SPECTROMETRIA DE ABSORBŢIE MOLECULARĂ ÎN

DOMENIUL VIZIBIL ŞI ULTRAVIOLET

 Analiza
cantitativă

➢ Înălţimea curbei şi
➢ Suprafaţa încadrată de curbă
➢ Selectivitatea unui maxim de absorbţie este dată de lăţimea
reprezintă caracteristici cantitative care
picului la bază (sau benzii spectrale), notată X.
servesc la determinarea concentraţiei
substanţelor din probe. ➢ Cu cât picurile sunt mai înguste se pot mai bine deosebi două
substanţe cu spectre având aspecte apropiate.
➢ Analiza chimică cantitativă în
spectrofotometria de absorbţie se ➢ Tot pentru a se evita suprapunerile, în cazul existenţei mai
bazează pe legea Lambert-Beer. multor maxime de absorbţie, se preferă lucrul la maximele
de absorbţie cu lungimile de undă cele mai mari.
➢ Se utilizează o curbă de calibrare (etalonare): A = f(C), trasată pentru probe de concentraţii cunoscute, în
aceleaşi condiţii cu cele de analizat, lucrându-se cu aceeaşi celulă şi la o lungime de undă cât mai riguros
monocromatică.

➢ Se alege un domeniu de concentraţii, în care se pregătesc 5-8 probe de concentrație exact cunoscută şi după
stabilirea dependenţei A = f(C) grafic sau sau analitic, se poate trece la analiza cantitativă.

➢ Curba de etalonare trebuie trasată pe domeniul liniar de concentrații. Domeniul pe care curba de etalonare este
perfect liniară nu este foarte larg (de cel mult o decadă de concentraţii). De aceea metoda nu poate funcţiona
decât strict pe domeniul pentru care a fost trasată şi, cel mai corect, pe porţiunea de la jumătatea dreptei.

➢ Se fac mai multe citiri. Cu cât eroarea la determinarea absorbanţei este mai mică cu atât eroarea de
determinare a concentraţiei va fi mai coborâtă.

➢ Panta curbei este decisivă în mărimea erorii. Dacă aceasta este foarte mică, eroarea la determinarea
concentraţiei va creşte.

▪ Soluţiile foarte colorate duc la erori datorită aplatizării curbei la concentraţii ridicate şi ca urmare
conţinuturile nu pot fi determinate exact, recurgându-se la diluări.

▪ Dacă diluţia este prea mare apare o creştere a erorii tocmai datorită diluării. În concluzie, concentraţiile
soluţiilor măsurate trebuie să fie relativ joase.
 ➢ Pentru lungimea de undă λmax = 610nm, valorile
absorbanţei s-au notat A1, A2, ..., A5.

➢ Acestea au fost reprezentate în coordonate A = f(c);

➢ În conformitate cu legea Lambert-Beer, toate se înscriu pe o

dreaptă care este curba de etalonare şi serveşte la analiza
cantitativă.

➢ Nu întotdeauna punctele se situează toate, în mod riguros,

pe o dreaptă deoarece intervin erori experimentale şi din
acelaşi motiv, în practică, dreapta nu trece exact prin
origine.

Spectrele de absorbţie pentru mai multe

concentraţii (C1, C2, ... C5) ale aceleiaşi
substanţe în soluţie, Co(NO3)2.
REGULI PRACTICE
foarte importante pentru respectarea legii lui Lambert-Beer şi totodată pentru
obţinerea de rezultate analitice corecte:

❖ soluţiile trebuie să fie limpezi (fără suspensii) şi să nu fie fluorescente;

❖ în soluţiile supuse măsurătorilor nu trebuie să se petreacă transformări fotochimice sau reacţii cu oxigenul
din aer;

❖ substanţa de analizat nu trebuie să dea asociaţii, cu compoziţii variabile, cu solventul;

❖ punctele trebuie să se situeze cât mai riguros pe aceeaşi dreaptă şi prelungirea dreptei să treacă cât mai
aproape punctul de coordonate (0,0);

❖ absorbanţa măsurată pentru proba necunoscută, Ax, trebuie, pe cât posibil, să se situeze pe porţiunea din
mijloc a domeniului punctelor de etalonare.
 Determinarea cantiativă simultană a soluțiilor bicomponent

Se poate utiliza legea lui Lambert-Beer şi pentru determinarea concentraţiei a două specii diferite, X şi Y,
aflate în aceeaşi soluţie.

