UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURETI FACULTATEA:STIINTA SI INGINERIA MATERIALELOR

POLIMERI BIORESORBABILI

STUDENT:VLEJU LIVIU GRUPA:1031 B SPECIALIZARE:INGEINERIE MEDICALA

BUCURETI 2010

CUPRINS I COLAGENUL 1.CONSIDERAII GENERALE PRIVIND BIOCHIMIA COLAGENULUI . 2.E!TRAGEREA" CARACTERIZAREA" PROPRIET#ILE I UTILIZAREA COLAGENULUI NEDENATURAT TIP I PENTRU OBINEREA BIOMATERIALELOR$. 3. METODE DE ANALIZ#..................%. 3.1. M&'()& *+,-)& )& +.+/-01.%. 3.2.M&'()& 2,&3'*(23(,-3&...%. 3.3.M&'()& 4-3*(23(,-3& .%. 3. .M&'()& 5-(/(6-3& )& &7+/8+*& + 4+'*-3-/(* 3(/+6&.-3&9. 3.4.1. Degradarea enzimatic in vitro.9. 3.4.2.Controlul microbiologic9. 3.4.3.Testarea biocompatibilitii cu celule endoteliale.9. . OBINEREA I CARACTERIZAREA GELURILOR DE COLAGEN...10.
.1. E:'*+6&*&+ 3(/+6&.8/8- ;-5*-/+* '-, I )-. ,-&/& )& 7-<&/.10. .2. C+*+3'&*-0+*&+ ,*-. 4&'()& *+,-)& )& +.+/-01.10.

$.OBTINEREA SI CARACTERIZAREA FIZICO=CHIMIC# I MORFOLOGIC# A MATRICILOR DE COLAGEN..10. $.1. O5<-.&*&+ 4+'*-3-/(*..10.

$.2. CARACTERIZAREA FIZICO=CHIMIC# I MORFOLOGIC# A MATRICILOR DE COLAGEN11.

.2.1.Caracterizarea prin analize termice....11. .2.2.Caracterizarea prin spectroscopie !T"#$..... 14.

2

.2.3.Caracterizarea mor%ologic..1 . >. CARACTERIZAREA BIOLOGIC# A MATRICILOR DE COLAGEN1?. >.1. B-()&6*+)+5-/-'+'&+ in vitro1&. >.2. C(.'*(/8/ 4-3*(5-(/(6-3 in vitro 19. >.3. B-(3(4,+'-5-/-'+'&+ 38 3&/8/& &.)('&/-+/& in vitro.19.

II.A/'& 4+'&*-+/& 5-(*&2(*5+5-/&

1.Chitosan..22. 2.Poli (-hidroxi acizi).22. 3.Poli (amino acizi).23.

A,/-3+'--2

INTRODUCERE Datorit biocompatibilitii i biodegradabilitii excelente, structurii bine definite,caracteristicilor biologice i modului n care interacionea cu organismul, colagenul repre int unul dintre cele mai utili ate biomateriale. !xtras sub form de soluie apoas sau gel, colagenul fibrilar tip " poate fi modelat n diferite forme# dispo iti$e medicale, implanturi artificiale, suporturi pentru cedarea medicamentelor i sc%elete &scaffold' pentru regenerare tisular, cu rol important n pre ent n medicin. Desi colagenul este cel mai utili at material,s(au testat,in calitate de polimeri bioresorbabili,deri$ati proteici,poli a%aride,poli&amina(aci i',poli&$inil alcool',)( si *(poliesteri %omo(polimeri sau coplolimeri. I.COLAGENUL 1.CONSIDERAII GENERALE PRIVIND BIOCHIMIA COLAGENULUI +olagenul este principala protein structural din cele mai multe esuturi con,uncti$e moi, laxe, semirigide i rigide &piele, oase, tendon, membrane ba ale etc.', care asigur n principal integritate structural esuturilor. -iosinte a sa este un proces complex, a$.nd loc n dou etape# intra( i extracelular# /ceasta ncepe n fibroblaste i se termin cu agregarea fibrilelor n fibre 0 componente ale matricei extracelulare &1!+'. 2olimer natural, colagenul este constituit din 23 de aminoaci i, aran,ai n sec$ene caracteristice, ce formea o structur conformaional foarte complex, organi at pe patru ni$ele, numite structuri primar, secundar, teriar i cuaternar. 2.n n pre ent au fost descoperite 29 tipuri de colagen. Dintre acestea, cunoscute i caracteri ate p.n n pre ent, cel mai utili at ca biomaterial este 3(/+6&.8/ '-, I. 1olecula de colagen tip " &tropocolagen' este un %eterotrimer alctuit din trei lanuri )(polipeptidice &dou identice 0 )1 i unul diferit 0 )2' rsucite mpreun de la dreapta spre st.nga n ,urul unei axe comune, form.nd %elixul triplu. 4ormarea acestuia necesit pre ena 5l6 n fiecare a treia po iie a
7

lanului, aceasta fiind singurul aminoacid ce poate intra n po iiile interne ale %elixului triplu datorit $olumului mic, determinat de singurul su atom de %idrogen. 4ormarea %elixului triplu este fa$ori at, de asemenea, de pre ena 2ro i 86p n po iiile 9 i : care, datorit rigiditii inelelor pirolidinice, impun restricii pri$ind rotaia lanurilor. +onformaia de %elix triplu este stabili at prin legturi de %idrogen ntre lanurile constituente, cu participarea grupelor %idroxil ale 86p i a moleculelor de ap, precum i prin alte tipuri de fore# ;an der <aals, %idrofobe, co$alente.

2.E!TRAGEREA" CARACTERIZAREA" PROPRIET#ILE I UTILIZAREA COLAGENULUI NEDENATURAT TIP I PENTRU OBINEREA BIOMATERIALELOR =ursa principal de colagen fibrilar tip " este pielea animal, esut con,uncti$ dens. 2entru a fi utili at ca biomaterial, colagenul extras trebuie s aib structur c.t mai apropiat de cea nati$, de %elix triplu, caracteristic moleculei de colagen. !xtragerea colagenului se face prin diferite te%nologii, cea mai $ec%e fiind fierberea esuturilor n ap, care ns denaturea colagenul i conduce la binecunoscuta gelatin. >otui, pentru utili area ca biomaterial, colagenul trebuie obinut n stare nedenaturat. >e%nologiile de extragere a colagenului se mpart n dou grupe &figura 1'# ( @. 2'+*& )&.+'8*+'1 0 TECD 0 c.nd cca 93? din molecule sunt n stare denaturat@ ( @. 2'+*& .&)&.+'8*+'1 0 TECN 0 c.nd cca A3? din molecule sunt n stare nedenaturat &cu pstrarea structurii elicoidale'.

