SISTEME ENZIMATICE DE APARARE ANTI-STRES OXIDATIV

Enzimele cheie implicate in detoxifierea speciilor reactive de oxigen la toate organismele aerobe sunt: superoxid dismutaza (EC1.15.1.1), glutation peroxidaza (EC 1.11.1. ), peroxidaza (EC1.11.1.!), catalaza (EC 1.11.1."), glutation #$tranferaza, toate fiind abundente in tesuturile pestilor (%i&iulio et al., 1 ' ). (a aceste enzime de adauga sistemul auxiliar care furnizeaza echivalentii de reducere necesari activitatii detoxifiante (glutation reductaza EC 1.".).*). %eoarece ma+oritatea activitatilor acestor enzime sunt induse de speciile reactive de oxigen, ele reprezinta indicatori ai stresului oxidativ.

CATALAZA
,a+oritatea celulelor aerobe contin catalaza. (a animale este prezenta in aproape toate organele, fiind concentrata in special in ficat. -n celula, catalaza se gaseste in peroxizomi si, in cantitati mult mai mici, in mitocondrie si reticulul endoplasmatic. %e aceea, .*/* generat in vivo nu poate fi substrat la catalazei decat daca acesta difuzeaza in peroxizomi. Enzima este alcatuita din ) subunitati proteice de cate "0 1da, fiecare din ele continand o grupare hem lecata la centrul catalitic activ si o molecula de 23%4.. .emul este localizat intr$o cavitate nepolara care comunica cu suprafata prin canale inguste, limitandu$se astfel accesul moleculelor mai mari decat .*/*. 5eactia in care este implicata catalaza este una de disproportionare, o molecula de .*/* fiind redusa in timp ce o alta este oxidata.

Catalaza 6e (---) 7 .*/* Compus - 7 7 /* * .*/*

.*/*

Compus - 7 .*/ Catalaza 6e (---) 7 .*/

*.*/ 7 /*

#tructura exacta a compusului - nu este cunoscuta cu exactitate. Catalaza este una din cele mai eficiente enzime cunoscute. Este atat de eficienta incat nu poate fi saturata de nici o concentratie de .*/*, oricat de mare ar fi aceasta. Enzima prezinta si activitate peroxidazica, limitarea acesteia datorandu$se accesibilitatii scazute a substratelor la hem. 5//. 7 3.* .*/ 7 5/. 73

%onorii de hidrogen pot fi metanolul, etanolul, acidul formic, fenolul. Chiar daca aceasta enzima nu este esentiala pentru anumite tipuri de celule in conditii normale, ea +oaca un rol important in raspunsul adaptativ al celulelor la stresul oxidativ.

GLUTATION PEROXIDAZA
&rupul de enzime cuprins sub aceasta denumire este implicat in catalizarea reactiei de reducere a hidroperoxidului de hidrogen cuplata cu oxidarea glutationului:

.*/*

&#.

&##& 7 * .*/

&lutation peroxidazele (&4x) sunt larg raspandite in tesuturile animale, &#. fiind donorul de hidrogen specific. 4ot servi drept substrate pentru aceste enzime si alti peroxizi organici: ai purinelor, ai acizilor grasi polinesaturati, ai steroizilor. &ruparea peroxid a acestor substrate este redusa la gruparea hidroxil:

5$//.

&#.

5$/. 7&##&

Enzimele sunt alcatuite din patru subunitati proteice, fiecare avand un atom de #e sub forma selenocisteinei. 3cesta este motivul pentru care prezenta #e in dieta tuturor animalelor este impusa. 3ctiunea glutation peroxidazei si catalazei este concertata, glutation peroxidaza actionand la concentratii mici de .*/* si la concentratii fiziologice de &#., in timp ce catalaza actioneaza la concentratii crescute de .*/*. -n timp ce catalaza se gaseste mai ales in peroxizomi, glutation peroxidaza este localizata in citosol si matrixul mitocondrial (cca 108 din &4x total). -n organismele aerobe, rolul glutation peroxidazei in reducerea .*/* poate fi considerat foarte mic comparativ cu eficienta catalazei. %ar produsii peroxidati ai lipidelor rezultati in urma atacului radicalilor liberi asupra lipidelor membranare pot provoca distrugeri ale membranei si chiar la nivelul %23. 6amilia glutation peroxidazelor este alcatuita din mai multi membri. 9n membru al familiei este fosfolipid hidroperoxid glutation peroxidaza (4.&4x), enzima ce foloseste drept substrat resturi ale acizilor grasi peroxidatece intra in constitutia unor structuri membranare. -n intestin, un alt membru al acestei familii, &4x$&- metabolizeaza peroxizii lipidici din hrana, dar si pe cei formati in urma peroxidarii lipidelor din intestin. 5educerea hidroperoxizilor dependenta de &#. este considerata un mecanism ma+or al apararii organismelor aerobe impotriva stresului oxidativ. 6aptul ca mai multe proteine neinrudite genetic capabile sa reduca . */* si:sau lipidele hidroperoxidate exista in organismele aerobe prin intermediul &#., atesta importanta fiziologica a activitatii lor. 4rezenta acestor acestor proteine apartinand unor familii de gene diferite pare sa fi conferit un avanta+ in selectia organismelor aerobe in cursul evolutiei.