Se utilizează două lungimi de undă diferite, λ1 şi λ2 dar pentru oricare dintre acestea:

Atotal(λ) = AX(λ) + AY(λ).

Cu alte cuvinte măsurând absorbanţa amestecului la lungimea de undă λ1 , notată A(λ1) şi la lungimea de
undă λ2, notată A(λ2) , se obţine:

A(λ1) = εX(λ1)CXl + εY(λ1)CYl

A(λ2) = εX(λ2)CXl + εY(λ2)CYl

adică un sistem de două ecuaţii cu două necunoscute - concentraţiile CX şi CY.

Prin rezolvarea algebrică a sistemului de ecuaţii (l - lăţimea celulei fiind constantă), se pot obţine valorile CX
şi CY , adică se pot calcula concentraţiile necunoscute.
 Determinarea cantiativă a proteinelor

Se poate face o determinare cantitativă a proteinelor pe baza absorbţiei de la 190-220 nm datorată legăturii
peptidice, dar foarte multe alte substanţe pot interfera, absorbind radiaţii la această lungime de undă.

Dintre aminoacizi, cei aromatici absorb la lungimi de undă mai mari de 230 nm, iar spectrele lor sunt
suficient de diferite între ele pentru a se putea determina spectrometric cantitatea prezentă din fiecare într-o
proteină. Se poate face şi o caracterizare a moleculei de proteină pe baza structurii fine a benzilor de absorbţie
datorate ciclurilor aromatice, deoarece aceasta diferă de la o proteină la alta, în special în cazul fenilalaninei.

Se constată că maximul
de absorbţie datorită
aminoacidului este
deplasat în proteină
ceea ce nu împiedică
efectuarea unei
determinări cantitative.
Proteinele pot fi determinate cantitativ pe baza Prin spectrometrie în vizibil proteinele mai pot fi
complexului pe care îl formează cu ionul de determinate cantitativ, pe baza proprietăţii pe care o au
cupru(II) prin grupările -NH- din legătura
de a lega anumiţi coloranţi, cum ar fi verde de
peptidică (reacţia biuretului).
➢ Complexul prezintă maxime de absorbţie la bromcrezol şi purpura de bromcrezol.
330 nm şi 540 nm.
Pentru efectuarea determinărilor este necesar un
➢ Toate proteinele reacţionează într-un mod
asemănător, fiind foarte mici diferenţe de la o foarte strict control al pH-ului.
proteină la alta.

verde de bromcrezol
Când compusul de analizat nu absoarbe radiaţii din domeniul în care se lucrează, se obţine mai întâi un derivat
colorat al acestuia care absoarbe la lungime de undă specifică.

Creatinina din sânge reacţionează cu ionul picrat, în mediu alcalin (pentru a diminua formațiunile de culoare non-
specifică a proteinelor și carbohidraților) și oxidant (fericianura de potasiu – pentru a preveni interferența
bilirubinei), formând un produs colorat în roșu care absoarbe la 490 nm, (reacția Jaffe). Triglicerinele cu o
concentrație sub 2mg/ml nu intervin.

acid picric

Drogurile influențează nivelurile de creatinină din sânge!