4igura 1. Ci$ele structurale de extractie a colagenului din piele prin >!+C i >!+D

T&A.(/(6--/& )& &:'*+3<-& + 3(/+6&.8/8- @. 2'+*& .&)&.+'8*+'1 permit obinerea colagenului sub form de suspensii de fibre 0 past de colagen, gel fibrilar i soluii coloidale. +olagenul nedenaturat se poate i ola i purifica prin dou te%nologii, n funcie de ni$elul structural dorit#( n stare molecular i fibrilar. /cestea permit extragerea colagenului tip " din piele de bo$in n mediu apos cu pstrarea structurii triplu %elicoidale a moleculelor, respecti$ microfibrilelor i fibrilelor. +ele mai utili ate extracte colagenice care stau la ba a obinerii biomaterialelor sunt gelurile i soluiile de colagen tip ". 5elul este definit ca un sistem cu proprieti intermediare ntre ale unui lic%id i ale unui solid. /stfel, gel
D

poate fi un fluid puin $iscos, dar i un material foarte $iscos. Ea p8(ul i oelectric gelul de colagen separ fibrile i fibre, de$enind dispersie. +apacitatea de combinare a colagenului cu aci ii este determinat de numrul grupelor ba ice, iar cea de combinare cu ba ele de numrul grupelor carboxilice. Datorit grupelor ba ice i acide din catenele laterale ale lanurilor polipeptidice, colagenul este un polimer amfoter. F molecul de colagen conine aproximati$ 273 grupe amin n resturile de li in, %idroxili in i arginin i 233 grupe carboxil n cele ale aci ilor aspartic i glutamic. 5rupele amid din lanul polipeptidic i %idroxil din catenele laterale au nsemntate redus n ceea ce pri$ete caracterul amfoter. Fbinerea biomaterialelor pe ba de colagen pleac de la extracte de colagen nedenaturat 0 geluri sau soluii 0 care se condiione prin modificri c%imice i fi ice, uscare liber sau liofili are. 2entru pstrarea conformaiei de %elix triplu, procedeele de condiionare nu trebuie s utili e e o temperatur mai mare de 333+. Gn procedeele elaborate pentru obinerea biomaterialelor pe ba de colagen nedenaturat, operaii c%eie sunt considerate renaturarea, modificarea c%imic, compatibilitatea cu compui bioacti$i, uscarea sau condiionarea sub form final. M&'()&/& )& *&'-38/+*& conduc la crearea de legturi c%imice suplimentare ntre moleculele iHsau fibrilele de colagen, mrind stabilitatea mecanic i c%imic i, n consecin, reduc.nd biodegradabilitatea. Ieticularea c%imic const n reacia colagenului cu alde%ide, dii ocianai, carboimide, acil(a ide, compui poliepoxidici i polifenolici, care conduc la formarea de legturi ionice sau co$alente ntre molecule sau fibrile. Dintre agenii de reticulare c%imic, alde%ida glutaric &/5' este cea mai utili at datorit eficienei mari n ceea ce pri$ete stabili area biomaterialelor colagenice. Ieticularea cu /5 implic reacii ale grupelor )(amin libere ale li inei sau %idroxili inei din lanurile polipeptidice cu grupele alde%idice. 2olifenolii au fost utili ai, sub form de tanini $egetali, pentru tanarea pieilor animale de foarte mult timp. /cetia sunt buni ageni de reticluare datorit multiplelor interaciuni cu proteinele, mrind astfel stabilitatea colagenului din %idrogeluri sau matrici spongioase. Dup reticulare, gelurile de colagen pot fi condiionate prin procedeele de uscare, cele mai utili ate fiind liofili area i uscarea liber la temperaturi de cca 2BJ+. Cici unul din procedee nu produce denaturarea extractelor.
A

Eiofili area este o te%nic de condiionare a$anta,oas, care const n uscarea probelor congelate prin sublimarea n $id a g%eei. 2rocesul de liofili are a gelurilorHsoluiilor de colagen are loc n dou etape# ng%eare rapid, urmat de uscare. 2rin uscare se ndeprtea la nceput apa liber, apoi cea legat de grupele polare ale colagenului. Gn locul cristalelor de g%ea se formea pori, iar colagenul se renaturea n fibrile i fibre. -iomaterialele obinute sunt spongioase, se numesc matrici i au proprieti similare matricei extracelulare. -iomaterialele pe ba de colagen au o $arietate de forme# %idrogeluri, membrane, matrici, fire, tuburi, compo ite, obinute din extracte de colagen nedenaturat . 3. METODE DE ANALIZ# 2entru geluri s(au utili at metodele de caracteri are fi ico(c%imic rapid iar pentru matrici metode termice, spectroscopia 4>("I i morfologice &densitate, absorbie de ap i microscopie electronic'. 3.1. M&'()& *+,-)& )& +.+/-01 1etodele prin care s(a fcut o prim caracteri are a gelurilor de colagen au fost# substan uscat, cenu, a ot total, substane grase i p8. 3.2.M&'()& 2,&3'*(23(,-3& "dentificarea grupelor funcionale, e$idenierea structurii secundare i teriare a colagenului i e$idenierea interaciunilor sale cu alte substane s(a efectuat prin spectroscopie 4>("I, folosind un aparat "I 4>("I D333 cu sistem />I de reflexie 1K"" 5olden 5ate =ingle &Lasco', cu domeniul spectral cuprins ntre 233 i 7333 cm(1. +antitile de doxiciclin i acid tanic cedate din geluri i matrici n soluia receptoare s(au e$aluat cu un spectrofotometru cu fascicul dublu M;(;"= 2erNin( !lmer Eambda 2. 2entru a e$idenia structura triplu %elicoidal a colagenului din gelul de colagen fibrilar tip " s(a obinut spectrul de dicroism circular &D+' cu un spectropolarimetru Lasco L(O13, utili .nd o cu$ de cuar cu drumul optic de 3,32 cm, la o $ite de scanare a spectrului de B3 nmHmin n domeniul 2B3(19B nm. 3.3.M&'()& 4-3*(23(,-3& "maginile de microscopie electronic de baleia, &=!1' au fost nregistrate utili .nd un microscop electronic de baleia, 8itac%i =(2D33C cu sonda !D9 cu re oluie de p.n la 7 nm &la 2B N;, n $id naintat n ca ul utili rii detectorului de
O

