,


ea fiind inclusa în genul Listeria, gen care nu este încadrat pâna în prezent
într-o anumita familie. Genul Listeria face parte din grupa bacililor Gram-
pozitivi, asporogeni.
În acest gen sunt incluse 8 specii:
 Listeria monocytogenes

7
 Listeria ivanovii
 Listeria innocua
 Listeria welshimeri
 Listeria seeligeri
 Listeria grayi
 Listeria murrayi
 Listeria denitrificans.
Comitetul International de Sistematica Bacteriana-Subcomitetul de
Taxonomie pentru Listeria, în 1992, la Copenhaga, a stabilit pentru genul
Listeria 6 specii si 2 subspecii:
 Listeria monocytogenes
 Listeria innocua
 Listeria ivanovii cu doua subspecii:-ivanovii
-londoniensis
 Listeria seeligeri
 Listeria welshimeri
 Listeria grayi.
În editia a-9-a din 1994 a “Bergey’s Manual of Determinated
Bacteriology”, sunt incluse 7 specii:
 Listeria monocytogenes
 Listeria innocua
 Listeria ivanovii
 Listeria seeligeri
 Listeria welshimeri
 Listeria grayi

8
 Listeria murrayi.
În prezent Listeria denitrificans a fost exclusa din acest gen si
reclasificata ca Jonesia denitrificans, iar Listeria grayi si Listeria
murrayi pe baza studiilor de hibridare ADN/ARN facute de Stuart si
Welshimer în 1974, sunt suficient de distincte de Listeria monocytogenes,
pentru a forma un gen separat “Murraya” cu doua subspecii:

 Murraya grayi subsp.grayi

 Murraya grayi subsp.murrayi.


Unii specialisti considera ca genul Listeria este format din 4 specii,
Listeria monocytogenes fiind considerata ca un un grup heterogen care
contine tulpini patogene dar si apatogene. Asa, Listeria innocua este
considerata varianta nehemolitica si apatogena a Listeriei monocytogenes,
iar Listeria seeligeri si Listeria welshimeri au fost scoase un timp din genul
Listeria ca fiind apatogene, dar recent s-a demonstrat ca Listeria seeligeri
poate determina meningita purulenta chiar si la persoanele
imunocompetente.
Criteriile pe baza carora sunt diferentiate diferitele specii din genul
Listeria sunt prezentate in tabelul 1.

9
TABEL 1
Caracterizarea speciilor din genul Listeria
CARACTER L. L. L. L. L. L. L.
MONOCYTOGENES IVANOVII SEELIGERI INNOCUA WELSHIMERI GRAYI MURRAYI
Beta hemoliza + + + - - - -
C.A.M.P. + - + - - - -
S.aureus
R. equi
- + - - - - -
Fermentarea - - - - - + +
Manitolului
Fermentarea - + + - - - -
Xilozei
Fermentarea - - - +/- +/- - D
Ramnozei
Patogenitate- DA extrem de extrem de NU NU NU NU
om rar rar
D=diferit

10
1.3. MORFOLOGIE

Listeria monocytogenes se prezinta sub forma de bacili scurti, sau

cocobacili, cu dimensiuni cuprinse între 0,5 – 2 lungime si 0,4 – 0,6


diametrul transversal. Se pot întâlni si forme cocoide (0,4 – 0,6/0,4-

0,5), în frotiurile din tesuturi sau din cultura în mediu lichid, însa rar
întâlnite în frotiurile din cultura de pe mediul solid. În frotiurile din culturi

vechi sau de tip R se întâlnesc forme filamentoase de 6-20, sau chiar mai
mari.
Desi se pot întâlni lanturi scurte, grupari în V sau în Y, sau în
palisada, bacteria nu prezinta un mod specific de grupare.
Nesporogen, necapsulogen, desi Smith and Metzger (1962) (citati
de Bergey) au raportat prezenta unei capsule la Listeria monocytogenes.
Nu s-au mai înregistrat astfel de observatii, iar studiile exhaustive efectuate
de Seeliger si Backemuhl (1968) si de alti autori nu au evidentiat existenta
unei capsule.
Listeria monocytogenes este o bacterie mobila, dotata cu un aparat
ciliar variabil în functie de conditiile de cultivare.
Aprecierea mobilitatii se realizeaza în conditii optime la temperatura

de incubare de 20-25oC. La aceasta temperatura, bacteria executa miscari


de rostogolire, alternând cu perioade de repaus. Prin studii de microscopie
electronica si coloratii speciale s-a evidentiat un aparat ciliar sarac,

alcatuit din 1, 2, 3, 4 si foarte rar peste 5 flageli dispusi peritrih. La 4oC

ca si la 37oC, bacteria este imobila (aflagelata sau rar cu un singur flagel).

11
Referitor la afinitatea tinctoriala, Listeria monocytogenes este Gram
pozitiva, însa datorita sensibilitatii la decolorarea cu alcool–acetona sau
alcool etilic (mai ales germenii din culturile vechi) este definita Gram
labila.
În cazul cultivarii bacteriei pe medii ce contin penicilina sau glicina
se pot întâlni forme L, dar nu s-a stabilit înca daca acestea sunt sau nu,
forme L adevarate. Pentru aceste forme s-a sugerat ideea ca ar juca un rol
important în procesul infectios ca si formele granulare.

1.4. CONDITII DE CULTIVARE SI CARACTERE


CULTURALE

Listeria monocytogenes este o bacterie aeroba sau microaerofila,

care se multiplica între limite largi de temperatura (-2-45 oC), dar

temperatura optima de dezvoltare este cuprinsa între 30-37oC. Dupa unii

cercetatori multiplicarea ar începe la 0,1oC. În culturile initiale din tesuturi


sau produse alimentare cu flora mixta, dezvoltarea bacteriei este stimulata

de temperaturi scazute (4oC), dupa o faza de lag variabila de 5-6 zile pâna
la 6 luni.
Bacteria se dezvolta la valori ale pH-ului cuprinse între 5,6-9,6 însa
prefera un pH neutru sau slab alcalin (7,2-7,6) dar se poate dezvolta si in
medii de hiperosmolaritate, toate acestea explica prezenta ei in apele
menajere si ubicvitatea in mediu.
pH-ul minim pentru initierea multiplicarii variaza între 5,0 si 5,7 la

4C si între 4,5 si 5,2 la 30C si nu se dezvolta la pH 4,0 sau mai scazut.

12
Se dezvolta bine pe medii uzuale de cultura, însa izolarea este
dificila si necesita prezenta unor factori stimulatori : aminoacizi (arginina,
histidina, metionina, triptofan), glucide, vitamine, acizi grasi si saruri
minerale.
Dintre acizii (acid acetic, acid lactic, acid citric, acid clorhidric)
utilizati pentru scaderea pH-ului mediului de cultura, cel mai eficace
inhibitor al cresterii a fost acidul acetic.
Studii efectuate recent de cercetatorii din Laboratorul de
Microbiologie Alimentara al Universitatii din Elvetia, pe 3 tulpini de
Listeria monocytogenes izolate din alimente, au servit pentru evaluarea
raspunsului acestor tulpini la salinitate într-un mediu chimic denumit mediu
minimal (MM) [34].
În acest mediu minimal, continând 5 aminoacizi esentiali si glucoza
(ca sursa de C si energie) dezvoltarea bacteriei a fost comparata cu
cresterea într-un mediu complet (bulion cord-creier). În prezenta sau
absenta a 3% NaCl, numarul final de celule bacteriene în mediul minimal
a fost de 109 si respectiv 107 UFC/ml.
Dupa suplimentarea mediului cu prolina (10 mM), betaina
(trimetilglicina) – 1 mM si carnitina 1 mM (-hidroxi-N
trimetilaminobutirat) a fost stimulata semnificativ cresterea în conditii de
stress osmotic în mediul minimal, atât la 37C, cât si la 10C. Carnitina si
betaina sunt prezente în alimentele vegetale si animale. Acesti compusi pot
contribui semnificativ la dezvoltarea celulelor de Listeria monocytogenes
în diferite tipuri de alimente la osmolaritati mari.
Celulele de Listeria monocytogenes care s-au dezvoltat în prezenta
a 7,5% NaCl contin concentratii mai mari de K+, betaina, glicina, alanina si
prolina decât celulele crescute în absenta NaCl. Adaptarea acestei bacterii
la concentratii mari ale unor solutii extracelulare este în general însotita de

13
acumularea intracelulara a ionilor de K+, compusi organici, carbohidrati
etc., ceea ce sugereaza ca Listeria monocytogenes se poate adapta usor,
conditiilor de stress osmotic.
Caractere culturale: în bulion, dupa 18-24h de incubare la 37oC,
bacteria produce o turbiditate slaba sau moderata, uniforma. În culturile
vechi formeaza un depozit mic, granular. Pe agar se dezvolta sub forma de
colonii mici 0,5-1,5mm diametru, rotunde, transparente, convexe cu
margini regulate, de tip S. Examinate cu lupa sau în lumina oblica,
coloniile prezinta o coloratie albastruie-verzuie. Dupa câteva zile, coloniile
devin mai mari, albe-cenusii, usor bombate, cu tendinta de disociere.
Pe agarul cu sânge defibrinat (de oaie, bou, cal, iepure sau om),
Listeria monocytogenes produce o zona de beta-hemoliza care uneori nu
depaseste marginile coloniei si poate fi observata dupa înlaturarea coloniei.
Reactiile de hemoliza neconcludente vor fi examinate prin testul CAMP,
pentru potentarea activitatii hemolitice de catre beta-hemolizina produsa
de Staphylococcus aureus. Listeria ivanovii îsi intensifica activitatea
hemolitica fata de Rhodococcus equi.
Cultivarea la 4ºC pe bulion imbogatit si nonselectiv a fost utilizata
vreme indelungata (Gray) dar erau nevoie de 8 saptamani de cultura si
necesita efectuarea de subculturi in fiecare saptamana. Aceste culturi pot fi
efectuate pe geloza cu sange, dar exista riscul ca alti contaminanti se
puteau dezvolta in acelasi timp.
Studii efectuate de Fernandez-Gaoyzabal si col., au aratat ca
98,4% din tulpinile de Listeria monocytogenes studiate au prezentat o
reactie de hemoliza sinergica si cu Rhodococcus equi. Pe baza acestor
observatii autorii sustin ca ambele specii (Listeria ivanovii si Listeria

14
monocytogenes) ar trebui considerate CAMP pozitive, fata de
Rhodococcus equi [16, 45]. Acestea sunt si concluziile noastre privind
comportarea acestei specii bacteriene fata de Rhodococcus equi în testul
CAMP.

Fig.1. Aspectul de umbrela deschisa a culturii de Listeria monocytogenes


în agar moale incubare la temperatura laboratorului(Dupa Dobrea2002)

În situatia însamântarii bacteriei prin întepare în mediile semisolide


(agarul moale 0,5%), cultura are aspectul unei umbrele (Fig. 1), ceea ce
demonstreaza o mobilitate marcata cînd incubarea are loc la temperatura

laboratorului (18-20oC).

1.5. PROPRIETATI BIOCHIMICE


Capacitatea fermentativa a speciei Listeria monocytogenes fata de
glucide si polialcooli este variabila, iar datele din literatura care privesc
acest aspect sunt contradictorii.

15
Bergey sustine ca toate tulpinile de Listeria monocytogenes
fermenteaza cu producere de acid, dar nu si de gaz glucoza si L-ramnoza
si variabil în functie de tulpina, galactoza, lactoza , sorbitolul si esculina
(Tabel 2).
TABEL 2
Caractere diferentiale între speciile din genul Listeria (dupa Bergey)
CARACTER L. L. L. L. L. L. L.
Monocytogenes ivanovii seeligheri innocua welshimeri grayi murrayi
Beta hemoliza + + + - - - -
CAMP S.aureus + - + - - - -
R.equi - + - - - - -
Fermentare - - - - - - -
L-arabinoza
Dextroza + - - + +
Galactoza d d - + +
Lactoza d + + + +
Manitol - - - - - + +
Melibioza - - - - - - -
Α-metil D glucozida + + + + +
Α-metil D manozida + - - + +
L-ramnoza + - - d d - d
Sorbitol d - - - - - -
Amidon solubil - - - + +
Sucroza - d d - -
D-xiloza - + + - + - -
Voges Proskauer + + + + + + +
Hidroliza celulozei - - - - - - -
Lecitinaza d + d - -
Fosfataza + + + + +
Reducerea nitratilor - - - - +
Patogenitate-soarece + + - - - - -

16
Listeria monocytogenes nu produce indol, este hemolitica, nu
produce hidrogen sulfurat, nu hidrolizeaza ureea, nu reduce nitratii în nitriti
si nu lichefiaza gelatina. Germenul este catalaza pozitiv, reactiile Voges-
Proskauer si rosu metil sunt pozitive. De asemenea, decoloreaza laptele
turnesolat fara sa-l acidifice.