Un mare număr de ioni metalici formează cu o serie de reactivi organici (ditizona, oxina, dietilditiocarbamatul de
sodiu etc.) complecşi coloraţi pe baza cărora pot fi determinaţi.
Multe reacţii enzimatice pot fi urmărite pe baza unor determinări de absorbanţă.
Acidul uric este oxidat în
prezența uricazei la
alantoină cu formare de
peroxid de hidrogen (H2O2).
Acesta, în prezența
peroxidazei, reacționează cu
4-aminoantipirina (4-AA) și
2,4 diclorofenolsulfonat
(DCPS) cu formarea
chinoniminei de culoare
roșie care are un maxim de
absorbție la lungimea de
undă 505 nm.
Glucoza din sânge este oxidată în
prezența glucozoxidazei la acid
gluconic, cu formare de peroxid de
hidrogen (H2O2).
Acesta, în prezența peroxidazei,
reacționează cu 4-aminoantipirina
(4-AA) și fenol cu formarea
chinoniminei de culoare roșie care
are un maxim de absorbție la
lungimea de undă 505 nm.
SPECTROMETRIA DE FLUORESCENŢĂ ŞI
FOSFORESCENŢĂ MOLECULARĂ
➢ Fluorescenţa şi fosforescenţa constau în re-emisia de energie radiantă după un proces de absorbţie.

➢ Determinările fluorimetrice se fac de obicei la temperatura obişnuită, în soluție; fosforescenţa este studiată
la temperaturi foarte scăzute, în medii rigide (îngheţate).

➢ Intensitatea radiaţiilor emise prin fluorescenţă şi fosforescenţă (dar nu şi poziţia spectrului emis) depinde
de lungimea de undă a radiaţiei excitatoare. Maximul radiaţiei de fluorescenţă este situat de obicei la o
valoare a lungimii de undă mai mare decât maximul picului radiaţiei care a provocat excitarea (de
absorbție), diferenţa de energie corespunzătoare transformându-se în căldură, fiind disipată în mediu.
Emisia de fosforescenţă are loc de obicei la lungimi de undă mai mari (energii mai mici) decât emisia de
fluorescenţă.

➢ Spectrele de fluorescenţă şi fosforescenţă, pentru o anumită substanţă, sunt frecvent imaginea în oglindă
a spectrului de absorbţie.

➢ În practică fluorimetria este utilizată mai mult decât fosforimetria, necesitând o aparatură mai simplă.

Principiul
metodei
➢ Se măsoarăra parametrii fluorescenței sau
fosforescenței spectrului vizibil:
•intensitatea
•distribuția lungimii de undă a spectrului
de emisie
după excitarea de către un anumit spectru de
lumină.
➢ Acești parametri sunt folosiți pentru a
identifica prezența și cantitatea de molecule
specifice într-un mediu.
➢ Fluorometrele moderne sunt capabile să
detecteze concentrațiile de molecule
fluorescente de 1 ppt.
▪ Fluorescența sau fosforescenta studiază tranzițiile electronice și
vibraționale.
▪ Specia este mai întâi excitată, absorbind un foton, și trece de la starea
fundamentală la una dintre diferitele stări vibraționale din starea
electronică excitată. Coliziunile cu alte molecule fac ca molecula excitată
să piardă energie vibrațională până când ajunge la cea mai mică stare
vibrațională din starea electronică excitată (vezi și diagrama Jablonski,
curs 4-5).
▪ Molecula apoi coboară până la unul dintre diferitele niveluri vibraționale
ale stării electronice fundamentale în două moduri:
- direct, emițând un foton (fluorescență)
- Inversând spinul (crossing inter-sistem) si trecând în starea de triplet
și de aici în unul din nivelurile vibraționale ale starii fundamentale
(fosforescență)
▪ Deoarece moleculele pot trece din oricare dintre nivelurile vibraționale în
starea fundamentală, fotonii emiși vor avea energii, respective frecvențe,
diferite.
▪ Analizând diferitele frecvențe ale luminii emise și intensitățile relative ale
acestora, se poate determina structura diferitelor niveluri vibraționale.
 Trebuie făcută o distincţie între:
• fluorescenţă - care corespunde unei
scăderi rapide a intensităţii luminoase
emise  fluorimetria lucrează în regim
staţionar - excitarea având loc pe tot
parcursul măsurătorii
• fosforescenţă - la care scăderea în timp a
intensității este cu mult mai lentă  se
studiază doar după ce a încetat faza de
excitare.
Ca urmare, o specie moleculară poate fi,
deodată, atât fluorescentă cât şi
fosforescentă.