electroni secundari' i mrire de 1B 0 333 x &tensiuni de accelerare de la 3,B N; la 33 N;'. 2entru anali a probelor biologice s(au folosit microscoapele electronice de transmisie 2%ilips 231+ i 2%ilips 733. 3. .M&'()& 5-(/(6-3& )& &7+/8+*& + 4+'*-3-/(* 3(/+6&.-3& 2entru e$aluarea matricilor de colagen ca sisteme de cedare controlat s(au utili at degradarea en imatic in vitro i controlul microbiologic i s(a determinat biocompatibilitatea cu celule endoteliale. 3.4.1. Degradarea enzimatic in vitro Ie istena la digestie en imatic a matricilor de colagen a fost obinut cu o colagena cu acti$itatea 12B MHmg n soluie tampon fosfat cu p8 A,7. +antitatea re idual a fost exprimat n procente &gHg' fa de greutatea iniial a probei. 3.4.2.Controlul microbiologic +ontrolul contaminrii microbiene a matricilor colagenice s(a reali at la =+ !E1" 2IFD4/I1 =IE, conform standardelor de control microbiologic &+FE"2/ 0 5uidelines on 1icrobial Pualit6 1anagement', prin inoculare pe medii de cultur specifice, urmat de efectuarea de subculturi i identificarea microorganismelor patogene, prin# &a' metoda amprentrii pentru determinarea numrului total de microorganisme aerobe &C>5/' i a numrului total de fungi i le$uri &C>4E'@ &b' teste bioc%imice de confirmare pentru identificarea microorganismelor patogene. 3.4.3.Testarea biocompatibilitii cu celule endoteliale -iocompatibilitatea matricilor cu celule endoteliale s(a examinat cu un microscop CiNon ec%ipat cu epifluorescen i filtru 51(-, iar fotografiile cu o camer digital =on6 D=+(=AB. ;iabilitatea celular a fost e$aluat prin utili area unei metode colorimetrice care are ca substrat bromur de 3(&7,B(dimetiltia ol(2(il'(2,B(difeniltetra oliu 0 1>> 0 care permite e$aluarea metabolismului oxidati$. >estul se citeste spectrofluorimetric la BA3 nm. +elulele crescute timp de o sptm.n pe matricile de colagen secionate cu ultramicrotonul au fost recolorate 3 min cu acetat de uranil i 3 min cu citrat de plumb i examinate cu microscoapele electronice de transmisie 2%ilips 231+ i 733.
9

. OBINEREA I CARACTERIZAREA GELURILOR DE COLAGEN

.1. E:'*+6&*&+ 3(/+6&.8/8- ;-5*-/+* '-, I )-. ,-&/& )& 7-<&/

2repararea gelului de colagen studiat n te s(a efectuat prin te%nologia de obinere a utili ate n Departamentul +olagen al "C+D>2 =ucursala "+2". 5elul, denumit 6&/ C, s(a omogeni at cu un agitator cu palet, s(a lsat la maturare timp de 27 % la 7o+, apoi s(a anali at prin metode rapide de anali i prin dicroism circular.
.2. C+*+3'&*-0+*&+ ,*-. 4&'()& *+,-)& )& +.+/-01

5elul de colagen + are concentraia 2,DA?. 2entru obinerea biomaterialelor se utili ea , n general, geluri cu concentraii de 1,3(1,2?. +enua i substanele grase lipsesc din acest gel, deci are un grad ridicat de puritate. $. OBINEREA I CARACTERIZAREA FIZICO=CHIMIC# I MORFOLOGIC# A MATRICILOR DE COLAGEN 1atricile tridimensionale ser$esc ca analog al celei extracelulare, acion.nd ca suport structural fi ic care confer mediu fi iologic fa$orabil pentru regenerarea esuturilor afectate, stimul.nd de $oltarea esutului nou, ade iunea celular i patul de granulaie al rnii. $.1. O5<-.&*&+ 4+'*-3-/(* 1atricile de colagen se obin prin liofili area unor soluii sau geluri de colagen. =istemele de cedare a medicamentelor care au ca suport matrici poroase s(au obinut prin liofili area gelurilor de colagen pre entate n subcapitolul D.7. Gn tabelul 33 sunt trecute gelurile din seriile "(; din care s(au obinut matrici de colagen i denumirile acestora. >abelul 33. 5elurile din seriile "(; din care s(au obinut matrici de colagen i denumirile acestora Denumire Denumire gel din Denumire Denumire gel din care matrice care matrice s(a obinut matricea s(a obinut matricea Probe martor
13

1(/ Probe seria I +D(+D 0 3.1B +D 0 3.23 +D 0 3.2B +D 0 3.33 Probe seria II +D(/ +D(>7 +D(>B +D(>13 +D(>23

+/(3 +D(3 +D(53 +5(53(3,23 +5(53(3,2B +5(53(3,33 +/D +/D(>7 +/D(>B +/D(>13 +/D(>23

1(Probe seria III +> 0 7/ +> 0 B/ +> 0 13/ +> 0 23/ Probe seria IV +> 0 7+> 0 B+> 0 13+> 0 23Probe seria V +> 0 23- 0 27% +> 0 23- retic 0 27%

+(3 +/(>7 +/(>B +/(>13 +/(>23 +-(>7 +-(>B +-(>13 +-(>23 +-(>23(27% +-(>23(27%(retic

$.2.C+*+3'&*-0+*&+ ;-0-3(=3A-4-31 B- 4(*;(/(6-31 + 4+'*-3-/(* )& 3(/+6&. (5<-.8'& 1atricile s(au anali at prin metode termice, spectroscopie 4>("I i morfologice &absorbie de ap, densitate i microscopie electronic de baleia,'. .1.Caracterizarea prin analize termice S'+5-/-'+'&+ A-)*('&*4-31 a colagenului, dat de temperatura de contracie, msoar temperatura tran iiei conformaionale a moleculelor de colagen de la %elix triplu la g%em statistic, numit i temperatur de denaturareQ. Gn figurile 7D i 7A sunt pre entate curbele D=+ obinute pentru matricile martor 1(/ i 1(- imersate n ap, care difer prin p8(ul gelului din care sunt obinute. 4igura arat c temperaturile de contracie au $alori apropiate# 3O,9 i respecti$ 3O,3o+, ceea ce indic stabilitate %idrotermic similar a celor dou probe.