1.6. STRUCTURA ANTIGENICA

Examinarea prin microscopie electronica a peretelui celular a


demonstrat ca acesta are o structura tipica bacteriilor Gram +, o structura
omogena densa care înconjoara membrana citoplasmatica, alcatuita din
35% peptidoglican, care contine acid mezo-diaminopimelic. Acizii
teichoici sunt legati covalent de situsurile specifice ale peptidoglicanului.
Acestia contin glicerol sau ribitol, glucide neutre, N-acetil-aminoglucide si
fosfati. Serotipurile de Listeria poseda doua tipuri de acizi teichoici. Primul
este alcatuit din reziduuri ribitol legate covalent de lanturile fosfodiester
între C1 si C5, substituite uneori de N-acetilglucozamina la C2. Acest tip
este asociat cu serotipurile 1/2a, b si c; 3a, b si c si 7. La cel de al doilea
tip, N-acetil glucozamina este integrata într-un lant si este asociata cu
serotipurile 4a, b si d.
În structura chimica a peretelui celular la Listeria au fost evidentiati
si acizi lipoteichoici, la care unele glicolipide, cum ar fi galactozil-
glucozil-diglicerida, sunt legate covalent de un fosfomonoester terminal al
acidului teichoic. Aceasta regiune lipidica ancoreaza lantul polimeric de
membrana citoplasmatica. Acizii teichoici sunt similari lipozaharidelor

17
bacteriilor Gram -, atât din punct de vedere structural cât si functional,
reprezentând polimeri amfipatici ai suprafetei celulare.
Prima clasificare a serovarurilor de Listeria monocytogenes, a fost
realizata de Paterson în 1940, care a propus 4 serotipuri în functie de
proportiile dintre cele 5 fractiuni antigenice somatice (I-V) si 4 fractiuni
antigenice flagelare (A-D). Ulterior aceasta clasificare a fost completata de
Seeliger (1958) si Donker-Voet (1972) , [19] .
O revizuire a structurii antigenice a genului Listeria, a fost efectuata
de Garcia în anul 1990 care a evidentiat factorul IX la unele tulpini din
cadrul serovarului 4b. Actuala clasificare include 17 serovaruri în cadrul
genului Listeria, dintre care 13 apartin speciei Listeria monocytogenes.
(Tabelul 3). Exista diferente între distribuirea geografica a serovarurilor de
Listeria monocytogenes. Studiile serologice au relevat faptul ca tulpinile
umane apartin în general serovarurilor ½a, ½b si 4b. În vestul Europei
predomina serovarul 4b, pe când în Europa de Est, se întâlnesc mai
frecvent serovarurile ½a si ½b . În Canada si SUA se întîlnesc toate aceste
serovaruri : ½a, ½b si 4b .
Dupa unii autori exista o corelatie epidemiologica între listerioza
perinatala si serovarurile ½a, 3b si 4b.

18
TABEL 3
Serovarurile din cadrul speciei Listeria monocytogenes
Denumirea
Paterson ANTIGENE O ANTIGENE H

Seeligher
Donker- Voet
1 ½a I II (III) A B
½b I II (III) A B C
2 ½c I II (III) B D
3 IV A B C
3a II (III)
IV XII XIII
3b II (III) A B D
IV XII XIII
3c II (III) B C
V VII IX
4 A B C
4a II (III)
V VI VII IX X
4ab (III) A B C
V VI
4b* (III) A B C
V VII
4c (III) VIII A B C
V VI
4d (III) VIII A B C
VI IX
V
4
e
(III) VIII XII XIII A B C
7
III A B

4b * - (Mc Lauchlin 1989) (III) V VI VII .

1.7. ECOLOGIE
Listeria monocytogenes se gaseste sub forma saprofita în sol, apa si
pe plante, mai ales în cele în stare de descompunere.

19
Examenul bacteriologic de contaminare al suprafetelor din spatiile
tehnologice demonstreaza existenta speciei Listeriei monocytogenes. În
urma acestui studiu, 71% dintre utilaje, 83% dintre pardoseli si 100%
dintre benzile transportoare au fost contaminate cu Listeria monocytogenes
(Tabel 4).

TABEL 4
Incidenta speciei Listeria monocytogenes la nivelul
spatiilor tehnologice

Suprafata Bacteria cautata Procentul de Referinta


esantioane pozitive
Mâini Listeria 7% Kerr si col.(1993)
lucratori monocytogenes
Utilaje Listeria 71% Van der Elzen si
monocytogenes Snijders (1993)
Pardoseli Listeria 83% Van der Elzen si
monocytogenes Snijders (1993)
Benzi Listeria 100% Van der Elzen si
transportoare monocytogenes Snijders (1993)
Pardoseli Listeria Sammarco si col.
camere monocytogenes 13,3% (1997)
frigorifice
Chiuvete Listeria 7,1% Sammarco si col.
monocytogenes (1997)

Germenul s-a izolat la 21% din 779 probele de sol si plante.


Utilizarea gunoiului de grajd ca îngrasamânt natural, reprezinta un
potential pericol pentru declansarea unor epidemii de listerioza umana.

20
Listeria monocytogenes s-a evidentiat la nivelul mucoasei
nasofaringiene si în fecale la oameni sanatosi. Într-un studiu efectuat de
Bojsen-Moller, germenul a fost evidentiat la 4,8% din lucratorii dintr-un
abator (55 din 1147) 1,2% din pacientii internati într-un spital pentru alte
afectiuni decât listerioza (12 din 1034) si la 26% din persoanele care au
fost în contact cu bolnavi de listerioza (9 din 34), iar dupa Rolavich
(1984), 91,7% (11 din 12) din personalul unui laborator erau purtatori.
Dupa unii autori 5-10% din populatie poate fi purtatoare de Listeria
monocytogenes .
Pentru a determina durata eliminarii bacteriei prin fecale a fost
efectuat un studiu care a relevat faptul ca din 12 persoane tinute sub
observatie timp de 16 luni, 11 au eliminat bacteria dupa cum urmeaza: una
timp de 6 luni, una timp de 4 luni, trei timp de 3 luni, patru timp de 2 luni,
si 2 timp de o luna. Totusi nici una nu a eliminat acelasi serotip.
Listeria a fost izolata de la 37 specii de mamifere si 17 specii de
pasari. Rozatoarele având rol de rezervor natural, contribuind la
mentinerea si vehicularea germenilor.
Unii cercetatori au aratat ca ovinele reprezinta un important rezervor
de Listeria în natura. Rata de portaj la animale în general, este considerata
a fi de 1-5%, desi în Spania, 88% din oile testate au fost purtatoare de
Listeria.

1.8. PATOGENITATE

Patogenitatea speciei Listeriea monocytogenes este data de:


capacitatea bacteriei de multiplicare intracelulara, fosfolipaza C

21
fosfatidilinozitol specifica, lecitinaza, catalaza, superoxid dismutaza,
proteina p60, factorul producator de monocitoza MPA (monocytosis
producing agent), proteina Ami aflata la suprafata celulei bacteriene cu
actiune bacteriolitica fata de alte bacterii Gram pozitive si nu în ultimul
rând, hemolizina LLO (listeriolizina O).
Listeria monocytogenes este o bacterie intracelulara facultativa. Poarta de
intrare este digestiva (alimente contaminate) la nivelul intestinului
bacteriile ocupa ganglionii limfatici regionali si apoi circulatia sanguina.
Monocitele se deplaseaza si elibereaza in circulatie bacteriile care se
multiplica la nivelul ficatului si splinei . In majoritatea cazurilor sistemul
imunitar controleza infectia la subiectii imunocompetenti care vor face o
infectie inaparenta. In acelasi timp daca invazia este masiva sau subiectii
sunt fragilizati, infectia nu poate fi controlata la nivel intestinal, in splina
sau in ficat, lasand descoperite placenta si sistemul nervos central. La
femeile insarcinate, cu precadere dupa a cincea luna, bacteriile colonizeaza
placenta cu formarea de numeroase granuloame inflamatorii, care apoi vor
determina corioamniotita si infectia fatului in utero (90% din cazuri).
Ocazional fatul poate fi contaminat la nastere (<10% din cazuri).
Multiplicarea se realizeaza intracelular în celulele organismului
gazda si în figura 2 se pot observa stadiile patrunderii bacteriei în celula,
multiplicarii intracelulare si trecerii bacteriei de la o celula la alta (dupa
Portnoy 1992) [51].
Celulele endoteliale umane se pot infecta cu Listeria monocytogenes
prin doua mecanisme distincte:
- prin intermediul fagocitelor;
- prin invazie directa, prin inducerea propriei endocitoze, fenomen numit
,, endocitoza dirijata de parazit”.
Trecerea bacteriei de la o celula la alta este asigurata de actiunea
concertata a unui complex de factori:

22
 cuplarea unui glucid de la suprafata celulei bacteriene cu un receptor
pentru galactoza de pe suprafata celulei eucariote;
 internalina cu 2 componente:
-internalina A- proteina care contine aproximativ 800 aminoacizi, cu
o greutate moleculara de 88 KDa.
-internalina B- alcatuita din 630 aminoacizi, cu o greutate
moleculara de 65 Kda.
Maxima exprimare a internalinelor se realizeaza la 37 oC în faza de
crestere exponentiala. Infectarea experimentala a unor culturi celulare cu
mutante deficitare pentru inl A sau inl B( genele care codifica internalinele
A si B), au evidentiat faptul ca ambele internaline sunt necesare pentu
invazia celulei gazda.
 proteina p60- o proteina de 60 Kda, alcatuita din 484 aminoacizi
care este codificata de gena iap. Formele R sintetizeaza cantitati reduse de
proteina p60 si astfel capacitatea invaziva a acestora este diminuata.
Mai mult se formeaza lanturi lungi ca o consecinta a unei separari
incomplete ale celulelor bacteriene dupa diviziune .
Mutantele lipsite de aceasta proteina, pierd capacitatea de a invada
fibroblastele si formeaza lanturi lungi de celule bacteriene. Dupa incubarea
bacteriilor cu proteina p60 la 37oC, celulele se separa si îsi recapata
invazivitatea .
Hemolizina (listeriolizina O) este necesara pentru supravietuirea
intracelulara a bacteriei, desi nu este implicata în procesul de patrundere a
bacteriei în celula gazda. Absenta listeriolizinei O la mutantele
nehemolitice nu a influentat procesul de invadare a macrofagelor
peritoneale, însa supravietuirea ulterioara a germenilor a fost redusa în
mod semnificativ. Mutantele Hly- au fost avirulente pentru soarece
comparativ cu tulpina parentala.

23
Hemolizina are o activitate citolitica maxim exprimata la pH 5,5 si
în medii lipsite de fier. Aceste conditii sunt asigurate în interiorul
fagozomilor, de aceea sinteza de hemolizina este maxima si asigura
distrugerea membranei vacuolare.
Listeriolizina O este o citolizina sulfhidril (SH)-activata si manifesta
proprietati similare altor proteine din acest grup ( streptolizina O,
pneumolizina, enzime cu care este înrudita antigenic).
Putem caracteriza listeriolizina O astfel: este o proteina cu masa
moleculara de 58 000 D, activata prin gruparea SH, inhibata de colesterol
si agentii oxidanti si reactioneaza încrucisat cu anticorpii anti SLO
(streptolizina O).

