Universitatea Titu Maiorescu

Facultatea de Medicină Dentară

BIOCHIMIE - anul I; semestrul al II-lea

Spectrofotometria
Spectrofotometria este o ramură a spectrometriei care se ocupă cu măsurarea cantitativă
a proprietăților de reflexie sau de transmisie ale unui material (substanță) în funcție de lungimea
de undă.
Metoda se bazează pe proprietatea de absorbție sau de transmisie a compușilor chimici
la o diverse lungimi de undă. Astfel spectrofotometria este folosită atât ca metodă calitativă
pentru identificarea prezenței unei substanțe într-o soluție, cât și cantitativă pentru
determinarea concentrației unei substanțe dintr-o soluție.
Din punct de vedere spectrofotometric, determinarea concentrațiilor reactanților și
produșilor de reacție presupune măsurarea luminii transmise de către soluție. Orice compus
chimic absoarbe, transmite sau reflectă lumina (radiația electromagnetică) în cadrul unui
interval de lungimi de undă. Aparatele destinate acestor măsurători se numesc
spectrofotometre.
Spectrofotometrul este un instrument capabil să măsoare cu precizie cantitatea de fotoni
(intensitatea luminii) absorbită de trecerea lor printr-o probă (soluție). Astfel, se poate
determina indirect și cantitatea de substanță (concentrația).
În funcție de spectrul lungimilor de undă pe care le emite sursa de lumină,
spectrofotometria are două variante:
• UV/VIS – utilizează lungimi de undă cuprinse între 185 – 400 nm (UV) și 400
– 750 nm (VIS).
• IR – utilizează lungimi de undă cuprinse între 750 nm – 1000 µm.

Figura 1. Spectrul electromagnetic (fiecare undă electromagnetică prezintă o lungime

de undă specifică, aparținând unui anumit interval caracteristic pentru fiecare tip de
radiație).

1
Universitatea Titu Maiorescu
Facultatea de Medicină Dentară
BIOCHIMIE - anul I; semestrul al II-lea

Principiul spectrofotometriei UV/VIS se bazează pe legea Lambert-Beer: cantitatea de

lumină absorbită de o soluție este expresia unei funcții exponențiale a concentrației și a
lungimii de undă în raport cu acea soluție. Altfel spus, la trecerea unui fascicul de lumină
monocromatică de intensitate I0 printr-o soluție omogenă, intensitatea luminii transmise It este
mai mică, deoarece o parte din intensitatea fasciculului este reflectată (Ir) și absorbită (Ia) de
soluție: It = I0 – (Ir + Ia).
Legea lui Lambert-Beer: It = I0 𝒆−𝒌𝑪𝒍
ln (It / I0) = kCl → A = kCl, unde:
k = coeficientul molar de extincție (absorbanță);
l = lungimea drumului optic (grosimea stratului străbătut / lungimea cuvei);
C = concentrația probei.
Pentru C exprimată în [mol/L] coeficientul molar de extincție se notează ε, iar forma
generală a legii Lambert-Beer este A = εlC.

Figura 2. Forma exponențială a legii Lambert-Beer

2
Universitatea Titu Maiorescu
Facultatea de Medicină Dentară
BIOCHIMIE - anul I; semestrul al II-lea

Utilizarea măsurătorilor spectrofotometrice pentru stabilirea concentrației unei

anumite substanțe aflate în soluție

a. Se reprezintă grafic extincția în funcție de concentrațiile diferite ale substanței aflate în

soluție. Se determină extincția probei (EP). Prin extrapolare se află concentrația
necunoscută (CP).

b. Se utilizează o soluție standard de concentrație cunoscută (CS). CP este concentrația

necunoscută. Conform legii Lambert-Beer:

CP / CS = EP /ES → CP = CS x EP / ES