Cromatografie de gaze cu spectrometru de masă în tandem (GC-MS/MS)

Eluare: proces de dizolvare și separare a compușilor fixați pe un mediu absorbant dintr-o coloană cromatografică
prin spălarea acestora cu eluanți.
Eluant: solvent care servește la eluare.
Eluat: substanță rezultată prin eluțiune.
Eluțiune: procedeu chimic prin care se eliberează o substanță de pe absorbantul său prin spălare.
Timp de retenție: timp de eluare = timpul pe care îl petrece compusul de la intrarea până la ieșirea din coloană.
Ionizare: proces prin care atomii acceptă sau cedează electroni.

Cromatografia de gaze cu spectrometru de masă este o tehnică de separare, identificare și

cuantificare a compușilor chimici volatili dintr-un amestec. Aceasta are la bază o fază mobilă
formată dintr-un gaz și o fază staționară.
Principiu de funcționare
Proba de analizat (sub formă lichidă) este introdusă printr-un sistem de injecție într-un
liner încălzit (la temperaturi mari) în camera de vaporizare, unde are loc volatilizarea instantă a
acesteia. Un curent de gaz inert purtător (heliu deobicei) care reprezintă faza mobilă conduce
compușii prin coloana capilară ce conține faza staționară (care poate fi lichidă sau solidă).
Datorită diferențelor de proprietăți și structură a fiecărui component, interacțiunea cu faza
staționară este diferită. Prin urmare, sub aceeași forță motrice, timpul de trecere prin coloană al
fiecărui component diferă în funcție de punctul de fierbere și polaritate. Compușii care
interacționează mai mult cu faza staționară sunt întârziați și, astfel, separați de compușii care
interacționează mai puțin. După eluarea din coloană, compușii ajung la detector care este
spectrometrul de masă tandem (MS/MS) (în cazul Rexdan).
Spectrometria de masă este o tehnică analitică care măsoară raportul masă
moleculară/sarcină electrică (m/z) al particulelor încărcate și, prin urmare, poate fi utilizată
pentru a determina greutatea moleculară și compoziția elementară, precum și pentru
determinarea structurilor chimice ale moleculelor.
În spectrometrul de masă, inițial, compușii sunt ionizați și fragmentați cu ajutorul unei
surse de ionizare electronică (în cazul GC-MS/MS Rexdan). În sursa de ionizare electronică, un
electron, produs de un filament, este accelerat cu 70 de electroni volți (eV) și scoate un electron
din molecula de interes pentru a produce un ion molecular care este un cation radical. Această
ionizare cu energie ridicată poate duce la un ion molecular instabil, iar excesul de energie poate
fi pierdut prin fragmentare. Ruperea legăturii poate duce la pierderea unei molecule radicale sau
neutre și pot apărea și rearanjamente moleculare. Toate acestea au ca rezultat un număr, uneori
foarte mare, de ioni de mase diferite, cel mai greu fiind ionul molecular cu ioni fragmentari de
diferite mase inferioare, în funcție de: formula moleculară, structura moleculară a analitului,
unde a avut loc ruperea legăturii, care parte a reținut sarcina electrică.
Moleculele și fragmentele ionizate sunt apoi accelerate prin analizorul de masă al
intrumentului. În cazul Rexdan, spectrometrul de masă este format dintr-un triplu cvadrupol.
Analizorul de masă este, în principiu, un filtru de masă capabil să transmită numai ionul
ales/selectat. Cvadrupolul este format din 4 bare metalice paralele cu o tensiune aplicată direct pe
bare. Barele opuse (pe diagonală) au tensiunea aceluiași semn. O tensiune alternativă de ordinea
megahertzului este suprapusă. Câmpul electric rezultat forțează ionii din compușii separați să
parcurgă o traiectorie oscilantă diferită în funcție de raportul m/z. Compuși diferiți, care
coeluează cromatografic, pot crea ioni moleculari/fragmentați care au același raport m/z; cu toate
acestea, acești ioni vor avea o structură diferită.
Triplul cvadrupol constă în două analizoare de masă cu scanare (două cvadrupoluri),
separate de o celulă de coliziune (figura 2). Fragmentele separate în primul analizor de masă (ion
precursor) reacționează cu un gaz inert în celula de coliziune (argon în cazul Rexdan) printr-un
proces numit disociere indusă de coliziune, rezultând o fragmentare suplimentară (ion produs).
Ionii produși, numiți ioni de produs, vor fi dependenți de structura ionului precursor, prin urmare
spectrul de masă al ionului de produs de la compușii interferenți va fi diferit de cel al analitului
țintă. Ulterior, fragmentele rezultate intră în al doilea analizor de masă (cvadrupol) unde sunt din
nou separate în funcție de raportul m/z, iar apoi ajung la un detector de ioni. Prin ajustarea
câmpului electric se pot selecta valorile de m/z a ionilor care traverseaza cvadrupolul. Astfel,
ionii cu raport m/z diferit de cei selectați vor fi forțați să parcurgă traiectorii care duc în afara
câmpului electric și, prin urmare, nu vor ajunge la detector.
După ce ionii au fost separați de analizorul de masă pe baza raportului m/z, ei ajung la
detectorul de ioni unde semnalul este amplificat de un multiplicator de electroni. Semnalul este
înregistrat de software-ul de achiziție pe un computer pentru a produce o cromatogramă și un
spectru de masă pentru fiecare punct de date. Fiecare spectru de masă este unic și este generat
sub forma de peak cu o arie (vârf), permițând identificarea compusului.