Fig. 2 - Stadiile morfologice ale patrunderii, multiplicarii si trecerii de la


o celula la alta la Listeria monocytogenes:
1. internalizarea;
2. liza vacuolei;

24
3. încapsularea în fibre de actina;
4. multiplicarea;
5. reorganizarea actinei sub forma unei cozi care mediaza mobilitatea
bacteriei în citoplasma;
6. migrarea intracitoplasmatica si asocierea cu membrana celulara sub
forma unui pseudopod;
7. internalizarea bacteriei în celula vecina, în acest stadiu bacteria este
înconjurata de o dubla membrana;
8. solubilizarea membranei interne;
9. solubilizarea membranei externe.
Listeria ivanovii si Listeria seligheri sintetizeaza si o exotoxina
thiol-dependenta, însa la un nivel de 10 ori mai scazut decât Listeria
monocytogenes.
Listeriolizina O difera totusi de alte toxine bacteriene (streptolizina
O, pneumolizina, perfringolizina, alveolizina),prin faptul ca pH-ul optim al
LLO este 5,5 fiind inactivata la pH 7,0 si redevine activa prin scaderea
pH-ului la valoarea 5,5. Optimizarea activitatii litice în conditii de mediu
acid (similare cu cele din interiorul macrofagelor), asigura multiplicarea
intracelulara a bacteriei .
Exista tulpini de Listeria monocytogenes ce sintetizeaza o a doua
hemolizina, distincta din punct de vedere imunologic de listeriolizina O.
LLO a fost numita - listeriolizina, iar cealalta (alte) hemolizina, -
hemolizina. Doua tipuri de hemolizine au fost identificate la clonele
obtinute prin transferul unei gene de Listeria monocytogenes la E.coli.
Prima, o proteina de 23 000D, probabil factorul CAMP, care nu a fost SH-
activata, si nu a reactionat încrucisat cu anticorpii anti-LLO sau anti-SLO.
Cealalta, a reactionat încrucisat cu anticorpii anti-SLO, însa activarea prin
gruparea SH- nu a fost testata [23].

25
Eliberarea bacteriei din vacuola fagocitara se realizeaza cu ajutorul
listeriolizinei O, alaturi de fosfolipazele C si o metaloproteaza.
Listeria monocytogenes sintetizeaza 2 tipuri de fosfolipaze C (PLC):
 PI-PLC (fosfolipaza C fosfatidil-inozitol specifica, codificata de
gena plc A
 PC-PLC (fosfolipaza C fosfatidil -colin specifica care reprezinta
lecitinaza C si este codificata de gena plc B (Fig 3). În maturarea
functionala a acestei enzimei este implicata o zinc metaloproteaza, cu
masa moleculara de 29 Kd, dintr-o proenzima cu masa moleculara de 33
Kd. Tulpinile care au suferit mutatii la nivelul genei mpl, care codifica
sinteza metaloproteazei, sunt apatogene.
Existenta intracelulara a speciei Listeria monocytogenes este
asigurata de listeriolizina O alaturi de alte mecanisme. Rezistenta bacteriei
la actiunea agentilor oxidanti, produsi de fagocite, este asociata cu
producerea superoxid-dismutazei (SOD) si catalazei de catre aceasta
specie bacteriana. Bartolussi (1987) a demonstrat ca rezistenta bacteriei la
radicalii hidroxil (-OH), în timpul fazei de lag este datorata producerii unei
cantitati suficiente de catalaza. Însa tulpinile de Listeria monocytogenes
catalaza negative au prezentat activitatea SOD cu cel putin 100% mai
mare decât tulpinile catalaza pozitive.
Ajunsa în citoplasma celulei gazda bacteria începe sa se multiplice.
Datorita pH-ului crescut si prezentei ionilor de fier, listeriolizina O este
inactivata. Proteina bacteriana de suprafata, Act A (90 000 Kd) determina
acumularea de actina proprie celulei gazda în jurul bacteriei. Prin utilizarea
cloramfenicolului, inhibitor al sintezei proteice, s-a demonstrat ca
substanta care induce asamblarea actinei este proprie bacteriei (Act A).
Mutantele lipsite de Act A nu sunt capabile sa acumuleze actina, iar
virulenta lor este puternic afectata [23]. Dupa aproximativ 2,5 h,
localizarea filamentelor de actina se modifica, concentrându-se spre una

26
din extremitatile bacteriei, formând o prelungire de pâna la 40 (Fig. 3).
Asamblarea monomerilor de actina se realizeaza la nivelul interfetei retelei
de actina cu celula bacteriana, asigurând astfel propulsarea celulei
bacteriene înainte. Videomicroscopia a permis observarea corelatiei dintre
deplasarea bacteriei si asamblarea actinei. Viteza de deplasare este de
pâna la 1,4m/sec.
Legarea filamentelor de -actina între ele se face prin punti
orizontale de actina, iar tropomiozina este dispusa helicoidal pe lungimea
filamentelor.

Fig. 3 - Asamblarea monomerilor de actina

Asamblarea actinei este inhibata de cytochalazin D (substanta care


inhiba functia microfilamentelor), astfel deplasarea bacteriei este oprita
brusc. Desi polimerizarea actinei se produce, totusi mutantele avirulente de
Listeria monocytogenes nu se deplaseaza intracelular, deoarece aceasta nu
este reorganizata polar .
Bacteriile sunt incluse în structuri ,,pseudopod-like” si astfel în
interiorul citoplasmei celulei vecine, bacteria este înconjurata de o dubla
membrana. Ambele membrane sunt solubilizate si ciclul se reia. În aceste
conditii, bacteria difuzeaza de la o celula la alta, fara sa paraseasca
citoplasma, ceea ce ar putea explica imunitatea mediata celular, din
listerioza si faptul ca anticorpii sunt neprotectivi [23].

27
Mutante auxotrofe de Listeria monocytogenes obtinute prin insertie
de transposoni, necesita în timpul cultivarii pe culturi celulare prezenta
uracilului, fenilalaninei, glicinei, prolinei sau acidului nicotinic pentru
crestere [40,42].
Când celulele gazda au fost lipsite de aminoacizii necesari, bacteria
a continuat sa se dezvolte intracelular, ceea ce sugereaza faptul ca celula
eucariota functioneaza ca un mediu bogat care asigura exigentele nutritive
ale bacteriei care o paraziteaza. Deci bacteria poate utiliza peptidele
intracelulare ca sursa de aminoacizi.
MPA ( monocytosis producing agent) induce monocitoza ajungând
la 30% din leucocite la 4 zile de la infectia experimentala, la iepure. Acest
factor este de natura lipidica, solubil în solventi organici. Activitatea sa
este corelata cu virulenta bacteriei: este prezent în cantitati mari la tulpinile
virulente recent izolate, apoi scade odata cu diminuarea virulentei
tulpinilor, prin pasaje pe medii de cultura si poate fi restabilita prin
inoculare la animale.
Operonul virulentei este represat în timpul existentei bacteriei în
mediul înconjurator si dupa ingerarea germenilor odata cu alimentele
contaminate, operonul este derepresat si bacteria este capabila sa
penetreze mucoasa intestinala.
Un rol în instalarea bolii îl are susceptibilitatea gazdei, cât si
cantitatea de inoculum.
Referitor la sensibilitatea gazdei fata de Listeria monocytogenes
aceasta depinde de statusul imunitatii celulare al acesteia. Majoritatea
cazurilor de listerioza umana se întâlnesc la persoanele imunocompromise
datorita unor boli (SIDA, neoplasme, boli hematologice maligne), în timpul
sarcinii, la nou-nascuti, persoanele în vârsta, tratamente cu cortizon sau
citostatice, la persoanele cu transplant renal si la alcoolici.

28
Prf A

Operon prf A- Operon lecitinaza


plc A

<----------- <------------ ---------> ---------> -----------> ----------->


prfA plc A hly mpl act A plc B
Fig.4 - Reprezentarea locusului virulentei la Listeria monocytogenes
(Dupa Portnoy 1992) .
operon prf A-plc A= prf A codifica un factor reglator pozitiv
=plc A codifica -fosfolipaza C-inozitol specifica
operon lecitinaza =mpl codifica metaloproteaza
=act A codifica Act A ( nucleator de actina)
=plc B codifica fosfolipaza C-colin specifica
(lecitinaza)

Sensibilitatea gazdei influenteaza cantitatea de inoculum necesara


pentru declansarea bolii. DL50 pentru soarece a fost semnificativ scazuta
în urma administrarii acetatului de hidrocortizon. Unii autori afirma ca
boala poate fi declansata la indivizii imunocompetenti dupa ingerarea unei
doze de 106-109 germeni, probabil pentru indivizii imunocompromisi doza
ar fi mai mica [44].

29
CAPITOLUL 2

LISTERIOZA UMANĂ DE ORIGINE ALIMENTARĂ

2.1. EPIDEMII MAJORE DE LISTERIOZA UMANA DE

30
ORIGINE ALIMENTARA

Infectiile umane cu Listeria monocytogenes au fost diagnosticate in


1960 iar in 1981 au fost obseravte primele cresteri ale listeriozei care
demonstreaza ca bacteria responsabila de aceasta maladie putea fi
transmisa prin diverse alimente in plus fata de mijloacele obisnuite de
transmisie. CDC estimeaza 1850 cazuri de toxiinfectii alimentare cauzate
anual in Statele Unite ale Americii din care 425 cazuri mortale (23%).
În tarile industrializate este de notat o puternica scadere a incidentei
listeriozei. În Statele Unite ale Americii numarul cazurilor de listerioza a
trecut de la 7,7 cazuri /milion de locuitori în 1990 la 4,7 cazuri/milion
locuitori în 1997. În Scandinavia, numarul cazurilor de listerioza este de
5,1 cazuri/milion locuitori în 1997 (3 cazuri în Suedia si 6,3 cazuri în
Danemarka si Finlanda). În Franta numarul cazurilor de listerioza a trecut
de la 20 cazuri/milion locuitori în 1986 la 4 cazuri/milion în 1996.
Totusi de-a lungul timpului în lume au existat importante epidemii
de listerioza care vor fi prezentate în tabelul 5.
În 1979, la Boston, Massachusetts, au fost înregistrate 23 cazuri de
listerioza umana într-un spital. Sursa de infectie au reprezentat-o
alimentele din spital, mai exact diferite legume: ridichi, laptuci. La 20 din
cele 23 cazuri s-a identificat serotipul 4b. Boala a evoluat septicemic sau
sub forma de meningite. 50% din pacienti au prezentat imunosupresie
datorata corticoterapiei sau altii sufereau de cancer, iar 60% au afirmat ca
au folosit cimetidine sau antacid ca medicatie contra ulcerului. Cimetidina
este un antihistaminic care blocheaza efectorii H2 ai histaminei si

31
determina scaderea secretiei de acid gastric în timp ce antacid-ul
neutralizeaza aciditatea gastrica. Astfel, s-a presupus ca neutralizarea
aciditatii gastrice a crescut posibilitatile de contactare a bolii.

TABEL 5
Principalele epidemii de listerioza de origine alimentara
Data Localitatea Simptome Rata Sursa Serotip Factor de risc
mortalitatii
1979 Boston meningite 23(15%) ridichi, laptuci 4b cimetidina

32
1981 Canada meningite, avort, 41(41%) varza 4b nu
septicemii
1983 Boston meningite 49(29%) lapte pasteurizat 4b cancer,alcool,cort
izon
1985 Orange febra, voma 142(33%) brânza 4b sarcina(94),
Country SIDA,cancer

1983- Vand meningo- 122(28%) Pate de ficat 4b diabet, SIDA,


1987 Elvetia encefalite cancer, cortizon
1985- Anglia Limba de porc 4b
1989
1989 USA 10 creveti
1990 Australia 9 pate
1992 Noua 2 Scoici afumate
Zeelanda
1992- Franta 38 carne tocata de porc
1993
1994- Suedia 9 pastrav
1995
1995 Franta 36 carne tocata cruda

1997 Franta 14 brânza pasta moale

1998 Italia gastro-enterita 1594(0%) 4b sarcina

1998 Franta 3 carne tocata de porc nu

1998- USA 101 hot dog 4b


1999
1999 Finlanda 18 unt
1999 Franta 23 carne tocata si prajita
1999- Franta 32 limba de porc în aspic
2000

În Canada, în anul 1981, s-a înregistrat un episod de listerioza


umana datorat consumului de salata de varza. Varza provenea dintr-o
ferma unde evoluase listerioza la oi si balegarul de la oile infectate a fost
suspectat ca vector al transmiterii infectiei. În acest episod s-au semnalat
34 cazuri de listerioza la femei însarcinate care au prezentat avorturi
spontane, nasteri de copii morti sau vii, dar neviabili si 7 cazuri la adulti,
33
cu pneumonii, meningite sau septicemii. Rata mortalitatii a fost de 41%.
Serotipul izolat de la bolnavi a fost 4b si a coincis cu cel detectat în
pachetele de salata de varza nedesfacute [36].
Un alt episod de listerioza a fost din nou semnalat în Massachusetts,
în 1983. Evidenta epidemiologica a relevat faptul ca sursa de contaminare
a reprezentat-o laptele (integral sau 2%), pasteurizat. 49 persoane au fost
implicate în acest episod, dintre care 42 sufereau de cancer sau alcoolism,
iar unii urmau corticoterapie. Rata mortalitatii a fost 29%, iar din cele 49
de tulpini izolate, 32 au fost identificate ca serotip 4b.
Consumul de brânza a fost incriminat în 2 episoade majore de
listerioza.
Primul episod s-a desfasurat în perioada 1 ianuarie-15 august 1985,
în Orange Country California si au fost înregistrate 142 cazuri. Dintre cele
142 persoane, 93 au fost femei (spaniole) însarcinate sau copiii lor
(65,5%), iar 49 au fost adulti. Rata mortalitatii a fost de 33% . Sursa de
contaminare a constituit-o brânza, sortimentele: Queso Fresco si Cotija
Mexican Style, preparata din lapte crud în amestec cu lapte pasteurizat, iar
instalatia în care s-a preparat brânza s-a dovedit a fi contaminata cu
Listeria monocytogenes. Serotipul izolat de la pacienti a fost 4b si a
coincis cu cel izolat din pachetele de brânza, nedesfacute [36].
Al doilea episod de listerioza umana determinat de consumul de
brânza (sortimentul Vacherin Mont D’or) s-a desfasurat în Vand, Elvetia,
între anii 1983-1987 si a afectat 122 persoane, dintre care 33 au decedat.
În timpul maturarii brânza a fost pastrata în pivnite, pe rafturi de lemn,
medii din care s-a izolat Listeria monocytogenes. Unele loturi de brânza au

