-Amilaze

1.Introducere -Amilazele sunt endoglucanaze care catalizeaz hidroliza legturilor glicozidice n amidon i n polizaharidele nrudite cu formarea de dextrine i oligozaharide cu formula C 1-OH n configuraia .Legturile -1,4-glicozidice lng legturile -1,6 sunt rezistente la hidroliz.

Hidroliza extins a amilopectinelor cu -amilazele ,produc dextrine -limit n urma hidrolizei legturilor -1,6.-Amilazele joac un rol important n metabolismul glucidic al microorganismelor,plantelor i animalelor. -Amilazele microbiene deriv din Bacillus lichenformis sau din organismele nrudite pentru aplicaiile comerciale;sunt stabile la temperaturi de peste 90oC,relativ mai puin dependente de ionii de Ca2+i active pe o raz larg a pH-ului. -Amilazele pentru procesarea alimentelor sunt obinute prin fermentaia controlat a lui Bacillus stearothermophillus ,Bacillus subtilis,ce conine Bacillus megaterium sau Bacillus sterarothermophillus specie productoare de -amilaz,ca o pudr sau un lichid de culoare albmaroniu. Aplicaiile tipice includ prepararea de sirop de amidon,dextroz,alcool,bere i produse de patiserie. -Amilazele sunt folosite n industrie la lichefierea amidonului cu producere de dextrine care sunt hidrolizate de glucoamilaze n glucoz ,ingredientul de baz pentru siropul de porumb,etanol carburant sau n producia de buturi alcoolice. n industria patiseriei -amilazele sunt adugate n aluat pentru a asigura o surs continu de zahr fermentescibil pentru creterea fermentaiei i a producerii de gaze. -amilaza este una dintre enzimele ncorporate n detergenii de rufe pentru indeprtarea petelor persistente de pe materiale i pentru a spori eficiena i reducerea agenilor chimici din compoziia detergenilor.

II.Clasificare Glucozidazele sunt clasificate n hidrolaze care sunt subdivizate n :O-glicozil;N-glicozil i S-glicozil (E.C.3.2.1.,3.2.2 i 3.2.3). -Amilaza hidrolizeaz legturile -1,4-D-glicozidice din oligozaharide i polizaharide ntr-o manier aleatoare cu gruprile reductoare eliberate n configuraie .

n conformitate cu recomandrile IUBMB ,-amilazele au denumirea sistematic de 1,4-glucanglucohidrolaz i numr de cod EC 3.2.11.Aceast clasificare este bazat pe tipul reaciei catalizate i pe substraturile specifice a enzimelor individuale. Recent, a fost propus o clasificare alternativ a glicozilhidrolazelor bazat pe similaritatea secvenei de aminoacizi.Conform cu aceast clasificare sunt 70 de familii i majoritatea 3.2.1.93). Oricum -amilaza din Dictyoglomus thermophilum, Methanococcus jannaschii, Pyrococcus furiosus, i Pyrococcus horikoshii aparin familiei 57.Aceast clasificare se bazeaz pe reacia direct dintre secven i similaritile plierii i ofer un instrument convenabil pentru estimarea informaiei mecanice. Cu toate acestea, clasificarea bazat pe asemnrile structurale i de secven pot cauza o confuzie inutil, deoarece n acest regim,o enzim este definit de ctre secvena principal ca o protein, dar nu n mod direct de ctre funciile sale catalitice. -amilazelor aparin familiei 13 , impreun cu pullulanaz (EC 3.2.141),ciclomaltodextrin glucanotransferaza (EC 2.4.1.19) i trehaloz-6-fosfathidrolaza(EC

III.Structur molecular Numeroase secvene de aminoacizi de -amilaze sunt cunoscute, n primul rnd deduse dinsecvene de ADN. Un total de 70 de intrri sunt listate n Swiss-Prot: Aeromonas hydrophila, Alteromonas haloplanktis, Dictyoglomus thermophilum, Escherichia coli, Bacillus amyloliquefaciens,B. megaterium, Bacillus sp. (strain B1018), B. circulans, B. stearothermophilus, B. licheniformis, B.subtilis, Paenibacillus polymyxa (Bacillus polymyxa), Butryrivibrio fibrisolvens, Methanococcus jannaschii, Streptomyces lividans, S. violaceus (Streptomyces venezuelae), S. griseus, S. limosus (Streptomyces albidoflavus), S. hygroscopicus, S. thermoviolaceus, Clostridium acetobutylicum, T. Thermoanaerobacter ethanolicus thermosulfurogenes (Clostridium T. thermosulfurogenes), (Clostridium thermohydrosulfuricum),

thermohydrosulfuricus Thermomonospora

(Clostrium curvata,

thermohydrosulfuricum), furiosus, P.