11

D C /(m!/m") e-o

Flow /(ml/min)

D C /(m!/m") e-o

Flow /(ml/min)

300 0.2 38.+ "r( C

1.0

#1.3$ %/-apa-apa-20-5-15min-110-'2-24-11-08.((3 D C Flow (pur"e1) Flow (prote)ti* e)

300

#1.3$

-3+.8+ ,/" 0.0

#1.3$

250

250 0.5 -53.14 ,/" 38.0 C

-0.2

200

0.0

200

-0.4 150 -0.6 #1.3$ %&-apa-apa-20-5-15min-110-'2-24-11-08.((3 D C Flow (pur"e1) Flow (prote)ti*e)

#1.3$

-0.5 150

-1.0

100
-1.5 43.+ C
#1.3$

100

-0.8

-1.0
#1.3$

50
-2.0
#1.3$

50

-1.2 35 40

43.4 C 45 50 Temperature /C 55 60 65

0 20 30 40 50 60 Temperature /C .0 80 +0

4igura 2. +urba D=+ pentru matricea 1(/ imersat n ap

4igura 3. +urba D=+ pentru matricea 1(- imersat n ap

/dugarea doxiciclinei are ca efect mrirea stabilitii %idrotermice, at.t pentru matricile obinute din geluri cu p8 acid c.t i slab ba ic, 3,2? doxiciclin mrind temperatura de contracie a matricei 1(/ cu 1,A o+, iar a matricei 1(- cu 7,2o+. Ieticularea colagenului cu alde%id glutaric produce stabili area moleculelor de colagen, ceea ce are ca efect creterea moderat a temperaturii de denaturare 0 de la 72,2o+ pentru matricea nereticulat la 7D,7o+ pentru cea reticulat cu 3,2B? alde%id glutaric . >emperaturile de contracie ale matricilor obinute din gelul de colagen ce conine doxiciclin +D(/ reticulat cu diferite cantiti de acid tanic cresc cu mrirea concentraiei acestuia. ;alorile pentru matricile +D(>13 i +D(>23 sunt apropiate# 7B,A i respecti$ 7B,Oo+, ceea ce arat c temperatura de contracie nu mai $aria peste 13? acid tanic, deci reticularea nu mai continu, n concordan cu re ultatele obinute din msurtori reologice. =tabilitatea %idrotermic a matricilor de colagen poate fi deci mrit prin adugarea glutaralde%idei, doxiciclinei sau acidului tanic at.t n mediu acid c.t i slab ba ic. D&'&*4-.+*&+ '&4,&*+'8*-- )& '(,-*&" >t, a onei cristaline a colagenului s(a efectuat prin D>/ R33BQ sau D=+ R29AQ n atmosfer inert, n domeniul de temperatur B 2O3o+. >emperatura de topire repre int o msur a triei legturilor dintre lanurile cu conformaie de %elix triplu, pe c.nd S8 este o msur a gradului de reticulare &proporiei de colagen reticulat'. +urbele D=+ n atmosfer de a ot pentru matricile 1(/ i 1(-, repre entate n figurile B1 i respecti$ B2, arat c la ncl ire progresi$ au loc 0 ntr(ade$r 0
12

dou tipuri de procese, i anume des%idratarea iniial, urmat de procesul de topire. Dac ntre temperaturile de contracie ale matricilor obinute din geluri cu p8 acid i slab ba ic nu exist practic diferene, temperatura de topire a colagenului din prima matrice este cu cca 13o+ mai mic dec.t a celui din a doua, deci interaciunile intermoleculare sunt mai puternice n mediu ba ic, gradul de ordonare al onei cristaline a colagenului din matricile obinute din gel cu p8 slab ba ic fiind mai mare dec.t al celui din matricile obinute din gel cu p8 acid &legturile dintre )(%elixuri sunt mai puternice n ca ul p8(ului slab ba ic'. Diferene exist i n ceea ce pri$ete $aloarea entalpiei de topire, care este mai mic cu 7,2 LHg pentru 1(/ dec.t pentru 1(-. /ceasta se poate explica prin diferena de reticulare din fa a cristalin, mai puternic n mediu ba ic.
D C /(m ! /m ") eo 0.5
#1$ %&-10-20-280-'2-13-11-08.((3 D C Flow (pur"e1) Flow (prote)ti*e)

Flow /(ml/m in)

D C /(m ! /m ") eo 0.0

#1 $ %/-10-20-280-'2-13-11-08.((3 D C

300

-0.2 0.0 250 -313.4 ,/"

-13.4. ,/"

-0.4 -286.5 ,/" -+.28 ,/" 200

21+.2 C

#1$

-0.5

-0.6 20+.3 C
#1$

150 -0.8

-1.0 100
#1$

-1.0

-1.5 63.+ C
#1$

-1.2 50 6..6 C -1.4 0 50 100 150 Temperature /C 200 250 50 100 150 T em peratu re /C 200 250

4igura 7. +urba D=+ obinut pentru matricea 1(/ n atmosfer de a ot

4igura B. +urba D=+ obinut pentru matricea 1(- n atmosfer de a ot

Diferene exist i n ceea ce pri$ete $aloarea entalpiei de topire, care este mai mic cu 7,2 LHg pentru 1(/ dec.t pentru 1(-. /ceasta se poate explica prin diferena de reticulare din fa a cristalin, mai puternic n mediu ba ic. Ieticularea cu alde%id glutaric a matricilor ce conin doxiciclin produce scderea temperaturii de topire comparati$ cu proba martor 1(-. Diferenele pentru matricile reticulate sunt ns mici, a,ung.nd la maximum 3,A o+, i se pot datora omogenitii ce$a mai a$ansate a probelor reticulate cu /5. +eea ce diferenia matricile de colagen ce conin doxiciclin reticulate cu alde%id glutaric este entalpia de topire. /ceasta scade cu creterea concentraiei alde%idei glutarice p.n la concentraia de 3,2B? i crete apoi pentru 3,33?. Din aceste date re ult c cel mai mare grad de reticulare este obinut n ca ul matricilor reticulate cu 3,2B? /5. 2este aceast concentraie /5 rm.ne, probabil, nereacionat.
13