34
7
fost puternic contaminate, cu peste 10 Listeria monocytogenes/g. În
Elvetia rata endemica normala a listeriozei umane este de 5-10 cazuri la 1
milion de persoane, iar în aceasta perioada s-a atins rata de 50 cazuri/ 1
milion de persoane. În anul 1983, s-au raportat 16 cazuri, în 1984, 24
cazuri; în 1985, 13 cazuri; în 1986, 28 cazuri si 41 cazuri în 1987. Rata
mortalitatii a fost de 28%, iar serotipul incriminat în 93% din cazuri a fost,
4b [30].
În Anglia si Irlanda, consumul de pate de ficat, a fost considerat ca
posibila cauza a epidemiilor de listerioza umana în perioada 1985-1989
[37] .
Rata endemica a listeriozei în aceasta regiune între anii 1967-1982 a
fost sub 100 de cazuri/an. În 1987 numarul cazurilor a crescut la 258; în
1988 la 291; iar în 1989 s-au înregistrat 250 cazuri. În anul 1990 numarul
cazurilor a scazut brusc la 90, aceasta indicând ca episodul s-a încheiat.
Din anamneza, a rezultat o corelatie semnificativa între consumul de pate
si debutul bolii. Studiul incidentei bacteriei în acest produs alimentar a
relevat ca pateul obtinut de un singur producator a fost mai contaminat
(48% probe pozitive), fata de cel obtinut de alti producatori (4% probe
pozitive). În 84% din cazurile de listerioza umana a fost implicat serotipul
4b, care a fost totodata prezent si în 96% din izolatele din pateul de ficat.
In Auckland, Noua Zeelanda, consumul de peste crud sau alte
alimente de origine marina a fost incriminat în declansarea unei epidemii
de listerioza perinatala [37].
In Franta s-au desfasurat mai multe epidemii de listerioza de origine
alimentara. Prima a evoluat în anul 1992, din luna martie pâna în

35
decembrie si a cuprins 279 cazuri, dintre care 33% forme feto-maternale si
66% adulti. Epidemia s-a soldat cu 63 decese si 22 avorturi. Tulpina
epidemica a fost detectata în diferite alimente: limba de porc în aspic,
preparate din carne de porc si unele brânzeturi. Limba de porc a fost
4 6
puternic contaminata ( 10 -10 Listeria monocytogenes/g, pe când gradul
de contaminare al celorlalte produse a fost sub 100 Listeria/g [4].
În anul urmator, a fost semnalata o alta epidemie în Franta, care a
evoluat în perioada august-octombrie. S-au înregistrat 39 cazuri, dintre
care 80% forme feto-maternale. Sursa epidemica a fost reprezentata de un
produs culinar specific, pe baza de carne de porc tocata [4].
Epidemia de listerioza din 1995 s-a datorat consumului de carne
tocata cruda si mezelurilor obtinute din carne tocata cruda. Imediat dupa
produsele din carne în ceea ce priveste rolul în aparitia acestei epidemii se
afla consumul unor brânzeturi ca: brânza de capra, de oaie, brânza rasa si
brânza cu pasta presata, acestea fiind incriminate în procent de 1-4%.
Analizele în ceea ce priveste criteriul pasteurizarii laptelui din care era
fabricata brânza respectiva, arata ca brînzeturile provenite din lapte crud
sunt mai frecvent incriminate decît cele ce provin din lapte pasteurizat (9%
fata de 5%). Într-un procent scazut au fost incriminate, de asemenea,
produsele vegetale si fructele de mare.
În ultimul timp, listerioza se poate manifesta si sub forma de gastro-
enterite. Aceste semne sunt mai putin descrise in literatura decît celelalte
semne ale bolii ca meningite, encefalite. Este cazul epidemiei de listerioza
din Italia din anul 1998 cînd au fost afectate 1594 de persoane care
manifestau semnele gastro-enteritei, neînregistrându-se nici un deces[53].

36
În Franta în 1999 a fost semnalata o alta epidemie de listerioza, care
a afectat 23 de persoane dintre care 7 au decedat, cazuri prezente în 19
departamente raspîndite în toata Franta. De aceasta data factorii
incriminati au fost reprezentati de carne tocata si prajita [4].

2.2. CAZURI SPORADICE DE LISTERIOZA UMANA DE


ORIGINE ALIMENTARA

Exceptând epidemiile de origine alimentara descrise anterior,


listerioza umana, se întâlneste totusi mai frecvent ca o boala sporadica.
Cum majoritatea acestor cazuri sunt de origine alimentara, se
impune un control sustinut al bolii si în SUA, Centers for Disease Control
(CDC) se ocupa de acest lucru. S-a estimat ca în 1986, în SUA s-au
întâlnit aproximativ 1700 cazuri de listerioza umana, cu o incidenta anuala
de 7,1 cazuri/1 milion persoane. În perioada iunie-septembrie 1987, acest
centru a condus o supraveghere activa a populatiei pentru infectii cu
Listeria monocytogenes. Au fost luati în studiu 154 pacienti din 6 regiuni
ale SUA: New Jersey, Missouri, Oklahoma, Tennessee, Washington, si Los
Angeles [36].
Din evidenta epidemiologica, a rezultat ca în 30 din cele 154 cazuri
(20%), infectarea s-a realizat prin consumul unor alimente contaminate
(crenvurstii si carnea de pui). În Oklahoma, consumul de carne de curcan a
fost implicat într-un caz mortal de listerioza si s-a luat masura ca acest
produs sa fie retras de pe piata. Atât de la consumator, cât si din pachetele
nedesfacute cu carne de curcan a fost izolat serotipul 1/2a.

37
CDC a condus un al doilea studiu, în perioada 1 noiembrie 1988 si
31 decembrie 1990, cu scopul identificarii factorilor de risc alimentari
pentru listerioza sporadica. Populatia tinuta sub supraveghere a fost de
peste 18 milioane persoane, din 5 regiuni geografice ale SUA. Au fost
înregistrate 301 cazuri de listerioza si 32% din acestea au fost atribuite
consumului unor alimente contaminate : brânza Feta si stil mexican, pui si
altele. În anul 1991, s-a înregistrat o descrestere a cazurilor de listerioza,
cuprinse între 30-40%, comparativ cu anii 1989-1990. Incidenta listeriozei
sporadice a fost de 7,4 cazuri/milion persoane, cu o rata a mortalitatii de
23%. Serotipurile izolate au fost 1/2a (23%) si 1/2b (36%), deci totalizând
59% din cazuri, iar serotipul 4b s-a întâlnit la 37% din cazuri.
Au fost investigate pentru prezenta Listeria spp. alimentele din
frigiderele acestor pacienti. Din 2229 probe de alimente, 11% au fost
pozitive pentru Listeria monocytogenes (67% dintre acestea au fost
produse lactate, în special brânzeturi). 95% din tulpinile izolate din
alimente au apartinut serotipurilor 4b, 1/2a si 1/2b.
In 1998, in Franta 230 de cazuri sporadice au fost semnalate
cu o incedenta de 3,8 cazuri la un million de locuitori, dintre care 47 au
fost forme perinatale si 183 forme non perinatale. Distributia formelor
perinatele pe varsta a aratat ca 71% au aparut la varste dupa 60 de ani,
25% intre 21 si 60 de ani .
În anul 2000 au fost înregistrate 216 cazuri de listerioza forma
sporadica cu urmatoarea repartitie: 48(22%) forme neonatale, si 168(78%)
forme perinatale. O scadere importanta a numarului de forme perinatale a
fost observata între 1994 si 1996, dupa aceasta perioada numarul cazurilor

38
ramânând stabil. Distributia formelor perinatale este urmatoarea: 110
cazuri(65%) ca bacteriemii/septicemii, infectii ale sistemului nervos 42
cazuri(25%) si alte forme 16 cazuri (10%) [4].
A fost pus la punct un sistem de electroforeza MEE (multilocus
enzyme electrophoresis), pentru stabilirea legaturii între izolatele clinice si
cele alimentare de Listeria monocytogenes. Izolatele clinice si cele
alimentare nu pot fi deosebite prin serotipizare, ribotipizare sau tehnica
MEE si singura metoda care ar putea stabili legatura dintre perechile de
izolate pacient-produs a fost tehnica DNA figerprinting [1].

39
CAPITOLUL 3

METODE DE IZOLARE, IDENTIFICARE SI


DETERMINARE CANTITATIVA A SPECIEI
LISTERIA MONOCYTOGENES ÎN PRODUSELE
ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMALA

Consecinta a epidemiilor de listerioza din anii 1990-2000, metodele


de izolare si identificare a germenilor din genul Listeria si mai ales specia
Listeria monocytogenes au înregistrat un important progres. Timpul
necesar pentru detectarea speciei L.monocytogenes s-a scurtat
considerabil de la câteva saptamâni la 2-3 zile. Pe lânga metodele
bacteriologice s-au dezvoltat metode imunologice (ELISA,ELFA, tehnici
de separare magnetica). În paralel cu metodele imunologice s-au dezvoltat
si numeroase metode de biologie moleculara (PCR) [14].

3.1. METODE BACTERIOLOGICE


Majoritatea procedeelor de izolare si îmbogatire selectiva pentru
detectarea speciei Listeria monocytogenes se bazeaza pe rezistenta acestei
bacterii la anumiti agenti selectivi care inhiba dezvoltarea florei de
asociatie.
Agentii selectivi cel mai frecvent utilizati în prepararea mediilor de
îmbogatire selectiva includ : acriflavina, acidul nalidixic, clorura de litiu,
feniletanolul, moxalactamul si altii .
Procedeele de detectare a acestei specii bacteriene în produsele
alimentare sau în spatiile de prelucrare a alimentelor, cele mai raspândite
40
sunt cele recomandate de USDA -FSIS (US Departament of Agriculture -
Food Safety Inspection Service) pentru detectarea speciei Listeria
monocytogenes în carne si produsele din carne si de FDA (Food and Drug
Administration), în lapte si produsele lactate.

3.1.1. PROCEDEUL FDA

Acest procedeu implica o îmbogatire initiala a 25g sau 25ml de


proba în 225ml LEB (Listeria enrichment broth). LEB contine TSB la care
se adauga 0,6% extract de drojdie, 50mg cicloheximida, 15mg acriflavina
si 40mg acid nalidixic /litru.
Probele se incubeaza la 30°C/24-48h, o modificare a procedeului
original care cere o îmbogatire de 1-7 zile la 30 oC. Urmeaza
transplantarea de pe LEB pe mediile: Oxford si LPM (lithium chloride
phenylethanol moxalactam), ambele medii înlocuiesc agarul Mc Bride
modificat (MMA), recomandat initial ca mediu selectiv de izolare. Mediile
se incubeaza la 35°C/48h apoi coloniile trebuie confirmate ca apartin
speciei Listeria monocytogenes. Testele de confirmare includ examinarea
coloniilor alb-bleo în lumina oblica la 45o, mobilitatea, catalaza, hemoliza
pe agarul cu sânge, testul CAMP, rosu-metil, Voges Proskauer, fermentarea
manitolului, xilozei si ramnozei .
Procedeul FDA a fost conceput, în mod special pentru optimizarea
izolarii speciei Listeria monocytogenes în lapte si produsele lactate.