*** luminescenţa este tot o reemisie de lumină dar aceasta are la origine energia unei reacţii. Această
energie nu se degajă sub formă de căldură (ca în majoritatea cazurilor) ci sub formă de energie radiantă.
Se poate considera ca o excitare a electronilor cu ajutorul căldurii de reacţie. Nu trebuie confundată cu
fosforescența, deși tranzițiile electronice care o produc sunt tot între stari de multiplicitate diferită!
Fluorescenţa, implică emisia de radiaţie prin tranziţia între două niveluri care au aceeaşi multiplicitate (de
exemplu singlet la singlet sau triplet la triplet).
S0+h → S1 → S0+h’
Metodele de analiză bazată pe fluorescenţă nu sunt general aplicabile oricăror substanţe. Dar, toate metodele
analitice bazate pe fluorescenţă pe lângă că sunt foarte specifice sunt şi foarte sensibile. De exemplu, limita de
determinare a unei metode fluorimetrice, pentru o anumită combinaţie chimică, este de circa 1000 de ori mai mică
decât cea a unei metode prin absorbţie în Vis sau UV.

Fosforescenţa, implică emisia de radiaţie prin tranziţia între două niveluri de multiplicitate diferită.

S0+h → S1 →T1 → S0+h’

După faza de absorbţie o dată cu transferul unui electron pe nivelul S1 (prima stare electronică excitată după cea
fundamentală - o stare de singlet) are loc, dacă relaxarea vibraţională se produce suficient de lent, modificarea
spinului electronului la o stare de triplet, notat T1, ceva mai stabilă (metastabilă). Din acest motiv, revenirea la
starea fundamentală este încetinită, deoarece implică o nouă modificare de spin a acestui electron. Ca urmare,
durata stării excitate în fosforescenţă poate fi și de 108 ori mai mare decât în fluorescenţă.
 Există două tipuri de fluorometre de bază, fluorometrul de filtrare și
Principiul spectrofluorometru. Diferența dintre ele este modul în care selectează
aparaturii lungimile de undă ale luminii incidente. Un fluorometru de filtrare va
utiliza filtre, în timp ce un spectrofluorometru va folosi monocromatoare
de grătare.
Fluorometrele cu filtru sunt adesea achiziționate / construite la un cost
mai mic, dar sunt mai puțin sensibile și au o rezoluție mai mică decât
spectrofluorometre.
Ambele tipuri folosesc următoarea schemă:
➢ lumina dintr-o sursă de excitație trece printr-un filtru sau
monocromator și lovește proba.
➢ o parte din lumina incidentă este absorbită de probă și unele dintre
moleculele din probă devin fluorescente.
Schema bloc a unui fluorimetru ➢ lumina fluorescentă este emisă în toate direcțiile.
➢ o parte din această lumină fluorescentă trece printr-un al doilea filtru
sau monocromator și ajunge la un detector, care este de obicei
plasat la 90 ° față de fasciculul de lumină incident pentru a reduce
riscul ca lumina care ajunge la detector să se piardă prin transmisie
sau reflexie.
 Sursa de radiaţii poate fi:

lampă cu xenon.
are un spectru de emisie
continuă, cu o intensitate
aproape constantă în intervalul
de la 300-800 nm și o iradiere
suficientă pentru măsurători lampă cu vapori de mercur
până la puțin peste 200 nm. emite lumină în apropierea lungimilor de
undă de peak

Ambele surse emit intens în domeniul UV al spectrului.

Filtrul dispus între sursă și probă permite trecerea unor radiaţii excitatoare de anumite lungimi de undă,
Filtrul dispus între probă și detector permite trecerea radiaţiei de fluore scenţă.