T.

saccharolyticum, Salmonella

Pyrococcus

horikoshii,

typhimurium,Aspergillus niger, A awamori, A. oryzae, A. shirousami, Schizosaccharomyces pombe (drojdie de fisiune), Saccharomycopsis fibuligera (drojdie de bere), Debaryomyces occidentalis (yeast) (Schwanniomyces occidentalis), Oryza sativa (orez), Triticum aestivum (grau), Hordeum vulgare (barley), Vigna mungo (rice bean) (black gram), Drosophila melanogaster (fruit fly), D. mauritiana, D.yakuba, Aedes aegypti (yellow fever mosquito), Dermatophagoides pteronyssinus (praf de acarian),Tribolium castaneum (gandac rou de fin), Pecten maximum (king scallop) (pilgrims clam), Tenebrio molitor (yellow mealworm), Sus scrofa (pig), Homo sapiens (human), Rattus norvegicus (rat), and Mus musculus (mouse). Secvene de - amilaze de diferite origini au foarte puine asemnri perceptibile, cu excepia a patru segmente (5-15)(Fig. 1). Trei reziduurile catalitice (dou Asp i unul de Glu ), precum i reziduuri implicate n substrate obligatorii, sunt situate n aceste patru regiunile intens conservate care sunt, de asemenea, gsite n GGTase (Bacillus macerans), pullulanase (Klebsiella aerogenes), isoamylase(Psudomonas amyloderamosa), - glucozidaza(Saccharomyces carlsbergenesis), i cyclodextrinase(Thermoanaerobacter ethanolicus), sugernd c aceste enzime pot participa n acelai tip de mecanism de reacie (16). Cteva amilaze microbieneBacillus circulans (17), Bacillus subtilis (18),Bacillus stearothermophilus (19), Streptomyces limosus(20), Chalara paradoxa (21), Lactobacillus amylovorus(22), i Cryptococcus sp. S-2 (23) sunt cunoscute nu doar pentru digestia granulei de amidon solubil,dar si pentru digestia amidonului granulat. n plus, amilaza din pancreasul de porcine (24) i amilaza din orz (25) conin segmente de C-terminal care au fost identificate pentru a fi a raw starchbinding site .

Fig .1 Comparaie ntre regiunile de secven dintre : Bacillus stearothermophilus (5), Bacillus amyloliquefaciens (6),Bacillus licheniformis (7), Aspergillus oryzae (8), Micrococcus sp. 207 (9), Saccharomycopsis fibuligera (10),Drosophila melanogaster (fructe )(12), galben de mealworm (13), pancreas de porcine (14), pancreas uman (15).

IV.Mecanism de reacie -Amilazele hidrolizeaz legtura glicozidic prin retenia configuraiei

anomerice.Aciunile de retenie i invertire a glicozidazelor au fost subiectul a numeroase cercetri i , cteva mecanisme au fost propuse s explice stereochimia procesului catalitic. A.Mecanismul deplasrii nucleofilice Pentru retenia glicozidazelor ,reacia precede 2 deplasri.Protonarea oxigenului glicozidic exte concentrat pe atacul nucleofilic al anionului carboxilat la C1,rezultnd o legtur covalent glicozil-enzim intermediar (fig.3).A 2-a configuraia . deplasare este bazat pe hidroliza legturilor carboxil-acetal i glicozil-enzim intermediar cu formare de dextrin ca produs n

Pentru invertirea glicozidazei ,reacia implic o singur deplasare.Oxigenul glicozidic este protonat de acidul general,rezultnd o legtur maltozica C-O.