3.1.2.PROCEDEUL USDA- FSIS

Procedeul de îmbogatire selectiva USDA-FSIS pentru izolarea


speciei Listeria monocytogenes din carne, a fost dezvoltat de Mc Clain

41
and Lee (25). Ulterior, acest procedeu a fost utilizat cu succes si pentru
produsele lactate si probele de mediu.
De asemenea, acest protocol include o îmbogatire initala a 25ml sau
25g proba în 225ml mediu LEB 1, care înlocuieste bulionul initial de
îmbogatire UVM (University of Vermont Medium).
Bulionul de îmbogatire primara LEB 1 contine pe litru: 5g
proteoza- peptona, 5g triptona, 5g Leb Lemco, 5g extract de drojdie, 20g
clorura de sodiu, 12g fosfat disodic - 7- hidratat, 1,35 fosfat monobazic de
potasiu, 1g esculina, 20g acid nalidixic, 1,2mg acriflavina.
Urmeaza incubarea la 30°C/20-24h. Apoi 0,1ml mediu de
îmbogatire primara se transfera în 10ml bulion de îmbogatire secundara
Fraser si se incubeaza la 35oC/ 24h si 40h.
Bulionul de îmbogatire secundara Fraser, contine pe litru: 52g
UVM, 3g clorura de litiu, 25mg acriflavina si 0,5g citrat feric de amoniu.
Se incubeaza la 35°C/24-48h, dupa care probele se trec pe agar
Oxford modificat(MOX), care se incubeaza la 35°C/24h si se examineaza
coloniile tipice de Listeria. Hidroliza esculinei si reactia ulterioara cu
citratul feric de amoniu, determina producerea unui precipitat negru în
jurul coloniilor de Listeria pe agarul MOX. Coloniile tipice sunt
transplantate pe agar cu 5% sânge de cal. Coloniile transparente,
betahemolitice sunt transplantate în bulion BHI, care se incubeaza peste
noapte la 35oC si se efectueaza testele de confirmare prezentate la
procedeul FDA.

3.1.3. PROCEDEUL NGFIS

42
O metoda larg raspândita în Europa, pentru detectarea speciei
Listeria monocytogenes în alimente este metoda NGFIS, recomandata de
Netherland Goverment Food Inspection Service, elaborata de Van Netten
si col.
Acesti autori au raportat o sensibilitate superioara a acestei metode,
fata de procedeul USDA, când se urmareste detectarea speciei Listeria
monocytogenes din alimente în care se afla sub nivelul de 10CFU/ml.
În procedeul NGFIS, pentru îmbogatirea selectiva se utilizeaza
bulionul L-PALCAMY, cu incubare la 30oC/24-48h, apoi cultura se trece
pe agar PALCAM.
Bulionul de îmbogatire selectiva L-PALCAMY contine la litru de
apa distilata: 23g peptona Oxoid, 5g extract de drojdie, 5g Lab Lemco, 5g
lapte peptonizat Oxoid, 5g Na Cl, 5g D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat
feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina B, 5mg
acriflavina, 10g clorura de litiu, 30mg ceftazidime, moxalactam si 25ml
emulsie de galbenus de ou.
Agarul PALCAM contine la litrul de apa distilata: 39g agar Columbia,
0,5g D-glucoza, 10g D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu,
80mg rosu fenol, 100000UI polimixina B, 5mg acriflavina, 15g clorura de
litiu si 20mg ceftazidime sau moxalactam.
Numeroase studii au urmarit compararea diferitelor procedee de
izolare a speciei Listeria monocytogenes din produsele alimentare. Doyle
and Schoeni(21), au comparat procedeul FDA, cu metoda de îmbogatire
la rece (Gray) si cu un procedeu propriu de îmbogatire selectiva, SEP,
(selective enrichment procedure). S-a urmarit izolarea prin aceste procedee
a speciei Listeria monocytogenes dintr-un lot de brânza "soft ripened"
contaminat. Prezenta bacteriei a fost confirmata, în 41 din 90 de probe

43
examinate. Prin procedeul de îmbogatire la rece, prezenta bacteriei a fost
detectata în 21 probe, în timp ce prin procedeul FDA, numai în 16 probe.
În cadrul unui studiu al CDC, asupra factorilor de risc alimentari
pentru listerioza sporadica, în perioada noiembrie 1988, decembrie 1990,
Hayes si col., au condus un studiu comparativ al celor 3 procedee
microbiologice de izolare a bacteriei din 899 probe de alimente.
Sensibilitatea de detectare pentru fiecare metoda a fost: 65% pentru
procedeul FDA, 74% pentru procedeele USDA si NGFIS. Folosind o
combinatie a ultimelor doua procedee, sensibilitatea de detectare a crescut
la 90%. Pe baza acestor rezultate CDC a adoptat utilizarea simultana a
metodelor USDA si NGFIS pentru izolarea acestei bacterii din alimente
[36].

3.1.4. METODOLOGIA DE IZOLARE UTILIZATA ÎN TARA NOASTRA

În tara nostra, se utilizeaza o metodologie de izolare si identificare


a speciei Listeria monocytogenes din produsele alimentare de origine
animala, în care sunt incluse 3 metode de izolare: USDA, TERPLAN si
MERCK.
Procedeul USDA a fost prezentat anterior.
Metoda TERPLAN utilizeaza 4 medii de cultura si anume: un bulion
de îmbogatire, agarul Oxford, mediile TSA si TSB.
Bulionul de îmbogatire contine acid nalidixic, hidroxid de potasiu,
triptona, peptona, dextroza, fosfat dipotasic, extract de drojdie si apa
distilata. Mediul TSA este un agar cu triptona din soia, iar mediul TSB este
un bulion cu triptona din soia si extract de drojdie.
Proba însamântata în bulionul de îmbogatire se incubeaza 48h la
30oC, dupa care se fac strieri pe agarul Oxford. Incubarea se realizeaza în
aceleasi conditii. Coloniile caracteristice pentru Listeria spp. sunt mici,

44
înconjurate de un halou negru, 3-5 astfel de colonii se transplanteaza în
mediile TSA si TSB.
Metoda MERCK utilizeaza un bulion de îmbogatire si agarul
MERCK.
Bulionul de îmbogatire contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu,
tiocianat de potasiu, tiamina si tripaflavina în apa distilata. Agarul MERCK
contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu, tiamina, tripaflavina, acid
nalidixic, agar si apa distilata.
Proba se însamânteaza în bulionul de îmbogatire, se incubeaza 48h,
la 30oC, apoi se fac strieri pe agarul MERCK. Se incubeaza în aceleasi
conditii si 3-5 colonii caracteristice (mici cu centrul galben-verzui si
periferia transparenta usor verde- albastruie), se transplanteaza în bulion si
agar nutritiv.
În continuare se executa testele pentru identificare din care amintim:
mobilitatea, reactia catalazei, reactia oxidazei, fermentarea glucidelor,
testul de hemoliza si testul CAMP. Dupa ce bacteria izolata a fost
identificata ca Listeria monocytogenes, urmeaza serotipizarea tulpinii
respective. Datorita faptului ca majoritatea cazurilor de listerioza la om
sunt determinate de trei serotipuri (1/2a, 1/2b si 4b), serotipizarea are o
importanta minora în investigatiile epidemiologice. Numeroase metode de
subtipizare au fost utilizate în decursul timpului: tipizarea fagica, tipizarea
izoenzimatica (prin MEE-multilocus enzyme electrophoresis),
ribotipizarea (utilizand Ribosomal DNA fingerprinting), tipizarea
plasmidica si tipizarea în functie de monocinele sintetizate de tulpinile de
Listeria monocytogenes [13].
În ultimul timp, pentru detectarea acestei specii bacteriene în
produsele alimentare au fost utilizate o serie de metode rapide care
utilizeaza ELISA, flow citometria, sau amprente AND. Însa aceste metode

45
sunt conditionate de necesitatea îmbogatirii probei la un nivel minim
detectabil de 105-106 Listeria/ml.
Toate aceste procedee mentionate anterior, conventionale sau
rapide, folosesc medii de îmbogatire înalt selective, care faciliteaza
dezvoltarea bacteriilor din genul Listeria, în pofida florei de asociatie.
Totusi aceste medii selective nu permit detectarea celulelor bacteriene care
au fost afectate de caldura, frig sau substante chimice, însa la un nivel
subletal si care ar putea exista în diferite alimente, sau spatiile tehnologice
de obtinere a acestora [22, 24, 32, 47, 56, 59].

3.1.5.DETECTAREA CELULELOR BACTERIENE LISTERIA AFECTATE


DE DIFERITI FACTORI STRESANTI LA UN NIVEL SUBLETAL

Stresul provoaca modificari în structura macromoleculara si


organizarea celulei bacteriene. Modificarea proteinelor este de o
importanta majora datorita implicarii lor în metabolismul
microorganismului respectiv.
Efectul diferitilor factori de stres (temperatura joasa: 4oC si ridicata:
49oC, valori extreme de pH :4 si 9,5 precum si diversi factori chimici:
detergenti-SDS 0,015%, deoxicolat 0,3% si etanol 5%) asupra profilului
proteic la Listeria monocytogenes a fost studiat de Gormon and Phan-
Thanh în anul 1994 [36]. Autorii au observat ca stresul a represat sinteza a
50% din proteinele sintetizate de aceasta bacterie în conditii normale si a
indus sinteza unor proteine noi specifice de stres. Fiecare factor de stres a
determinat sinteza unui set de proteine specifice, totusi au existat si
proteine comune sintetizate în prezenta unor factori diferiti. Mai mult decât
atât, acelasi factor a indus sinteza unui singur tip de proteina la 2 specii
diferite: Listeria monocytogenes si Listeria innocua ceea ce demonstreaza

46
ca bacterii înrudite pot dezvolta strategii similare, daca nu identice, în
raspunsul fata de acelasi factor de stres [22, 24, 32].
Specia Listeria monocytogenes ar putea fi afectata în timpul
prelucrarii produselor alimentare de factori ca: încalzirea, congelarea,
uscarea, iradierea, sau expunerea la diferiti agenti chimici (dezinfectante,
conservanti, acizi). Toate procedeele de detectare curenta, cu exceptia
îmbogatirii la rece, implica îmbogatirea selectiva. Tehnica de îmbogatire la
rece nu se poate utiliza însa în analizele de rutina datorita timpului
îndelungat (aproape 2 luni) necesar pentru îmbogatire [56, 59].
Metodologia curenta subestimeaza însa numarul real de bacterii
prezent într-un produs, datorita neglijarii celulelor bacteriene stresate
subletal. Numeroase studii au testat diferiti compusi (acriflavina,
polimixina, feniletanolul) care intra în compozitia mediilor selective si s-a
constatat ca acestia inhiba dezvoltarea bacteriilor afectate (stresate)
termic.
Studiul factorilor nutritivi care au indus regenerarea listeriilor
afectate termic a fost facut de Busch and Donnely [19] care au constatat
ca: Glucoza, lactoza, sucroza, extractul de drojdie, piruvatul,
magneziul si fierul au determinat regenerarea bacteriilor din speciile
Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate de caldura. A fost
formulat un mediu de cultura lichid de regenerare/îmbogatire, care include
acesti compusi. Acest mediu, LRB ( Listeria repair broth ), a permis
completa revitalizare a celulelor bacteriene afectate, în timp de 5h la 37 oC.
LRB contine pe litrul de apa distilata: 30g TSB, 5g glucoza, 6g extract de
drojdie, 4,94g sulfat de magneziu, 0,3g sulfat feros, 10g acid piruvic, 8,5g
MOPS-free acid si 13,7g MOPS sare de sodiu. Dupa regenerare, agentii
selectivi: acriflavina, acidul nalidixic si cicloheximida se adauga la LRB în
aceleasi concentratii cu cele din bulioanele utilizate de procedeele USDA
si FDA. Comparând eficacitatea LRB de a induce regenerarea/

47
îmbogatirea bacteriilor din genul Listeria afectate termic, cu cea a altor
medii, s-a observat ca bulioanele de îmbogatire FDA si UVM nu au indus
revitalizarea. Populatiile de Listeria, în mediile de îmbogatire selectiva
dupa 24h incubare, au fost cuprinse între 1,7 x 10 8 si 9,1 x 108 UFC/ml,
comparativ cu populatiile în LRB de 2,5 x 1011- 8,2 x 1011 UFC/ml.
Totodata a fost studiata rezistenta listeriei la conditiile de congelare.
Golden si col.[32] au comparat gradul de afectare a 4 tulpini de Listeria
monocytogenes, supuse congelarii la -18oC, timp de 7 si 14 zile. Procentul
de afectare a oscilat între 72 si 80%. El-Kest and Marth [24] au observat
un procent de afectare de 65% si 55% mortalitate, dupa mentinere în
tampon fosfat, la 18oC, 24h. Glicerolul în concentratie de 2 si 4% a
asigurat protejarea bacteriilor în timpul congelarii. Palumbo and Williams
[49] au utilizat diferite medii pentru a determina cantitativ Listeria
monocytogenes (afectate sau nu), în diferite produse congelate si a aratat
ca pH-ul produsului a influentat gradul de afectare în timpul stocarii
prelungite la - 18oC.
De asemenea a fost examinat modul de revitalizare a bacteriilor din
specia Listeria monocytogenes, afectate de congelare si diferite substante
dezinfectante, în LRB. Budo-Amoako si col.[7] au observat ca bacteriile
afectate termic (5 min. la 60oC) si prin congelare (7 zile la -20 °C), s-au
regenerat în 6-8 h în TSB cu 0,6 % extract de drojdie (TSBYE) la 35 oC,
dar si-au pierdut capacitatea de regenerare în LEB.
Procentul de afectare/mortalitate al speciei Listeria monocytogenes
au influentat tipul si concentratia dezinfectantelor, timpul de expunere si
procedeul de îmbogatire. Mediul LRB a permis revitalizarea bacteriilor
afectate de actiunea substantelor dezinfectante, pe când UVM ( University
of Vermont Medium) nu a indus regenerarea acestora.

