UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI

FARMACIE DIN TÂRGU-MUREŞ

SPECIALIZAREA FARMACIE

ANALIZA MEDICAMENTULUI
CURSUL 8

PROF. DR. DANIELA-LUCIA MUNTEAN

1
 Spectrometria de fluorescenţă
A


Radiaţie Absorbţie Radiaţie Spectrul de
incidentă transmisă absorbţie - excitare

Emisie de
radiaţie
fluorescentă Principiul
spectrometriei de
Semnal fluorescenţă


Spectrul de emisie
2
Schimbările de energie după absorbţia de radiaţie
UV-VIS cu producere de fluorescenţă 3
Lungimea de undă la care se produce absorbţia în urma căreia
apare emisia de radiaţie fluorescentă poartă numele de lungime
de undă de excitare ex, iar lungimea de undă a radiaţiei emise
poartă numele de lungime de undă de emisie em

Semnal măsurat

Excitare Emisie
(Absorbţie)

Lungime de undă, nm

Spectre de excitare şi de emisie (ideal)

4
 Relaţia fluorescenţă - concentraţie

If = K I0 c
unde:
If intensitatea de fluorescenţă
I0 intensitatea radiaţiei incidente
c concentraţia speciei (analitului) fluorescent
K constantă ce caracterizează analitul aflat într-o anumită
matrice.
If corespunde unei perechi de ex şi em
5
 Factori care guvernează proprietatea
de fluorescenţă
 Concentraţia unui compus
fluorescent în soluţie nu
trebuie să fie foarte mare;
de regulă, în vederea
determinărilor de
fluorescenţă, concentraţiile
soluţiilor sunt de 10 – 100
ori mai mici decât cele
corespunzătoare
măsurătorilor Variaţia intensităţii
spectrometrice UV-VIS fluorescenţei cu concentraţia
6
 Factori care guvernează proprietatea
de fluorescenţă
pH-ul influenţează
fluorescenţa 50

Unitati de fluorescenta (T%)

substanţelor cu 45
40
caracter acido-bazic 35
30
25
20
15
10
5
0
0 5 10

Variaţia fluorescenţei
metoclopramidei în funcţie de pH
(ex = 272 nm, em = 356 nm)

7
 Factori care guvernează proprietatea
de fluorescenţă
 Atomii grei în soluţie sting fluorescenţa prin coliziune cu
moleculele excitate (de exemplu, ionii de bromură).
 Solvenţii vâscoşi favorizează fluorescenţa prin
împiedicarea dezactivărilor prin ciocnire.
 Fluorescenţa este dependentă de temperatură deoarece
aceasta favorizează dezexcitările prin coliziune; o moleculă
care nu este fluorescentă la temperatura camerei poate
deveni fluorescentă la temperaturi mai scăzute.
 Formarea complecşilor în soluţie poate modifica
comportarea fluorescentă a unor compuşi. De exemplu,
prezenţa cafeinei în soluţie reduce fluorescenţa riboflavinei.

8
Determinări cantitative

 Aplicaţii cantitative ale

spectrofluorimetriei:
 Metode:
 Metoda standardului extern
 Metoda curbei de calibrare etc.

9
 Principiul determinării cantitative
pe baza standardului extern

Fluorescenţa
Ip în cuva de l
cm

Cuva cu Ipc s
probă cx  f
Is
Fluorescenţa IS
în cuva de l cm unde cx şi cs sunt
concentraţia probei şi,
respectiv, a soluţiei standard;
Cuva cu f factor numeric care ţine
soluţia cont diluţii, modul de
standard exprimare a concentraţiei,
alte transformări
10
Principiul determinării cantitative
prin metoda standardelor externe
(metoda curbei de calibrare)

Ix
cx IA
x
x
IxAx
Probă I=ac+b
x

x
x
I1 I2 I3 … Ii
c1 c2 c3 ci c
cx
cx = (Ix-b)/a; cf = f cx
Serie de
unde cx - concentraţia soluţiei finale de
soluţii analizat; cf – concentraţia probei luate în lucru;
standard a, b – caracteristicile dreptei de calibrare; f
factor numeric care ţine cont diluţii, modul de
exprimare a concentraţiei, alte transformări 11
 Tipuri de probe şi câteva principii practice
de lucru

 Tipuri de probe:
 De regulă lichide şi soluţii lichide
 Concentraţiile soluţiilor analizate – vezi explicaţiile anterioare
 Solvenţii probelor lichide se aleg a.î. aceştia să nu absoarbă
semnificativ la lungimea de undă maximă la care se fac
măsurătorile şi să nu producă stingerea fluorescenţei
 Măsurarea probelor se face faţă de un martor – o soluţie
preparată în acelaşi solvent ca proba şi care conţine aproape
toţi compuşii probei, cu excepţia substanţei de analizat. Prin
folosirea martorului, se scade din fluorescenţa probei,
semnalul datorat celorlalţi compuşi prezenţi în probă.
 Cuvele în care se introduc probele:
 Sunt confecţionate din materiale care nu absorb în UV-VIS şi au toate
feţele transparente. Ex.:
 Cuarţ – domeniul UV-VIS
 Lăţimea cuvelor – de regulă, 1 cm 12
 Cuvă de
fluorescenţă

13
 Aparatură

Schema de principiu a unui spectrometru de fluorescenţă

După http://www.chemicool.com/img1/graphics/fluor-schematic.gif
14