Semnalul produs de detector este un curent proporţional cu intensitatea radiaţiei de fluorescenţă și este
amplificat sau acţionează direct sistemul de evaluare (un instrument de măsură, un înregistrator).
 Proba - se află în mediu rigid, la temperaturi
criogenice, ceea ce implică utilizarea unor solventi
cu proprietăți speciale precum:
- Să permită buna soluilizare a probei
- Să formeze o sticlă transparentă la 77K
(temperatura de măsură)
- Să fie foarte pur

Fosforimetru – schema bloc Etanolul – pentru molecule polare, pate necesita un

Fosforoscop mic adaos de acid sau bază pentru a produce o
fază solidă transparentă
Un fosforimetru are în plus:
- un dispozitiv optic care permite separarea radiației de Dietileter - izopentan – etanol (5:5:2) EPA – foarte
fluorescență de cea de fosforescență (fosforoscop) indicat pentru compuși nepolari
urmat de măsurarea radiaţiei de fosforescenţă.
- Un sistem de răcire a probei de analizat la temperatura
azotului lichid.
 Reguli privind legătura dintre structura compuşilor organici şi
fluorescenţa acestora:
Analiza
calitativă ✓ Moleculele organice care nu absorb puternic lumina peste 200 nm în
general nu sunt fluorescente.
✓ Moleculele care au banda de absorbţie corespunzătoare tranziţiei:
Fluorescenţa apare în general pentru S0→S1 localizată la λ = 250nm şi pentru care absorbţia luminii se
molecule aromatice şi heterociclice datoreşte unei tranziţii (π → π*) sunt fluorescente.
sau care conţin mai multe duble
✓ Substituenţii - donori de electroni care delocalizează electronii π -
legături conjugate.
grefaţi pe un sistem π-delocalizat măresc întotdeauna absorbţia
Ambele clase de substanţe au luminii, intensificând fluorescenţa deoarece măreşte probabilitatea
electroni delocalizaţi care pot fi trecuţi tranziţiei între starea de singlet cu energia cea mai mică şi starea
în stări excitate de singlet cu energie fundamentală. De exemplu, funcţiunile: -OH > -OR > -NH2.
mică (tranziţii π → π*) ✓ Grupele funcţionale: -Cl, -Br, -I, -NO2 sau -COOH puternic
atragătoare de electroni (grefate la sistemul π → π*) tind să reducă
sau să stingă fluorescenţa moleculei respective. În plus prezenţa,
alături de acestea, a unor grupări donoare de electroni, tinde să
diminueze fluorescenţa (şi nu să o intensifice).
✓ Rigiditatea moleculei are ca efect o creştere a fluorescenţei
acesteia, reducând amplitudinea vibraţiilor care de fapt
determină tranziţiile neradiative.
• De exemplu, fluoresceina şi eozina au structură rigidă
și sunt puternic fluorescente
• Fenolftaleina, care nu are o structură rigidă şi pentru
Fluoresceină Eozină
care sistemul conjugat este întrerupt, nu este
fluorescentă.
• Formarea chelaţilor cu ionii metalici determină frecvent
apariţia fenomenului de fluorescenţă deoarece creşte Fenolftaleină

rigiditatea moleculei şi micşorează vibraţiile interne.

✓ pH-ul influenţează fluorescenţa modificând structura anumitor molecule prin fenomene de disociere sau
protonare.
✓ Oxigenul molecular dizolvat precum şi unii ioni metalici pot determina fenomenul de stingere a fluorescenţei.
✓ Scăderea temperaturii determină de obicei o creştere a intensităţii fluorescenţei deoarece procesele competitive
neradiative (prin care se pierde energia stării excitate) decurg cu o viteză mai mică la temperaturi coborâte
Moleculele organice care au cel puţin două
legături π conjugate şi conţin o bandă de • De exemplu, compuşii moleculari ciclici cu sisteme π conjugate sau care
posedă grupări funcţionale donoare de electroni, se pretează foarte bine la
absorbţie la λ > 200nm, cu un coeficient
acest tip de determinări.
de absorbţie ε ≥ 103L·mol-1·cm-1, prezintă
fluorescenţă şi pot fi analizate fluorimetric.