48
Crowford si col. [11] au aratat ca în lapte, Listeria monocytogenes
afectata termic, prin încalzire la 71,7oC si-a pierdut capacitatea de
regenerare în timpul stocarii la 4oC/28 zile. Donnely [19] a studiat
capacitatea speciilor Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate
termic de regenerare în laptele pasteurizat. Capacitatea de regenerare a
fost puternic influentata de temperatura. La 4oC, regenerarea a fost
initiata dupa 8-10 zile si a fost completa dupa 16-19zile. În schimb, la
10oC regenerarea a fost initiata imediat si a fost completa dupa 4 zile. La
26 si la 37oC regenerarea s-a produs dupa 13h si respectiv 9h. Diferentele
între rezultatele obtinute de Crowford si Meyer reflecta temperaturile
diferite utilizate pentru afectarea termica a bacteriilor. Temperatura ridicata
folosita de Crowford a indus afectarea grava, ireversibila a germenilor
[11].
Produse (cum ar fi laptele), care permit regenerarea bacteriilor
afectate, asociate cu nedetectarea germenilor în aceste alimente ar putea
avea consecinte semnificative asupra sanatatii consumatorilor, mai ales
daca se au în vedere studiile lui Mc Carthy care au demonstrat ca germenii
din specia Listeria monocytogenes, stresati termic dupa regenerare, au fost
la fel de patogeni ca înainte de afectarea termica [44].

3.2. METODE BIOCHIMICE

Metodele biochimice se bazeaza pe sisteme biochimice miniaturale


cu ajutorul carora sunt testate tulpinile izolate pe mediile selective.
 SISTEMUL API LISTERIA (Bio Merieux, Mary LaEtoile,
France) se bazeaza pe investigarea a zece caractere biochimice într-un
sistem microtest, iar rezultatele se obtin în 24h.

49
 MONO CONFIRM TEST (AES Laboratoire, Combourg,
France) este o micrometoda bazata pe determinarea a patru caractere
biochimice care permit confirmarea genului Listeria si identificarea speciei
Listeria monocytogenes. Evidentierea enzimei D-aminopeptidaza, permite
diferentierea tulpinilor de Listeria monocytogenes în 24 h de alte specii de
Listeria.
 MICROBACT 12L (Rhone-Diagnostic-Lyon-France) este o
coloana de identificare compusa din 11 teste de fermentare a glucidelor si
un test de hemoliza. Rezultatele sunt obtinute în 6-24 ore.

3.3. METODE IMUNOCHIMICE

Aceste metode se bazeaza pe recunoasterea antigenului Listeria cu


ajutorul anticorpilor specifici anti-Listeria si mai recent anti-Listeria
monocytogenes. Complexul antigen-anticorp este pus în evidenta printr-o
reactie chimica de culoare sau prin fluorescenta.

Aceste metode au o sensibilitate de 105-106 bacterii/ml, ceea ce


necesita o îmbogatire prealabila, de obicei în doua etape (în bulion de

50
îmbogatire). Caracteristicele unor metode imunochimice sunt prezentate în
tabelul 6.

TABEL 6
Caracteristicile unor metode imunochimice pentru detectare Listeria
METODA KIT LISTERIA LISTERIA TEK VIDAS
Tehnica Elisa tip Elisa tip ELFA (Enzime Linked
sandwich sandwich Fluorescent Assay)
Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria
monocit.
Îmbogatire 2-3 zile 2 zile 2 zile 2 zile
Sensibilitate 7x10 4 10 5 10 5 5x10 5
(UFC/ml)
Rapiditate 1,5h 1,5h 45min. 1,1h
Colorimetrie Colorimetrie Florimetrie Florimetrie
Tehnica de (Ac. cuplati cu (Ac. cuplati cu (Ac. cuplati (Ac. cuplati
evidentiere peroxidaza) peroxidaza) cu fosfataza cu fosfataza
alcalina) alcalina)

Sistemul VIDAS permite detectarea Listeria spp. sau Listeria


monocytogenes prin tehnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay).
Dupa o dubla îmbogatire în bulionul Fraser, proba este depusa într-
un cartus al sistemului automat. Prin aspirarea probei cu ajutorul unui un
con sensibilizat cu anticorpi monoclonali se asigura fixarea specifica a
germenilor din genul Listeria. Complexul antigen-anticorp este pus în
contact cu anticorpi marcati cu fosfataza alcalina, iar ansamblul este
evidentiat cu un substrat al acestei enzime ( 4-metil-umbeliferil-fosfat),
prin determinarea intensitatii fluorescentei la 450 nm.

51
3.4. METODE IMUNOFIZICE

Aceste metode au la baza formarea complexului antigen-anticorp


care este evidentiat cu ajutorul unei tehnici fizice. Principalele metode sunt
prezentate în tabelul 6.

3.4.1. TESTUL IMUNO-LATEX

KIT-ul Listeria Rapid Test (Unipath,Dardilly, France) este un test


imunologic realizat pe o placa ce contine anticorpi monoclonali anti
antigenul flagelar B-Listeria, dispusi sub forma de banda. Proba, dupa o
dubla îmbogatire în bulion Fraser si LEB tamponat, este depusa pe
suportul absorbant al placii, care contine particule de latex bleo
sensibilizate cu anticorpi. Prezenta în proba a germenilor din genul Listeria
va induce formarea de complexe antigen-anticorp, cu anticorpii fixati pe
particulele de latex. Aceste complexe vor migra prin capilaritate, de-a
lungul suportului pâna vor întâlni anticorpii monoclonali dispusi sub forma
de banda. Datorita imobilizarii complexelor produse, se formeaza o banda
de coloare albastra, în cazul reactiei pozitive.
Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: ergonomia, simplitatea
de aplicare si rapiditatea de interpretare.
Ca si în cazul metodelor ELISA si ELFA, sensibilitatea intrinseca a
acestui kit nu permite întotdeauna detectarea rapida a bacteriilor stresate,
care se multiplica foarte lent.
TABEL 7

52
Metode imunofizice
METODA FLOW IMUNO-LATEX IMUNOCAPTARE
CITOMETRY
Detectare Calitativa Calitativa Listeria Cantitativa Calitativa
Rapid Test Lister Test Lister Screen
Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp.
Sensibilitate
intrinseca 106  107 104  105 1 1
(UFC/ml)
Îmbogatire 24h 42h fara 18h
Rapiditate* 26h 43h 27h** 42-66h
Sistem de Imobilizarea Etalare pe Etalare pe
detectare Fluorescenta complexelor geloza geloza
Ag/Ac-latex dot-blot PALCAM
* Fara confirmarea rezultatelor
**Cu confirmarea coloniilor prin dot-blot.

3.4.2.FLOW- CITOMETRIA

Aceasta metoda permite detectarea unei populatii bacteriene


marcate, în mediu lichid.
Dupa o îmbogatire selectiva în bulion LEB, ADN-ul bacterian este
colorat cu iodura de propidium, apoi celulele bacteriene din genul Listeria,
sunt marcate cu anticorpi specifici cuplati cu izotiocianat de fluoresceina.
În faza urmatoare, proba este expusa unui fascicul de raze laser si se
realizeaza interpretarea. Celulele bacteriene sunt caracterizate în functie de
morfologie, antigenele de suprafata si continutul în ADN.

53
Flow-citometria are o sensibilitate intrinseca de 10 6-107 Listeria
monocytogenes/ml, iar cu o faza de îmbogatire de 24h, contaminarea

minima detectabila este de 102 Listeria monocytogenes/ml. Tehnica este


aplicabila si pe probe de consistenta solida, daca examinarea se executa în
bulion de îmbogatire.

3.4.3.IMUNOCAPTAREA

Imunocaptarea este o metoda originala care permite detectarea si


concentrarea germenilor din genul Listeria existenti într-o proba. Bacteriile
sunt captate cu ajutorul anticorpilor policlonali fixati pe bile magnetice
microscopice. Complexele Listeria-imunobile sunt captate sub actiunea
câmpului magnetic, apoi imunobilele sunt spalate, iar complexele Listeria-
anticorpi policlonali sunt evidentiate prin diferite metode. În combinatie cu
separarea imunomagnetica sunt utilizate numeroase sisteme rapide de
detectare pentru Listeria: ELISA, PCR, dot-blot, hibridare etc. Cea mai
folosita metoda consta în etalarea imunobilelor pe agar selectiv, ulterior
coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii.
Aceasta metoda prezinta avantajul ca permite concentrarea
germenilor din genul Listeria, existenti într-o proba. Datorita utilizarii unui
numar mare de imunobile magnetice, sensibilitatea metodei este foarte
mare (1 bacterie/ml.).
Din punct de vedere comercial imunobilele VICAM (Watertown
SUA) sunt distribuite sub forma a doua chituri:
 Lister Screen

54
 Lister TestTM .
 Lister Screen este o metoda calitativa, combinând imunocaptarea cu
etalarea pe agar selectiv PALCAM, totodata este o metoda foarte
sensibila (0,5-1UFC/ml.) si specifica, prezentând avantajul ca permite
decelarea bacteriilor stresate din alimente.
 Lister TestTM permite o analiza cantitativa a germenilor din genul
Listeria dintr-un produs alimentar sau o proba de mediu. Dupa etapa de
imunocaptare imunobilele sunt etalate pe agar selectiv cu ceftazidima si
acid nalidixic. Coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii prin tehnica
dot-blot, cu anticorpi monoclonali. Complexele imune sunt apoi puse în
evidenta printr-o reactie enzimatica.
Metoda MIPA (Magnetic Immuno PCR Assay) combina
imunocaptarea cu detectarea prin PCR (poymerase chain reaction). Prin
imunocaptare, pe lânga concentrarea germenilor se asigura si eliminarea
unor inhibitori ai polimerizarii, prezenti în unele produse alimentare.
Timpul necesar obtinerii rezultatelor este de 55h.

3.5. METODE FIZICE

3.5.1.IMPEDANSMETRIA

Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea variatiilor electrice


dintr-un mediu de cultura, datorate metabolismului microbian. În cultura
obtinuta în bulion se aplica 2 electrozi care vor înregistra variatia

55
impedantei în urma dezvoltarii culturii. Tehnica poate fi utilizata si pentru
determinarea numarului de germeni si prezinta o serie de avantaje:
rapiditatea de detectare (24h), automatizare, economie de medii si
manopera. Totusi, detectarea este dificila atunci când probele sunt puternic
contaminate si impune utilizarea unor medii înalt selective.

3.6. METODE DE BIOLOGIE MOLECULARA

Tehnicile de biologie moleculara permit detectarea secifica a


germenilor din genul Listeria, sau chiar a speciei Listeria monocytogenes
cu ajutorul unor sonde nucleare a caror tinte sunt localizate pe ADN sau
ARN. Totodata sunt metode deosebit de specifice care asigura detectarea
inclusiv a tulpinilor atipice. Dupa utilizarea sondelor nucleare constituite
spre exemplu dintr-un fragment a genei care codifica listeriolizina O, [58],
au fost sintetizate oligonucleotide pentru detectarea bacteriei fie prin
hibridare cu o sonda, fie prin tehnica PCR cu ,,amorse".