>emperaturile i entalpiile de topire ale matricilor din seria "", care conin doxiciclin i sunt reticulate cu acid tanic, sunt foarte apropiate, ceea ce arat c gradul de ordonare nu crete sensibil cu mrirea concentraiei acidului. Diferenele sunt mici i n ceea ce pri$ete entalpiile de topire, deci nici gradul de retriculare nu crete prea mult cu cantitatea de acid tanic. >emperaturile de topire ale matricilor reticulate cu acid tanic obinute din geluri cu p8 slab ba ic sunt cu aproximati$ 13 o+ mai mari dec.t ale celor obinute din geluri cu p8 acid@ entalpiile de topire cele mai mari s(au nregistrat pentru matricile mare conin doxiciclin, at.t c.nd reticularea s(a efectuat cu alde%id glutaric, c.t i cu acid tanic. .2.Caracterizarea prin spectroscopie !T"#$ -en ile de absorbie caracteristice colagenului sunt situate n figura B9 la 329A &amid /', 2931 &amid -', 1D32 &amid "', 1B7A &amid ""' i 1273 cm (1 &amid """', $alori ce corespund, n mare msur, cu datele pre entate p.n acum n literatura. 1odificrile structurii colagenului se determin prin urmtoarele relaii semicantitati$e# ( raportul /"""H/17B3 se corelea cu meninerea integritii structurii %elixului triplu, $aloarea trebuind s fie mai mare sau egal cu 1@ ( raportul /"H// se corelea cu gradul de reticulare# cu c.t raportul /"H// este mai mare cu at.t gradul de reticulare este mai a$ansat@ R313Q ( raportul /"H/"" se corelea cu gradul de %idroli @ ( diferena dintre frec$enele amid " i "", , d informaii despre pre ena procesului de denaturare# T 133 cm(1 indic existena colagenului denaturat. Ea adugarea doxiciclinei se formea legturi de %idrogen puternice ntre grupele F8, banda amid / deplas.ndu(se de la 329A la 3292 cm(1. =tructura triplu %elicoidal rm.ne ns nemodificat, raportul / """H/17B3 fiind 1,1D pentru +D(-, foarte apropiat de cel pentru matricea martor. Ui $aloarea SV este mai mic dec.t 133, indic.nd absena colagenului denaturat. 1atricile de colagen din seria "" au fost reticulate cu acid tanic. /ciunea sa asupra matricilor ce conin doxiciclin este pus n e$iden de $alorile parametrilor "I caracteristici, care arat c acestea i pstrea structura triplu %elicoidal, $aloarea raportului /"""H/17B3 obinut pentru matricea ce conine doar
17

doxiciclin fiind c%iar peste 1,2D. SV are $alori cuprinse ntre OD i OA cm (1, ceea ce nseamn c acidul tanic nu degradea colagenul. Din rapoartele /"H// i /"H/"" obinute pentru matricile din seriile """ i "; re ult c la concentraia de 13? /> are loc formarea celor mai puternice legturi de %idrogen i deci cea mai puternic reticulare, aa cum re ult i din anali ele termice. .2.Caracterizarea mor%ologic =tructura morfologic a matricilor de colage este important deoarece influenea %idrofilia, difu ia medicamentului prin reea, proprietile de degradare i interaciunea cu celulele. 1orfologia matricilor s(a determinat din msurtori de densitate i de absorbie de ap, iar forma i dimensiunea porilor prin microscopie electronic de baleia,. B.2.1. Densitatea matricilor de colagen 1atricile de colagen studiate au densitatea aparent cuprins ntre 3,32 i 3,33 gHcm3, $ariind cu concentraia colagenului i a componentelor care intr n compo iia lor. B.2.2. /bsorbia de ap Ieticularea cu alde%id glutaric reduce absorbia apei, cu at.t mai mult cu c.t gradul de reticulare este mai mare, cea mai mic absorbie pre ent.nd ns matricea ce conine 3,2B? /5 i nu cea cu 3,33?, n concordan cu re ultatele anali elor termice i spectroscopice, care demonstrea c matricea +D(3,2B pre int gradul de reticulare cel mai mare. Gn seria "", cea mai mic absorbie s(a nregistrat pentru matricea +D(>13, pentru care s(a obinut c reticularea este maxim i prin celelalte metode de caracteri are. +ompar.nd $alorile absorbiei de ap pentru matricile martor 1(/ i 1(- i pentru cele corespun toare cu doxiciclin &+D(/ i +D(-' se constat c cele obinute din geluri acide absoarb mai mult dec.t cele re ultate din geluri slab ba ice, primele pier .ndu(i totui integritatea dup maximum 7 ore. 2entru mri stabilitatea, acestea trebuie reticulate. 1atricile care conin 7 sau B? />, seria """, s(au de integrat dup 3 ore, pe c.nd cele care conin 13 i 23? absorb rapid apa n prima or, lent n urmtoarele dou ore, apoi aceasta practic ncetea , mai ales pentru cea cu 23? />. /ceasta

1B

absoarbe cu cca 13? mai mult ap dec.t cea cu 13? n primele ore, dup care ambele a,ung la $aloare apropiat a gradului de umflare. 1atricile din seria "; s(au de integrat dup numai 3 ore de la imersarea n ap. B.2.3. 1icroscopia electronic 1atricile de colagen sunt structuri poroase cu dimensiuni ale porilor cuprinse ntre B3 i 1B33 Wm, cu pori a$.nd form, orientare i dimensiuni diferite. !fectul reticulrii colagenului i al interaciunii sale cu medicamentul ncorporat asupra morfologiei matricei s(a in$estigat prin msurarea dimensiunilor porilor utili .nd microscopia electronic de baleia,. "maginile s(au captat la puteri de mrire diferite, n funcie de dimensiunile porilor i de c.t de amnunit s(a dorit a se ptrunde n structura matricei. Gn figurile A2 i A3 sunt pre entate imaginile =!1 obinute pentru matricile de colagen martor, 1(/ i 1(-, la mrirea de 133x.