GLUTATION S-TRANSFERAZA
&lutation #$transferazele (&#;) reprezinta un grup mare de enzime intalnit la organisme incapand cu procariote si pana la mamifere. &#; prezinta o functie esentiala in procesul de detoxificare prin indepartarea compusilor xenobiotici si +oaca un rol important in protectia impotriva stresului oxidativ, cancer si alte maladii degenerative, inclusiv maladii asociate imbatranirii. &#; a fost asociat cu un numar mare de compusi, inclusiv steroizi si carcinogeni, actionand ca o proteina reglatoare. 5eactia catalizata de &#; presupune atacul nucleofil al al glutationului redus (&#.) asupra substratului electrofil.

&# 7 5$<

&#$5 7 <

5olul protectiv in celula deriva din faptul ca aceste con+ugate cu glutationul sunt mult mai solubile decat compusii din care provin, acestea putand fi mult mai usor excretate din celula. -n anumite organisme, procariote, de exemplu, enzimele din
*

superfamilia &#; servesc producerii mai multor compusi de reactie asociati cu biodegradarea poluantilor persistenti ai mediului (de exemplu, compusi aromatici halogenati). 3u fost determinate peste )00 de secvente &#; diferite, incadrate in cca *5 de clase diferite. ;oate structurile &#; cunoscute prezinta * domenii: un domeniu 2$terminal asociat cu tioredoxina si un domeniu C$terminal ce contine ) secvente helicale diferite. %omeniul 2$terminal contine si situsul de legare al &#., in timp ce domeniul C$terminal asigura elementele structurale primare asociate cu specificitatea celui de al doilea substrat. #tudii numeroase ce investigau peroxidarea lipidelor au examinat activitatea glutation #$transferazica asupra unor substrate de tipul hidroperoxidului de cumen sau de t$butil. 9nele substrate fiziologic importante precum hidroperoxizii fosfolipidelor, au fost, de asemenea folosite pentru a masura activitatea anumitor &#;$aze.

GLUTATION REDUCTAZA
;oate enzimele prezentate mai sus utilizau &#. si duceau la producerea de &##&. 5aportul dintre glutationul redus (&#.) si cel oxidat (&##&) trebuie mentinut constant in celule. (a acest lucru contribuie enzima glutation reductaza care catalizeaza reducerea formei disulfurice a glutationului, necesitand 23%4. generat, in special, din suntul pentozofosfatilor:

&##& 7 23%4. 7

.7

*&#. 7 23%47

&lutation reducatza este un dimer cu ,,r=1051%a, fiecare din cele doua subunitati proteice avand cate o grupare 63%. %esi initial a fost propus un mecanism ping$pong pentru acesta enzima, inhibitia competitiva a 23%47 si proprietatile reactiei reversibile au condus la formularea unui mecanism >branched? in care enzima poate functiona atat dupa un mecanism ping$pong cat si dupa modelul secvential, in functie de concentratia de &##&. 4rin studii de cristalografie cu raze < s$a demonstrat existenta e doua situsuri diferite de legare pentru &##& si 23%4.. 3parent 23%4. reduce 63% care transfera doi electroni la doi atomi de # dintr$o punte disulfurica formata intre doua resturi de cisteina din centru catalitic activ al enzimei. Cele doua grupari @#. formate astfel interactioneaza cu &##& pe care il reduce si reface puntea disulfurica initiala a enzimei.