Figure 3 (A) mecanismul unei singure deplasri;(B)Mecanismul dublei deplasri cu formarea de enzima glicozidic intermediar

B.Mecanismul ionului deoxocarbon n acest model ,reacia este descris de substituia SN1 (fig,4).Protonul de oxigen glicozidic rezultat din hidroliza legaturilor ,duce la formarea unui ion de oxocarbon intermediar care este stabilizat de reziduuri de anion carbozilat(46-48).De asemenea,s-a sugerat c mbinarea dintre substratul de zahr cu poziia activ a enzimei induce o denaturare a lanului poliglucidic ntr-o conformaie de tip jumtate de scaun,astfel slbind legturile C1-O4 cum este artat n cazul lizoenzimei.Stereoselectivitatea reaciei depinde de direcia atacului nucleofilic a moleculelor de ap asistat de o baz general.n -amilaz ,molecula de ap atac din fa (partea original a oxigenului glicozidic),cu produsul meninnd configuraia .n invertirea glicozidazelor , i -

amilaza i glucozidaza,atac din spate ,rezultnd ntr-o inversie a configurrii.Aspectul atrgtor al acestui model este c reaciile catalitice de invertire i de rsturnare apoate fi explicat printr-un singur mecanism(50). Principala diferen ntre acest model i mecanismul de deplasare const n miscarea tranzitorie sau stabil a ionului intermediar de oxocarbonium existent(51,52). Formarea unui ion stabil de oxocarbon este de preferat n cazul in care ruperea legturii precede un atac al apei facilitat de cataliza general.

Fig.4Mecanismul de reacie a carbohidrailor care implic o molecul de oxocarbon intermediar C. Ring-Opening Reaction-Reacia de deschidere a inelului Un mecanism alternativ, care nu a fost bine primit ca cele dou modele de mai sus ;implic hidroliza legturi C-O endociclic ,ducnd la formarea de ion oxocarbon intermediar aciclic. n acest model nu exist nici o denaturare a substratului aa cum se arat n simularea moleculei dinamice. n conformaie scaun att ct i -anomerii, antiperiplanara orientare exocyclic la O4 pereche izolat ndeplinete cerina stereoelectronic n fragmentarea inelul C-O legtur (54). A fost postulat, de asemenea, c protonarea are loc la oxigen ciclic n loc de oxigen glicozidic ,iar atacul nucleofilic din ap este urmat de o rotaie a centrului de hemiacetal la poziia de hidroliz.(55)

MSURAREA ACTIVITII AMILAZEI Parametrii cinetici ai -enzimei din orz au fost msurate cu ajutorul diferitelor concentraii de substrat ET-G7PNP. La Km of 0.45 mM i o kcat of 1,2 *10 2 *sec_1 au fost obinute pentru amilaz, o kcat=Km of 2.7 102mM_1 *sec_1. .-Amilaza din malul de orz 1 are o valoare a kcat=Km 1.75 102mM
_1

*sec_1 folosind ca substrat p-nitrofeniloligozaharidele (p-NPGlc7),

(78). Eficiena catalitic este, n general, n concordan cu cele obinute de -amilaze de la alte organisme.De exemplu, o kcat=Km of 2.5 102mM _1 *sec_1 a fost raportat pentru -amilaza din Saccharomycopsis fibuligera n hidroliza malto-oligozaharidelor (79), i o valoare mai mare de 1.3 *103mM_1 *sec_1 a fost observat pentru acelai enzima folosind ca substart -amiloz (80).-Amilaza din pancreasul de porcine a fost de kcat=Km of 5.8 10 3mM_1 * sec_1 cu hidroliza p-NPGlc7(81). Creterea lungimii lanului de substrat scade valoarea km i crete kcat, aa cum s-a demonstrat n enzima din Aspergillus oryzae Km=9,010-4 i 9,510-6 mM pentru maltotetroz i maltodextrin VI (n=117),respectiv ,i kcat=1,2104 i 103min-1(82). Metoda de msurare a activitii -amilazei este caracterizat de tipul de substrat angajat ntr-o procedur special. Toate cele trei metode descrise mai jos au fost utilizate in mod curent de ctre autori pentru analiza cantitativ a plantelor i -amilazelor recombinate. A. Reducing Sugar Method-Metoda de reducere a zaharurilor B. Dyed Starch Substrate Method-Metoda folosind ca substrat amidon colorat Aceast procedur presupune hidroliza amidonului colorat ca substrat de-amilaz i msurarea absorbanei la 610 nm a fragmentelor solubile colorate eliberate n soluie de degradare a substratului. Aceast metod nu este afectat de reducerea substanelor i, prin urmare, se aplic n special la msurare activitii a-amilazei in culturi de celule care conin glucoz sau alte zaharuri reductoare.Sunt disponibile dou tipuri de substrat de amidon colorat n comer:

1. Dye-Labeled Crosslinked Starch -Amidon reticulat colorat 2. Dye-Labeled Non-crosslinked Starch-Amidon nereticulat colorat C. Defined Substrate Method-Metoda substratului definit Utilizarea de low-MW oligozaharide sintetice, cu o structura definit are avantajul de eliminare a variabilitii substratului. Cu toate acestea, acestea nu sunt substraturi naturale i msurarea activitii pot s nu dezvluie unele proprieti unice ale enzimei,ca i legarea amidonului crud i hidrolizat.Substraturile definite au fost iniial dezvoltate cu un cromofor ca p-nitrofenol ataat la unitile de glucoz redus. Aceste substraturi, cu toate acestea, sunt nespecifice pentru -amilaze, fr alte amilaze, cum ar fi -amilaze sau glucoamylase, care pot de asemenea sa despice substratul.Foarte recent,un substrat specific a fost descoperit prin fixarea suplimentar a unui produs la resturile de glucoz nereductoare(93, 94).Am folosit 4,6-etiliden-(G7)-p-nitrofenil-(G1)--D-maltoheptasid(Sigma) ca substrat.Gruparea etilidenic n poziia 4,6 a G7 blocheaz aciunea exoamilazelor.-Amilaza hidrolizeaz substratul fragmentelor de G2,G3 i G4-p-nitrofenol,care au fost mai departe hidrolizate de -glucozidaz la p-nitrofenol i glucoz.Activitatea enzimei corespunde creterii absorbanei la 405 nm din cauza eliberrii de p-nitrofenol,i de blocarea neasteptata a substratului la capetele nereductoare la aciunea -amilazei i glucoamilazei. VII.Purificarea -amilazei Aceast metod ,descris de Mac Gregor i Morgon (95), a fost folosit n laboratoarele noastre pentru a purifica -amilaza din orz.Malul de orz (250 g) a fost extras cu 500 ml tampon acetat ce conine 1 nM CaCl2,pH=5,5.Suspensia a fost centrifugat (8000 g,15 minute) i granulaia a fost supus la o a doua extracie folosind acelai tampon. Extractele combinate (supernatanii) au fost nclzite la 70 oC pentru 15 minute i proteinele denaturate incluznd -amilaza au fost scoase de la centrifugare (8000 g,15 minute).Proteinele din supernatant au fost precipitate cu 60%( NH 4)2SO4 la 4 oC ,redizolvate n 200 ml de tampon acetat 0,02M ce conine 1nM CaCL2 ,pH=4,7 i diluat cu acelai tampon.Preparatul enzimei brute a fost ncrcat ntr-o coloan CM Sepharose CL-6B echilibrat cu acelai tampon.Diluia a fost fcut folosind o curb etalon de la 0,02 M pn la 0,06 M acetat

(coninnd 1mM CaCl2,pH=4,7) i fraciunile active au fost cumulate pentru a da prepararea brut a -amilazei 1.izoenzim.O a doua diluie a fost realizat cu o variaie a srii de acetat 0.06 M (coninnd 1mM CaCl2,pH=4,7) i acelai tampon coninnd 0,5 M NaCl,pentru a da prepararea brut a -amilazelor 2-izoenzime.Prepararea enzimelor sunt concentrate de ultrafiltrare (membran PM) i mai departe purificat fiind trecut prin coloana de afinitate CM Sepharose CL-6B. Legturile -amilazelor au fost diluat cu tampon acetat coninnd 8 mg/ml CHA a fost ndeprtat prin schimbul de ioni cromatografic descris mai sus. Pentru purificarea recombinrii -amilazei exprimat n mal ,urmtoarea metod a fost folosit n laboratorul nostru.Celulele de mal ce secret recombinarea -amilazelor au fost crescute n mediu 2L YEPD pentru 36 ore si centrifugat pentru 36 ore ,la 9000 g timp de 20 minute.Supernatantul a fost filtrat printr+un filtru de ,0,2 ,concentrat prin ultrafiltrare folosind Pellicon XL la o turaie de 35 ml/min.Retenatul a fost schimbat n 20 mM tampon acetat ,pH=5,coninnd 5mM CaCl2 .Enzima a fost separat prin coloana de afinitate a substratului ciclohepta-amilazic n conformitate cu Silvanovich i Hill (96).Prepararea enzimei concentrate (100 ml) a fost ncrcat cu CHA-S urmat de splri repetate cu 50 ml tampon,50 ml tampon coninnd 4mM NaCl i 100 mM tampon. Enzima absorbat a fost diluat cu tamponul coninnd 8 mg/ml CHA care a fost ndeprtat prin dializ n 20mM acetat de sodiu,pH=5,tamponul coninnd 2mM CaCl2.