4igura D. "maginea =!1 obinut pentru matricea 1(/, mrire x133

4igura A. "magine =!1 obinut pentru matricea 1(-, mrire x133

Dei concentraia colagenului este aceeai, matricile au structuri foarte diferite, aa cum se poate $edea compar.nd cele dou figuri# 1(/ are structur lamelar n ig( ag, cu pori alungii cu lungimi de p.n la 333 Wm i limi de maximum 93 Wm, interconectai prin fibrile de colagen cu diametrul de 3,3 Wm, pe c.nd 1(- are structur poroas relati$ regulat, cu pori inelari cu diametrul de A3 293 Wm interconectai printr(o multitudine de fibre de colagen. 1atricile reticulate cu /5 au structuri poroase asemntoare, cu macro( i micropori neuniformi i aglomerri de fibrile i fibre produse de reticularea cu /5. Dimensiunile porilor sunt de 1B3 B33 Wm, structurile de$enind mai dense cu
1D

creterea concentraiei /5, cea mai dens structur a$.nd +D(3,2B, pentru care reticularea este maxim. 1odificri fa de proba martor s(au obser$at i pentru matricile ce conin doxiciclin reticulate cu /> &seria "" 0 figura O'.

4igura O. "maginea =!1 a matricei +D(>13, mrire x133 "maginile =!1 ale acestora arat c dimensiunile porilor sunt mai uniforme dec.t a celor anterioare, $ariind ntre 72 i 312 m. /cestea scad cu creterea concentraiei /># sunt cuprinse ntre DB i 312 Wm pentru matricea +D(>7, 72 i 2D3 Wm pentru +D(>B, 33 i 13O Wm pentru +D(>13, respecti$ ntre OD i 1O3 Wm pentru +D(>23. 1atricea +D(>13, cu cel mai mare grad de reticulare, pre int cea mai uniform structur. +ompar.nd imaginile =!1 ale matricilor din seria """ i "; se obser$ c structurile formate n mediu ba ic sunt mult mai dense dec.t n mediu acid, dimensiunile medii ale porilor fiind de D(A ori mai mici n ca ul matriciei +>(13dec.t n cel al matricei +>(13/.

>. CARACTERIZAREA BIOLOGIC# A MATRICILOR DE COLAGEN >estarea biologic in vitro a biomaterialelor pe ba de colagen simulea condiiile fi iologice. 2entru e$aluarea matricilor de colagen studiate n te s(au efectuat teste in vitro de biodegradabilitate en imatic, control microbiologic i biocompatibilitate cu celule endoteliale. 1atricile corespun toare din punctul de $edere al anali elor biologice pot fi testate n continuare in vivo pe animale.
1A

>.1. B-()&6*+)+5-/-'+'&+ in vitro 2rin biodegradare se poate e$alua, de asemenea, gradul de reticulare, colagena a put.nd cli$a doar lanurile principale ale colagenului, nu i legturile intermoleculare. 1atricea martor 1(-, care nu conine doxiciclin, s(a degradat total n 3D ore. 1atricile nereticulat i reticulate cu alde%id glutaric care conin doxiciclin, degradate parial n 3D ore, i(au pierdut integritatea dup aproximati$ 7O de ore, re ult.nd o multitudine de fibre de colagen precipitate n soluia de colagena . 1surtorile cantitati$e ale colagenului digerat n 3D de ore din matricile obinute din geluri cu p8 acid arat c cea martor s(a degradat n proporie de 97?, iar dup 72 de ore s(a degradat total. 1atricile care conin doxiciclin i /> s(au degradat mult mai puin comparati$ cu cele reticulate cu /5, procentele de colagen degradat fiind cuprise doar ntre 21? pentru +D(>23 i 32? pentru cea nereticulat. /cest lucru se datorea nu numai reticulrii cu />, ci i faptului c at.t /> c.t i doxiciclina au proprietatea de a in%iba colagena a. F alt explicaie a degradrii foarte lente a matricilor care conin /> const n faptul c la temperatura de 3A3+, la care s(au efectuat determinrile, acesta reticulea mult mai puternic dec.t la temperaturi sc ute. 1atricile de colagen care conin acid tanic din seriile """ i "; dau re iduuri cuprinse ntre 3B i OB? n timp de 3D de ore. -iodegradabilitatea matricilor de colagen este dependent deci de gradul de reticulare i de msura n care substanele medicamentoase in%ib sau nu acti$itatea colagena ei. Dup 3D de ore soluiile de colagena n care s(au introdus matricile i micorea p8(ul. /stfel, 1(/ i 1(-, care s(au degradat n cea mai mare msur, pre int o scdere la 7,37 i respecti$ B,7D. Gn sc%imb, matricile din seria " i "", care conin doxiciclin, au $alori peste D,23, excepie fc.nd +D(/, care are p8(ul B,A3 i se degradea n proporie mai mare. 2entru regenerarea esuturilor se recomand matrici care n mediu fi iologic produc un p8 c.t mai apropiat de cel fi iologic 0 A,2(A,7, la acest p8 celulele care formea esutul &fibroblaste, c%eratinocite, endoteliale, osteoblaste etc.' de $olt.ndu(se normal. 1atricile care se ncadrea n aceste cerine sunt cele care aparin serie " i "".
1O

Ie ultatele degradrii en imatice se corelea cu re ultatele obinute pentru cedarea medicamentului, datorit probabil faptului c at.t cedarea c.t i degradarea s(au fcut n aceleai condiii# soluie de 2-=, p8 A,7 i 3A o+, spre deosebire de absorbiile de ap efectuate la temperatura camerei, n ap distilat cu p8 B,B.