Figura 1. Schema unui cromatograf de gaze cu spectrometru de masă în tandem

 Figura 2. Schema unui triplu cvadrupol

Detectoarele GC sunt limitate în informațiile pe care le oferă: timpul de retenție pe

coloana analitică și răspunsul detectorului. Identificarea se bazează pe compararea timpului de
retenție al peak-urilor dintr-o probă cu cei din standarde de compuși cunoscuți, analizați folosind
aceeași metodă. Cu toate acestea, GC singur nu poate fi utilizat pentru identificarea compușilor
necunoscuți.
O cromatogramă tridimensională este prezentată în figura 3. Axa x arată timpul de
retenție. Acesta poate fi văzut și ca număr de scanare, care este numărul de puncte de date care
au fost achiziționate de MS pe parcursul rulării. Axa y este răspunsul sau intensitatea măsurată
de detectorul de ioni. Axa z este m/z al ionilor din domeniul de masă dobândit.

Figura 3. Cromatogramă tridimensională

 O cromatogramă bidimensională este prezentată în figura 4. Cromatograma
bidimensională, este produsă prin însumarea abundențelor/intensităților tuturor ionilor la un
singur punct de date și trasarea acesteia în raport cu timpul de retenție (RT)/numărul de scanare
pentru a produce o cromatogramă ionică totală (TIC), care este mai comparabilă cu o
cromatogramă produsă de un detector GC. Zonele de vârf sunt proporționale cu cantitatea de
compus corespunzător din proba analizată.

Figura 4. Cromatogramă ionică totală (bidimensională – TIC)

Achiziția datelor GC-MS/MS poate fi efectuată fie în modul de scanare completă (full
scan), pentru a acoperi fie o gamă largă de rapoarte m/z, fie în modul de monitorizare a ionilor
selectați (SIM), pentru a colecta date pentru anumite mase de interes. GC-MS/MS poate fi operat
în modul de monitorizare selectivă a reacției (SRM) care ajută la reducerea interferențelor de la
ionii de fundal și la producerea unui raport semnal-zgomot ridicat pentru o capacitate excelentă
de detecție.

Consumabile:
Seringă;
Septum (garnitură de cauciuc care etanșează orificiul de injectare);
Liner (tub de sticlă care este încălzit și ajuta la vaporizarea probei odată injectată);
Coloană;
Ferulă;

Tip de injectare:
Split – cu divizarea probei. Proba este injectată prin liner în camera de vaporizare unde
suferă o evaporare rapidă. Debitul de gaze (He) duce vaporii de probă rapid în jos spre capul
coloanei. Doar o parte din probă intră în coloană, restul de probă fiind descărcată prin linia se
splitare. Acest mod de injecție se utilizează în general pentru probele cu o concentrație ridicată
de compuși sau pentru analiza probelor gazoase (Headspace).
 Splitless – fără divizarea probei. Proba este injectată prin liner în camera de vaporizare
unde suferă o evaporare rapidă. Debitul de gaze (He) duce vaporii de probă rapid în jos spre
capul coloanei. Toți vaporii de probă sunt băgați în coloană. Acest mod de injecție se utilizează
în general pentru probele cu o concentrație scăzută de compuși.
În funcție de tipul de injecție, se pot folosi linere split (deschis la ambele capete) sau
splitless (gâtuit jos/închis).