LACTAT DEHIDROGENAZA
($lactat: 23%7 oxidoreductaza ((%.) este implicata in fermentatiile lactice, catalizand urmatoarea reactie:

C.A$C./.$C//. C//. 7 23%. 7.7

23%7

C. A$C/$

(actat dehidrogenaza este o enzima intalnita in aproximativ toate tesuturile pestilor, ficatul si muschii scheletici posedand cele mai mari activitati, muschiul cardiac avand mai putina enzima. (%. este prezenta si in eritrocite, rinichi, branhii, pancreas, creier, etc. -n cazul lactat dehidrogeneazei s$a pus in evidenta existenta a 5 izoforme, proteine cu structura tetramera ce sunt constituite din legarea catenelor polipeptidice de tip , si ., codificate de gene distincte. ;oate izoenzimele au aproximativ o ,,r=1A01%a, diferentele de migrare electroforetica fiind datorate structurii diferite rezultate prin combinarea celor doua tipuri de catene polipeptidice. 3stfel, (%.1 are ) catene de tip . (.)), (%. * are A catene . si una , (. A,), (%.A este un heterotetramer .*,*, (%.) este constituit din A catene de tip , si una dip . (.,A), iar (%.5 este de tipul ,).
A

Izoenzime LDH (%.1, (%.* (%.A (%.), (%.)

Tesuturi ,uschi cardiac, eritrocite, celule glomerulare, renale, creier, cristalin 4laman, pancreas, splina, timus, glande suprarenale, tiroida, noduli limfatici, leucocite ,uschi scheletic, ficat, celule tubulare renale, granulocite, tumori maligne.

SUPEROXID DISMUTAZA
%esi descoperita cu multi ani inainte in sangele bovinelor, ficatul cabalinelor sau creier, fiind considerata ca o forma de inmagazinare a cuprului, enzima a fost desemnata drept #/% in 1 " de catre ,c Cord si 6ridovich. Exista doua tipuri de enzime, o ,n #/% prezenta in mitocondrie si o CuBn#/% ce se gaseste in citosol, lizozomi, peroxizomi, nucleu si spatiul intermembranar mitocondrial. 6e#/% nu s$au identificat in tesuturile animale, ci doar la unele plante superioare, bacterii si alge. 3ctivitatea superoxid dismutazei mitocondriale reprezinta pana la "08 din activiatea tisulara totala (5adi et al.). Concentratiile enzimei tind sa fie foarte mari datorita inaltei reactivitati radicalilor superoxid. Cu/Zn superoxid dismutazele sunt prezente in toate celulele eucariote. Ele sunt formate din doua subunitati proteice, fiecare dintre ele continand in centrul catalitic activ un ion de cupru si unul de zinc. -onii de zinc participa la reactiile:

Enzima$Cu*7 7 /*.$ Enzima @Cu7 7 /*.$ 7 *.7 * /*.$ 7 *.7

Enzima @ Cu7 7 /* Enzima$Cu*7 7 .*/*

.*/* 7 /*

MnSOD superoxid dismutazele sunt prezente atat la animale cat si la plante si la bacterii. -n ma+oritatea tesuturilor animale ea este prezenta exclusiv in mitocondrie. -n eritrocitele umane, care sunt lipsite de mitocondrii, nu se gaseste deloc ,n #/%, in timp ce in ficat 108 din activitatea #/% este datorata acestei enzime. ,n #/% la organismele superioare din patru subunitati proteice. Eliminarea ionului de mangan din centrul catalitic activ al enximei ar duce la pierderea activitatii enximatice. #/% actioneaza nu numai prin eliminarea excesului de radical superoxid, ci poate indeparta si oxigenul singlet, deci, indirect, peroxidarea lipidica. #/% este o enzima inductibila, efectul inductiv al /*.$ asupra sintezei acesteia fiind demonstrat la bacterii anaerobe si facultativ aerobe, dar si la mamifere. -n ficatul de peste au fost identificate cel putin 5 izoforme ale superoxid dismutazei care se modifica frecvent in pesti in ariile poluate (4edra+as et al. 1 A). 3ctivitatea superoxid dismutazica creste foarte rapid in eritrocitele de crap, cand pestii sunt expusi la 10mg:l paraCuat in apa, maximul inregistrandu$se la 1*h (,atDovics et al.), urmat de scaderea sub nivelul control dupa )'$ "h. #caderea activitatii dupa expunerea prelungita pot fi explicate prin inhibarea enzimei de catre produsii sai, .*/* sau prin ./. (EraF et al., 1 !)).