>.2. C(.'*(/8/ 4-3*(5-(/(6-3 in vitro /sigurarea calitii microbiene pentru biomaterialele utili ate n medicin care intr n contact direct cu esutul are un rol crucial. 2entru a $erifica proprietile antimicrobiene ale medicamente nglobate n matricile de colagen obinute n cadrul te ei s(a determinat numrul total de germeni aerobi, precum i de fungi i le$uri, exprimat ca M4+Hcm 2, care se de $olt n matricile de colagen. =(a constatat c niciuna din matricile anali ate nu de $olt P. aeruginosa, ceea ce permite utili area acestora n tratamentele a numeroase infecii. Gn sc%imb, 1(/ i 1(- de $olt E. Coli n aceeai msur &1 M4+Hcm2', pe c.nd pentru S. aureus 1(- este suport mai XbunY, de $olt.nd 3M4+Hcm 2, spre deosebire de proba 1(/ pe care se de $olt 1 M4+Hcm2. 1atricile din seria " nu permit de $oltarea germenilor aerobi pentru niciuna din bacteriile testate. >otui, pe matricea +D(- s(au de $oltat 1 M4+Hcm 2 fungi i le$uri. +D(3,2B este stabil din punct de $edere microbilogic, datorit alde%idei glutarice, care uneori este utili at i ca de infectant. 1atricile din seria "" nu au de $oltat niciunul din microbii testai, datorit pe de(o parte pre enei acidului tanic i doxiciclinei, care sunt substane antimicrobiene, i pe de alt parte p8(ului sc ut &3,O' la care s(au obinut. Dintre matricile din seria """, niciuna nu a de $oltat E. coli, P. Aeruginosa, fungi sau le$uri. +>(23/ de $olt ns 1M4+Hcm 2 S. Aureus ceea ce se poate explica doar prin contaminarea n timpul preparrii sau al transportului matricilor. 1atricile din seria "; i ; de $olt doar S. aureus, datorit p8(ului ridicat &A,7', care pemite de $oltarea bacteriilor. Gn conclu ie, pentru testarea pe celule umane se recomand matrici ce conin doxiciclin, at.t din seria " c.t i din seria "".

>.3. B-(3(4,+'-5-/-'+'&+ 38 3&/8/& &.)('&/-+/& in vitro

19

1atricile de colagen acionea ca suporturi care facilitea de $oltarea esutului le at datorit proprietilor sale biologice. Gn plus, cele care acionea ca re er$or pentru cedare de medicamente sunt utili ate n tratamentul i profilaxia esutului infectat. +elulele endoteliale constituie tipul celular ma,or pentru $asculari area esutului nou format n procesul de $indecare. 1odul n care acestea rspund unui biomaterial este de mare importan n utili area sa ulterioar. =e tie c neo$asculari aia este un pas important n $indecarea rnilor, repre ent.nd totodat un proces definitoriu n reuita regenerrii tisulare. Dimensiunile porilor matricilor de colagen $aria ntre 33 i 733 m, ceea ce 0 teoretic 0 permite ptrunderea celulelor endoteliale n pori, acestea din urm a$.nd dimensiunile curinse ntre B i A m. Gn te s(a studiat biocompatibilitatea in vitro a celulelor endoteliale cu matricile poroase de colagen care corespund din punct de $edere microbiologic# din seriile " i "", precum i matricile martor 1(/ i 1(-. !$aluarea in vitro a biocompatibilitii matricilor studiate cu celulele endoteliale umane &linia stabili at !/ %6 92D' a artat c at.t cele nereticulate &1(/, 1(-, +D(/ i +D(-' c.t i cele reticulate cu /> &+D(>7, +D(>B i +D( >13' s(au de integrat n mediul de cultur, deci nu li s(a putut nregistra coloni area. >otui, niciuna nu a pre entat efect citotoxic. 1atricile +D(3,1B +D(3,33 i +D(>13 i(au pstrat integritatea n mediul de cultur. De remarcat c stabilitatea acestora n mediul de cultur este n concordan cu stabilitatea termic, en imatic i absorbia de ap. "maginile obinute prin microscopie de fluorescen n contrast de fa i coloraiile 8oec%st ale celulelor endoteliale coloni ate pe matricile de colagen din seria " i +D(>13 arat c acestea au permis popularea i migrarea celulelor endoteliale, datorit structurii poroase i porilor interconectai, form.nd astfel suporturi pentru regenerarea tisular. Gn ceea ce pri$ete $iabilitatea celular, nu sunt diferene semnificati$e ntre celulele endoteliale culti$ate pe matricile supuse testrii. >otui, procentul cele mai mare de $iabilitate s(a nregistrat pentru +D(3,2B &OO?' i +D(>13 &O2?', iar cel mai mic pentru +D(3,33 &A2?'. +elulele endoteliale culti$ate timp de o sptm.n pe matrici de colagen s(au anali at din punct de $edere ultrastructural, iar imaginile >!1 obinute sunt pre entate n figura 9.
23

4igura 9. "magini >!1 ale unor celule endoteliale crescute pe matricile de colagen# a' +D(3,1B@ b' +D(3,23@ c' +D(3,2B i d' +D(3,33 i e' +D(>13 Cc 0 nucleu, ; 0 $acuole, I!I 0 reticul endoplasmatic rugos, 1t 0 mitocondrii =cala# a' 3.92 Zm@ b' 2,3O Zm@ c' 1,DD Zm@ d' 3,92 Zm@ e' 2,B3 Zm +elule endoteliale cu aspect normal de $olt matricile +D(3,2B i +D(>13, care sunt biocompatibile i nu pre int efect citotoxic. 1atricile +D(3,1B, +D(3,23 i +D(3,33, cu toate c au fost coloni ate &sunt biocompatibile', celulele pre int la ni$el ultrastructural $acuole, ceea ce denot c cele trei matrici au totui un uor efect toxic@ cele mai multe $acuole apar la matricea +D(3,33, datorit probabil, /5 rmase nereacionat n timpul reticulrii. 1atricile de colagen studiate n te i selectate n urma anali elor fi ico( c%imice i biologice ndeplinesc toate aceste condiii, fiind recomandate pentru testarea in vivo.