3.6.1.HIBRIDAREA CU SONDE NUCLEARE

Tehnicile de hibridare a acizilor nucleici se bazeaza pe capacitatea


catenelor complementare de ADN sau ARN de legare specifica si de a
forma complexe stabile dublu catenare. Pentru detectarea speciei Listeria
monocytogenes prin hibridare nucleara, se utilizeaza 2 sonde specifice de

56
ARN ribozomal 16S (Metoda Gene Track sau AccuProbe). Aceste metode
necesita o faza de îmbogatire prealabila indiferent de sonda utilizata (Tabel
8).
TABEL 8
Metode de hibridare cu sonde comerciale pentru detectare Listeria

METODA GENE-TRACK ACCUPROBE TM


Specificitate Listeria spp. sau L.m. L. monocytogenes
Îmbogatire 24h 24-48h*
Sensibilitate 5x104 106
(UFC/ml)
Rapiditate 30 min. 2h 30min
Sistem de evidentiere Colorimetrie (Reactie Luminiscenta
imuno-enzimatica) (ester de acridinium)
*În caz de rezultat negativ se aplica o îmbogatire secundara.
Kit-ul Accuprobe TM(Gen-Probe sau Diego, USA) permite
detectarea specifica a speciei Listeria monocytogenes dupa îmbogatire si
etalare pe geloza. Apoi celulele bacteriene sunt lizate pentru a elibera
ARN-ul ribozomal, iar hibridarea se realizeaza cu o sonda de ADN
monocatenar marcata cu ester de acridinium. Hibrizii sunt detectati prin
luminiscenta (cantitatea de lumina este direct proportionala cu cantitatea
de ARN ribozomal).
CAPITOLUL 4

INCIDENTA SPECIEI LISTERIA


MONOCYTOGENES ÎN UNELE PRODUSE
ALIMENTARE

57
Izolata initial din citeva brinzeturi cu pasta moale, bacteria poate fi
prezenta in deferite categorii de alimente : hot dog, carnati de pasare,
carnuri, peste si mai ales in laptele crud. Carnea ca si mezelurile (rillettes
si limba de porc in aspic) au fost identificate ca surse de contaminare in
Franta. In ordine descrescatoare diferitele produse alimentare se
incadreaza astfel : pasare, porc, vita, mezeluri, peste, creveti.
In branzeturile proaspete si in branzeturile cu coaja prelucrata se
observa o diminuare lenta a numarului de Listeria pe timpul conservarii, in
timp ce branzeturile cu pasta moale cu coaja imbogatita sau cu coaja
spalata sunt frecvent sediul une multiplicari importante in cursul cresterii
pH-ului care acompaniaza afinarea, si deci suprafata este mult mai bogata
in Listeria decat interiorul branzeturilor.
Oficiul Federal Elvetian de Sanatate Publica sfatuieste
femeile insarcinate de a spala si fierbe legumele inainte de consumare (fara
a omite plantele aromatice si patrunjelul). Ca urmare a identificarii
frecvente a germenului in coaja branzeturilor in Elvetia (7%), dar nu si in
interior, Oficiul Federal sfatuieste de a nu se consuma coaja diferitelor
tipuri de branzeturi.
Intr-un studiu realizat de ,,L’Institute de l’Elevage-France”, cu
privire la gradul de contaminare a laptelui de vaca cu Listeria
monocytogenes, s-a observat în general un grad redus de contaminare
(<1bacterie/ml), în timp ce la 8,7% din probe, contaminarea s-a încadrat
între 5-40 bacterii/ml.
Incidenta speciei Listeria monocytogenes în brânzeturi este foarte
variata (0,5-10% din probele examinate), totusi, într-o fabrica de produse
lactate 20% din probele de brânza erau contaminate).
Comportarea bacteriei în timpul proceselor de prelucrare si
maturare a brânzeturilor, difera de la un sortiment la altul.

58
Concentratia de sare din brânzeturi (1,8-2%) nu influenteaza
dezvoltarea bacteriei, care poate tolera concentratii de clorura de sodiu de
pâna la 10%.
pH-ul însa influenteaza puternic dezvoltarea germenelui. Desi pH-ul
optim de multiplicare este 7, totusi bacteria se dezvolta si la valori mai
scazute de pH, însa nu sub 5,0.
În timpul diferitelor etape de preparare a brânzeturilor, valoarea pH-
ului înregistreaza variatii, influentând astfel dezvoltarea
microorganismului.
Numerosi autori au semnalat contaminarea laptelui de vaca cu
Listeria monocytogenes si mult mai putine referiri sunt cu privire la laptele
de capra sau oaie.
În tabelul 9 sunt prezentate date referitoare la contaminarea laptelui
de vaca (crud, neprelucrat) în diferite tari.

TABELUL 9
Gradul de contaminare al laptelui nepasteurizat, în diferite tari
Tara Numar de Listeria monocytogenes Serotipul
probe numar ( % ) predominant
Canada 445 6(1,3) NC
Scotia 540 14(2,6) 1(76,9)
Spania 95 43(45,3) NC
200 8(4,0) 1(71,4)
650 27(4,2) 1(61,5)
SUA
121 14 NC
292 12(4,1) NC

59
Finlanda 314 7(2,2) NC
Franta 1990 1044 93(8,9) NC
Olanda 137 6(4,4) 4b
Anglia 361 13(13,6) 1,2(85,0)
Elvetia 317 4(1,3) NC

TABEL 10
Incidenta speciei Listeria monocytogenes în unele
produse lactate ( dupa Farber)

Produs Numar de Nr.(%) LM Serotip LM


probe pozitive izolat (%) UFC/G
Brânza moale 222 23(10,0) NC <102-105

Brânza moale si 374 2(0,5) NC 104-105


semimoale 205 4(2,0)
Brânza semitare 88 0(0)
Brânza tare 100 2(2) 1/2a
509 29(5,7) 1(76)
140 1(0,7)
Brânzeturi diferite
89 8(9,0) 1(100)
23 20(87,0) 1/2a

60
769 63(8,2) 1/2a(71) 104-107
Brânza(probe dintr-o
366 4(1,1)
fabrica)
Brânza moale maturata 476 22(4,6)
Brânza moale nematurata 141 1(0,7) 4b(55)
180 4(2,2)
Brânza lapte capra 394 1(0,3)
Brânza lapte oaie 85 0(0)
Iaurt 51 1(1,9)
Înghetata 150 3(2,0) 4b

Astfel, brânzeturile cu pasta moale care la sfârsitul perioadei de


maturare au un pH cuprins între 6,5-6,8 ofera conditii mai bune pentru
multiplicarea bacteriei decât sortimentele cu pasta tare cu pH cuprins între
5,3-5,5. Genigeorgis a evaluat capacitatea a 24 sortimente de brânzeturi,
ca suport de dezvoltare pentru specia Listeria monocytogenes.
Brânzeturile cu un pH cuprins între 4,9-7,7 au oferit conditii pentru
dezvoltarea bacteriei (sortimentul Soft Hispanic, Camembert, Cottage).
Brânzeturile cu valori ale pH-ului cuprinse între 4,3 si 5,6 nu au permis
multiplicarea acestei specii bacteriene si au determinat moartea treptata a
germenilor (Feta, Cotija, Monterey, Swiss etc) [34].
De asemenea, concentratia laptelui în grasime influenteaza
dezvoltarea acestei specii bacteriene. Astfel, timpul de generatie a fost
redus în produsele cu un procent ridicat de grasime, fara de cele cu un
procent mai scazut: 4,98(ciocolata cu lapte), 5,25 (frisca), 7,22 (lapte
degresat), la 13oC.
Bacteriile lactice utilizate în obtinerea diferitelor sortimente de
produse lactate, inhiba usor, dar nu total multiplicarea speciei Listeria
monocytogenes. Fermentatia cu bacteria termofila Lactobacillus bulgaricus

61
pare sa fie mai puternic inhibanta pentru Listeria monocytogenes decât
fermentatia cu culturi starter lactice mezofile.
În prezenta bacteriilor psihrofile din lapte, specia Listeria
monocytogenes se dezvolta bine, iar Pseudomonas poate chiar stimula
dezvoltarea acestei specii bacteriene. Marshall and Schmidd (1988) au
observat ca dezvoltarea în lapte, la 10oC, a speciei Listeria monocytogenes
a fost stimulata de prezenta lui Pseudomonas, iar timpul mediu de
generatie a fost redus la 3h. Activitatea proteolitica desfasurata de
Pseudomonas spp. reprezinta un factor stimulator pentru dezvoltarea altor
germeni. Unele enzime proteolitice ale microorganismului sunt
termorezistente si rezista conditiilor de pasteurizare [11,60].
Bacteria se dezvolta bine în prezenta unor mucegaiuri utilizate în
industrializarea laptelui. Astfel, germenul se multiplica în prezenta speciei
Penicillium camemberti, la valori ale pH-ului>5,5. Brânza Camembert
ofera conditii mai bune pentru dezvoltarea speciei Listeria monocytogenes
decât alte sortimente de brânzeturi, deoarece în timpul maturarii acestui
produs, pH-ul înregistreaza o crestere [60].

62
Fig.5.Listeria monocytogenes –celule bacteriene fagocitate de un macrofag

63
Fig.6.Listeria monocytogenes-celule bacteriene flagelate
Examen la microscopul electronic

64
Fig.7.Listeria monocytogenes-celule bacteriene fagocitate de un neutrofil
frotiu din sange

65
Fig.8.Conjunctivita supurativa cu hiperplazie epiteliala la cobai inoculat experimental cu Listeria
monocytogenes (Semnul ochiului sau Semnul lui Anton)

66
Fig.9. Listeria monocytogenes- frotiu cultura- coloratia Gram.

67
CONCLUZII

1. Toxiinfectiile alimentare cu Listeria monocytogenes reprezinta,


inca un subiect de actualitate atat prin numarul persoanelor implicate,
gravitatea clinica, cat si prin diversitatea mare a produselor alimentare care
au reprezentat sursa de infectie.
2. În laptele pasteurizat nu a fost decelata aceasta specie bacteriana,
ceea ce ne conduce la concluzia ca semnalarile privind prezenta bacteriei
în unele produse lactate preparate din lapte pasteurizat, este datorata
contaminarii laptelui postpasteurizare sau a produselor lactate respective
pe parcursul fluxului tehnologic.
3. Siguranta alimentelor nu poate deveni un fapt real decat daca ea
constituie o responsabilitate a tuturor celor implicati in domeniul alimentar,
de la profesionosti la consumatori.
4. Pentru a avea o siguranta asupra calitatii alimentelor, este
important sa se cunoasca si mai ales sa fie respectate principiile de baza
din industria alimentara.
5. In momentul de fata sunt disponibile numeroase metode
(prezentate in acest studiu) de izolare, identificare si cuantificare a
gradului de contaminare cu Listeria monocytogenes a produselor
alimentare.

68
RECOMANDARI

1. In vederea prevenirii contaminarii produselor alimentare de


origine animala cu Listeria monocytogenes, trebuie respectate o
serie de norme igienico-sanitare, pe parcursul intregii filiere
producator consumator:
 Importanta tasarii, acoperirii si incarcarii silozurilor este
primordiala pentru evitarea patrunderii aerului si pentru
aparitia fermentatiilor care sunt favorabile multiplicarii
listeriei (listerioza fiind cunoscuta si sub denumirea de
boala de siloz).
 Spalarea energica a legumelor si a plantelor aromatice,
care se consuma in stare cruda.
 Dupa manipularea alimentelor crude, spalarea mainilor si
a ustensilelor de bucatarie care au fost in contact cu
alimentele respective.
 Prelucrarea termica (la o temperatura care sa asigure
inactivarea listeriilor eventual prezente) a alimentelor de
origine animala (carne, peste, sunca cruda).

69
 Evitarea contaminarii de la un aliment la altul, in timpul
conservarii.
 Conservarea alimentelor crude separat de alimentele
pregatite sau supuse consumarii.
 Spalarea regulata si dezinfectarea cu apa de Javel a
frigiderului .
 Verificarea periodica a temperaturii de refrigerare.
 Respectarea termenului de valabilitate a produselor
alimentare.
2. Din multitudinea metodelor de izolare, identificare si
cuantificare a speciei Listeria monocytogenes produselo

70
Bibliografie selectiva

1. BABBITT J. A. and BETTS R.P. (1992). Conffirmation of


Listeria monocytogenes using a commercyally available
nucleic acid probe. Food Microbiol. 9, 311-317.
2. BAYLES D.O., B. A. ANNES and B.J. WILLKINSON (1996),
Appl. Eviron Microb., 62, 3, 1116-1119.
3. BEUMER R.R. (1996)-Listeria spp. in domestic
environments., Epidem. and Inf., 117, 3, 429- 437.
4. BOSGIRAUD G. and A. MEMEDIER. (1991) Etude
epidemiologique de la distribution des especes de
Listeria et des serotypes de Listeria monocytogenesin
pathologie humaine, animale et dans les alimentes.,
Rev.Med.Vet., 142, 463-468.
5. BRADSHAW J.G., PEELERJ.T., CORWIN J.J., HUNT J.M.,
TIERNEY J.T. LARKIN E.P., and TWEDT R.M. (1985).
Thermalresistance of Listeria monocytogenes in milk. J.
Food Prot. 48, 743-745.
6. BUBERT A, J. RIEBE, N. SCHNITZLER (1997)- Isolation of
catalase negative Listeria monocytogenes strains from
listeriosis patients and their rapid identification by anti-p
60 antibodies and / or PCR, J. Clin. Microb., 35, 1, 179-
184.
7. BUDO-AMOAKO E., TOORA S., ABLETT R. and SMITH J.
(1992). Evaluation of the ability of primary selective
enrichment to resuscitate heat-injured and freeze
injured Listeria monocytogenes cells. Appl. Environ.
Microbiol. 58, 3177-3179.
8. BUNNING V.K., CRAWFORD R.G. and PEELER J.T. (1990).
Thermotolerance of Listeria monocytogenes and
Salmonella typhimurium after subletal heat shock. Appl.
Environ. Microbiol. 56, 3216-3219.
9. BUNNING V.K., C.W. DONNELLY, J.T. PEELER, E.H. BRIGGS.
J.G. BRADSHAW and T.J. TIERNEY. (1988) Termal
inactivation of Listeria monocytogenes with bovine milk
phagocytes. Appl. Environ. Microbiol. 54, 364-370.

71
10. COOTE P.J., HOLYOAK C.D. and COLE M.B.
(1991).Thermal inactivation of Listeria monocytogenes
during a process simulating temperatures achieved
during microwave heating. J. Appl. Bacteriol. 70, 489-
494.
11. CRAWFORD R.G., BELIVEAU C.M., PEELER J.T.,
DONNELY C. W. and BUNNING V.K. (1989). Comparative
recovery of uninjured and heat-injured Listeria
monocytogenes cells from bovine milk. Appl. Environ.
Microbiol. 55, 1490-1494.
12. CZUPRINSHI C.J., E.J. NOEL, M.P.DOYLE and R.D.
SCHULTZ (1989) Ingestion and killing of Listeria
monocytogenes by blood and milk phagocytes from
mastitic and normal cattle., 27, 812-817.
13. DATTA A.R. and KOTHARY M.H. (1993). Effects of
glucose, growth temperature and pH on listeriolysin O
production in Listeria monocytogenes. Appl. Environ
Microbiol. 59, 3495-3497.
14. DESTRO M.T., J.M. FARBER (1996) Use of molecular
typing methodes to trace the dissemination of Listeria
monocytogenesin a shrimp processing plant., Appl.
Envir. Microb., 62, 2, 705-711.
15. DOBREA MIMI, I. TOGOE, S. MEICA, MARCELA
BADULESCU, GEORGETA VOICU- Studiu comparativ al
unor metode de izolare a speciei Listeria
monocytogenes din lapte, Al VII -lea Congr. Nat. Med.
Vet., 21-24 oct.1997, Voineasa, România.
16. DOBREA MIMI, I. TOGOE, CAMELIA PAPUC, ANETA POP,
DOINA SOFEI- Micrometoda pentru determinarea
capacitatii hemolitice la Listeria monocytogenes, Al VII
-lea Congr. Nat. Med. Vet., 21-24 oct.1997, Voineasa,
România.
17. DOBREA MIMI, GEORGETA VOICU- Mediu selectiv
pentru Listeria monocytogenes, 1994, Ses. Com. St.
FMV-Bucuresti
18. DOBREA MIMI, I. TOGOE, ANA SANDU- Inducerea
cresterii virulentei la la Listeria monocytogenes prin
incubare la temperaturi scazute, 1994, Ses. Com. St.
FMV-Bucuresti

72
19. DONNELY C.W. and BAIGENT G.J. (1986). Method for
flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in
milk. Appl. Environ. Microbiol. 52:689-695.
20. DOYLE M.P., K.A. GLASS, J.T. BEERY, G.A. GARCIA, D.J.
POLLARD and R.D. SCHULTZ. (1987) . Survival of Listeria
monocytogenes in milk during hight-temperature short-
time pasteurization. Appl. Environ. Microbiol. 53, 1433-
1438.
21. DOYLE M.P. and SCHOENI J.L. (1987). Comparison of
procedures for isolating Listeria monocytogenes in soft,
surface-ripened cheese. J. Food Prot. 50, 4-6.
22. DOYLE M.P., L.M. MESKE and E.H. MARTH. (1985)
Survival of Listeria monocytogenes during manufacture
and storage of nonfat dry milk. J. Food Prot. 48, 740-742.
23. DRAMSI S., C., KOCKS, C. FORESTIER (1993)
Internalin- mediated invasion of epithelial cells by
Listeria monocytogenes is regulated by the bacterial
growth state, temperature and the pleiotropic activator,
prfA. Mol. Microbiol. , 931-941.
24. EL-KEST S.E. and MARTH E.H. (1992). Freezing of
L.monocytogenes and other microorganism: A review. J.
Food Prot. 55, 579-582.
25. FALKOW S., R.R. ISBERG and D.A.PORTNOY, (1992),
The interaction of bacteria with mammalian cells.,
Ann.Rev. Cell. Biol., 8, 333-365.
26. FEDIO W.M. and H. JACKSON.(1989). Effect of
tempering on the heat-resistance of Listeria
monocytogenes. Lett. Appl. Microbiol. 9, 157-160.
27. FENLON D.R. and J. WILSON(1989). The incidence of
Listeria monocytogenes in raw milk from farm bulk
tanks in north-east Scotland. J. Appl. Bacteriol. 66, 191-
196.
28. GAHAN C.G.M., DRISCOL, B., H. COLIN. (1996) Acid
adaptation of Listeria monocytogenes can enhance
survival in acidic foods and during milk fermentation.
Appl. Envir. Microb. 62, 9, 3128-3132.
29. GAY M., O. CERF and K.R. DAVEY (1996), Significance
of pre-incubation temperature and inoculum
concentration on subsequent growth of Listeria
monocytogenes at 14oC., J.Appl. Bact., 81, 4, 433-438.

73
30. GILOT P., ANNIE GENICOT and P. ANDRE. (1996)
Serotiping and esterase tiping for analisis of Listeria
monocytogenes population recovered from foodstuffs
and from human patients with listeriosis in Belgium., J.of
Clin.Microb., 34, 4, 1007-1010.
31. GLASS K.A. and DOYLE M.PM(1989). Fate of Listeria
monocytogenes in processed meat products during
refrigerated storage. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1565-
1569.
32. GOLDEN D.A. BEUCHAT L.R. and BRACKETT R.E.
(1988). Inactivation and injury Listeria monocytogenes
as affected by heating and freezing. Food Microbiol. 5,
17-23.
33. HANAWA T., T. YAMAMOTO and S. KOWIYA. (1995),
Listeria monocytogenes can growth in macrophages
without the acid of proteins induced by environmental
stresses. , Inf. Imm., 63, 12, 4595-4599.
34. HICKS S.J. and LUND B.M. (1991). The survival of
Listeria monocytogenes in cottage cheese. J. Appl.
Bacteriol. 70, 308-315.
35. HOF H, T. NICKTERLEIN (1997)- Management of
listeriosis, Clin.Microb.Rev., 10, 2, 345-358.
36. HUI Y.H., RICHARD GORHAM J., MURRELL K.D. and
DEAN O. CLIVER. (1994). Foodborne Disease Handbook ,
Marcel Dekker, N.Y.
37. KATHARIN S. and L. PINE (1991) The type strain(s) of
Listeria monocytogenes: a sourse of continuing
difficulties., Int. J. Sistematic. Bacteriol., 41, 2, 328-330.
38. KLAUSNER R.B. and DONNELY C. W. (1991).
Environmental sources of Listeria and Yersinia in
Vermont dairy plants. J. Food Prot. 54, 607-611.
39. KNABEL S.J., WALKER H.W. HARTMAN P.A. and
MENDONCA A.F. (1990). Effects of growth temperature
and strictly anaerobic recovery on the survival Listeria
monocytogenes during pasteurization. Appl. Environ.
Microbiol. 56, 370-376.
40. KOHLER S., LIMEISTER-WACHTER M. and
CHAKRABORTY (1990). The gene coding for protein p60
of Listeria monocytogenes and its use as a specific
probe for Listeria monocytogenes. Inf. Immun. 58, 1943-
1950.

74
41. KROLL R.G. and PATCHETT R.A. (1992). Induced acid
tolerance in Listeria monocytogenes. Lett. Appl.
microbiol. 14, 224-227.
42. KUHN M. and GOEBEL W. (1989). Identification of an
extracellular protein of Listeria monocytogenes possibly
invollved in intracellular uptake by mamallian cells. Inf.
Immun. 57, 55-61.
43. LOW Y.Q. , A.E. YOURSEF (1997) -Adoptation to
sublethal environmental stresses protects Listeria
monocytogenes against lethal preservation factors.,
Appl. Environ. Microbiol, 63, 4, 1252- 1261.
44. Mc CARTHY S.A. (1991). Pathogenicity of
nonstressed , heat-stressed and resuscitatea Listeria
monocytogenes 1A1 cells. Appl. Environ. Microbiol. 57,
2389-2391.
45. Mc KELLAR R.C. (1994) Use of the CAMP test for
identification of Listeria monocytogenes,
Appl.Environ.Microb., 60, 4219-4225.
46. MAZZOTTA A.S., T.J. MANTVILLE (1997)- Nissin induces
changes in membrane fatty acid composition of Listeria
monocytogenes nissin- resistant strains at 10oC and
30oC., J.Appl. Microb., 82, 1, 32- 39.
47. MEYER D.H. and DONNELLY C.W. (1992) - Effect of
incubation temperature on repair of heat-injured Listeria
in milk, J. Food Prot., 55, 579-582.
48. MYERS E.R., DALLMIER A.N.W. and MARTIN S.E.
(1993). NaCl,KCl and virulence of Listeria
monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 59, 2082-
2086.
49. PALUMBO S.A. and WILLIAMS A.C. (1991). Resistance
of Listeria monocytogenes to freezing in foods. Food
Microbiol. 8, 63-68.
50. PELL M., DONACHE W. (1988) Temperature dependent
expresion of Listeria monocytogenes studies by electron
microscopy, SDSPAGE and western blotting., J. Gen.
Microbiol., 134, 2171- 2178.
51. PORTNOY D., CHAKRABORTY T., GOEBEL W. and
COSSART (1992). Molecular determinants of Listeria
monocytogenes pathogenesis. Inf. Immun. 60, 1263-
1267.

75
52. RYSER E.T. and MARTH E.H. (1987). Fate of Listeria
monocytogenes during the manufacture and repening of
Camembert cheese. J. Food Prot. 50, 372-378.
53. SALAMINA G. and A. NICCOLINI (1996)- A food borne
outbreak of gastroenteritis involving Listeria
monocytogenes., Epidem. and Inf., 117, 3, 429- 437.
54. SAVU C. –Note de curs.
55. STARBUCK M.A.B., HILL P. and STEWART G.S.A.B.
(1992). Ultra sensitive detection of Listeria
monocytogenes in milk by the polymerase chain
reaction. Leet. Appl. Microbiol. 15, 248-252.
56. THOMAS L.V. and J.W.T. WIMPENNY (1996)
Investigation of the effect of combined variations in
temperature, pH and NaCl concentration on nisin
inhibition of Listeria monocytogenes and Staphylococcus
aureus., Appl. Envir.Microb., 62, 2, 2006-2012.
57. TOGOE I.-(2001)- Boli infectioase ale animalelor:
bacterioze, Ed. Brumar, Timisoara.
58. VINE A. and B. SWAMINATHAN (1997)- Nucleotide
sequence analysis of 2 virulence associated genes in
Listeria monocytogenes serotype 1/2b and comparison
with the same genes in other serotypes important in
human disease, Letters in Appl.Microb., 24, 3, 166- 169.
59. WALKER S.J., ARCHER P. and BANKS J.G. (1990).
Growth of Listeria monocytogenes of refrigeration
temperatures. J. Appl. Bacteriol. 68, 157-162.
60. WAM J., K. HARMAK and B.E. DAVIDSON (1997)-
Inhibition of Listeria monocytogenes by piscicolin 126 in
milk and Camembert cheese manufactured with a
thermophill starter., J.Appl. Microb., 82, 2, 273- 281.

76