21

II.A/'& 4+'&*-+/& 5-(*&2(*5+5-/&

1.Chitosan

+%itosanul este o poli a%arid biosintetic care este deri$at de c%itin. +%itin este o poli a%arid care apar n mod natural, care pot fi extrase din exosc%eletele crustacerilor sau generate prin procese de fermentaie fungice. +%itosanul este o(1 , 7(polimer * legate de a 2(amino(2(deoxi(D(gluco @ i desfoar astfel o sarcin po iti$ de la grupurile amine. Iata de biodegradare al polimerului este determinat de cantitatea de coninut de acetil re idual, un parametru care poate fi uor $ariat. modifi cationi c%imice de c%itosan produce materiale cu o $arietate de proprieti fi ice i mecanice . Iata de biodegradare al polimerului este determinat de cantitatea de coninut de acetil re idual, un parametru care poate fi uor $ariat. 1odificare c%imica a cationilor de c%itosan produce materiale cu o $arietate de proprieti fi ice i mecanice. De exemplu, filme c%itosan i a fibrelor pot fi formate folosind legaturi bioc%imice, adaptate te%nici pentru modificarea de la alte poli a%aride, cum ar fi tratamentul amilo cu epiclor%idrin. +um ar fi acidul %ialuronic, c%itosan nu este antigenice i este bine tolerat ca material implatant. +%itosanul a fost format n membranele i matrici potri$ite pentru esut pentru mai multe aplicaii de inginerie precum i conducte de regenerare a ner$ilor g%idat. 1anipularea matricelor de c%itosanl poate fi reali at folosind electrostatic proprietatilor ale moleculei. Ea concentratie ionica redusa , lanturile de c%itosan sunt extinse prin intermediul interaciunea electrostatice ntre amine. Fdata cu cresterea puteri ionice, distant dintre lant(lant este diminuata, ca urmare a creterii n ona de ,onciune i rigiditate a re ultatului matrice, n medie, dimensiunea porilor este crescuta. 5elurile c%itosan, pulberi, filme, i fibre au fost formate i testate pentru aplicaii cum ar fi de ncapsulare, membrana bariere, materiale lentilelor de contact, cultura de celule, i in%ibitori ai coagulari s.ngelui. 2.P(/- CD=A-)*(:- +3-0-E "n stare natural, %idroxi aci i, cum ar fi glicolic, acid lactic, au fost utili ate pentru a sinteti a o serie de polimeri biodegradabili utile pentru o $arietate de aplicatii de produse medicale. +a un exemplu, suturi c%irurgicale bioresorbable reali ate din poli &a(%idroxi aci i' au fost n utili area clinic din 19A3. /lte dispo iti$e implantabile din aceste polimeri &de exemplu, dispo iti$e de fixare interne pentru repararea ortopedice' de$in parte a protocolului c%irurgicale standard.Eegatura esterica de poli&%6droxi acid i' sunt despicate prin %idroli , ceea ce duce la o scdere n polimer a greutati moleculare &dar nu i de mas' a implantului. /ceast degradare iniial are loc p.n la greutate molecular care
22

este mai mic de B333 Da, moment n care are loc degradarea celular. Degradare final i resorbtia a implanturilor de poli&%idroxi(aci i' implica implic celule inflamatorii &cum ar fi macrofage, limfocite i neutrofile'. Dei acest stadiu rspuns tardi$ inflamator poate a$ea un efect duntor asupra unor e$enimente de $indecare, aceste polimeri au fost folositii cu succes ca matrice pentru transplant de celule si regenerarea tesuturilor. Iata de degradare a acestor polimeri este determinat de greutate molecular iniial, suprafaa expus, cristalinitatea, i &n ca ul de copolimeri' raportul dintre monomeri %idroxi aci i. 2olimeri poli &%idroxi acid' au o gam modest de proprietati mecanice i o gam modest corespun tor condiiilor de prelucrare. +u toate acestea, aceste materiale termoplastice pot fi, n general, format n filme, tuburi, i matrici folosind astfel de te%nici de prelucrare standard, astfel cum laminat, extrudare, turnare de sol$ent, i spin turnare. 2olimeri poli &%idroxi acid', de asemenea, au fost combinate cu alte materiale, de exemplu, poli &etilen glicol', pentru a modifica rspunsul celular determinat de implant i degradarea produselor sale. 3.P(/- C+4-.( +3-0-E Deoarece proteinele sunt compuse din aminoaci i, muli cercettori au ncercat s de $olte polimeri sintetici deri$ate din aminoaci i pentru a ser$i ca modele pentru, biologice, imunologice i studii structurale. Gn plus, multe tipuri diferite de poli &aminoaci i' au fost in$estigate pentru utili area n aplicaii biomedicale. 2oli &amino aci i' sunt de obicei pregtite ci polimeri are in inel de desc%idere a C(carboxi an%idridele corespun toare care sunt obinute prin reacia de aminoaci i cu fosgen. 2oli &aminoaci i' au un potenial mai multe a$anta,e ca biomateriale. Mn numr mare de polimeri i copolimeri pot fi preparate dintr(o $arietate de aminoaci i. Eanurile de pe partea laterala ofera locuri pentru fixarea de peptide mici, medicamente, ageni de reticulare, sau grupuri de nere ol$at, care pot fi folosite pentru a modifica proprietile fi ico(mecanice ale polimerului.Deoarece acesti polimeri eliberea a aminoaci ii este probabil ca procesul de degradare s demonstre e un ni$el sc ut de toxicitate sistemic. 2oli &aminoaci i' au fost in$estigate ca material de sutura, ca nlocuitori de piele artificial, i ca sisteme de li$rare de droguri.

23

F-68*+ 1# /cesta este un exemplu pentru un grup de,amino(acid deri$at din polimeri.

APLICATII
+olagenul poate fi folosit ntr(o di$ersitate de forme# soluii in,ectabile n corpul $itros al oc%iului i sub derm, pudr cu aciune %emostatic, fibre n materiale de sutur i prote e de $al$e ale inimii, filme n reparaii c%irurgicale, burei pentru implanturi dermice, forme tubulare pentru prote e $asculare sau reconstrucii de organe &esofag, tra%ee'. 5elurile c%itosan, pulberi, filme, i fibre au fost formate i testate pentru aplicaii cum ar fi de ncapsulare, membrana bariere, materiale lentilelor de contact, cultura de celule, i in%ibitori ai coagulari s.ngelui. 2oli &)(%idroxi aci i' sunt folositi ca suturi c%irurgicale bioresorbable . 2oli &amino aci i' au fost in$estigate ca material de sutura, ca nlocuitori de piele artificial, i ca sisteme de li$rare de droguri.

27