LUCRARE DE LABORATOR BIOPOLIMERI SI BIOCOMPOZITE MATASEA NATURALA.

PURIFICARE, OBTINERE DE SOLUTII SI HIDROGELURI PENTRU APLICATII BIOMEDICALE

1. Scopul lucrarii Purificarea matasii naturale Bombyx Mori, dizolvarea acesteia in bromura de litiu si obtinere de hidrogeluri tip retele semi-interpenetrante. 2. Date de literatura Coconii obtinuti din viermii de matase contin doua proteine structurale: fibroina si sericina. Fibroina este formata din doau lanturi, unul heavy cu o masa moleculara de cca 325.000 si unul light cu o masa moleculara de cca 25.000. Sericina are o masa moleculara cuprinsa intre 20.000-31.000 si cimenteaza lanturile de fibroina in cocon. Fibroina reprezinta aproximatiz 70-80 % (procenta de masa) din coconul de matase, sericina 20-30 % in functie de origine si conditiile de cultivare. Matasea mai contine si alti component minori precum grasimi , pigmenti, component minerali sau carbohidrati asa cum se observa in tabelul 1. Tabel 1. Compozitia coconilor de matase din Bombyx mori COMPONENT FIBROINA SERICINA GRASIMI SI CEARA CARBOHIDRATI ELEMENTE ANORGANICE PIGMENTI TOTAL % (PROCENTE MASICE) 70-80 20-30 0.4-0.8 1.2-1.6 0.7 0.2 100

Fibroina este cea mai simpla proteina structurala in ceea ce priveste compozitia si secventa de aminoacizi. Ea este in principal constituita din glicina, alanina si serina in proportie de 3:2:1. Acesti aminoacizi reprezinta aproximativ 60 % din regiunile cristaline ale fibroinei si au urmatoarea secventa: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser Alti aminoacizi ce contin grupari voluminoase precum arginina, treonina sau tirosina nu se pot gasi in zonele cristaline, ci numai in cela amorfe ale lantului proteic si au urmatoarea secventa:

Thr-Gly-Ser-Ser-Gly-Phe-Gly-Pro-Tyr-Val-Ala-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-ArgArg-Glu-Gly-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Trp-Ser-Ser-Lys-Ser-Asp-Phe-Glu-Thr Tabel 2. Compozitia fibroinei din Bombyx mori in aminoacizi (reziduu/1000 g proteina fibroasa AMINOACID Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Serina Treonina Acid aspartic Acid glutamic Lisina Arginina Histidina Tirosina Fenilalanina Prolina Triptofan Metionina Cisteina CANTITATE 446.0 294.0 22.0 5.3 6.6 121.0 9.1 13.0 10.2 3.2 4.7 1.4 51.7 6.3 3.6 1.1 1.0 2.0

Fibrele de matase pot fi utilizate in multe domenii precum textile, in scop medical sau industrial. Matasea prezinta stabilitate foarta buna in multe medii de reactive, in comparatie cu proteinele globulare, datorita legaturilor extinse de hidrogen, naturii hidrofobe a proteinelor si cristalinitatii semnificative. Fibrele de matase sunt lungi, subtiri, usoare si catifelate. Printre proprietatile lor se numara: termotoleranta, umectabilitatea, afinitatea pentru uscare, bun izolator si luciul puternic. Datorita acestor caracteristici, fibrele de matase se pot utiliza pentru producerea textilelor, parasutelor, vaselor de sange artificiale, suturilor chirurgicale precum si in multe alte domenii. Studii recente asupra fibroinei au demonstrat ca aceasta este una dintre cele mai promitatoare substante pentru biotehnologii si materiale biomedicale datorita proprietatilor unice precum: biocompartibilitate buna, permeabilitate buna a oxigenului si vaporilor de apa, biodegradabilitate, reactii inflamatorii minime, rezistenta microbiana sau compatibilitate cu

sangele. Multe dintre aceste caracteristici ale fibroinei au fost atribuite zonelor amorfe si nu zonelor cristaline. Fibroina regenerata a fost folosita ca sutura, aditiv pentru mancare sau cosmetice. Noi domenii de utilizare sunt eliberarea controlata a medicamentelor, lentile de contact cu permeabilitate pentru oxigen, protectia ranilor, substrat pentru cultura de celule, imobilizarea enzimelor sau obtinerea de vase de sange artificiale. Materialele pe baza de fibroina utilizate pentru vindecarea ranilor au avantajul ca grabesc procesul de vindecare si pot fi usor indepartate fara a rani tesutul nou format. Fibroina poate fi folosita pentru fabricarea membranelor de separare a mixturilor de apa si alcool. Ea a fost de asemenea folosita pentru vindecarea arsurilor, pentru formarea tesutului osteogenic sau pentru refacera articulatiilor genunchiului. Fibroina a fost pana acum legata de celuloza, PVA, poliuretani, acetat de celuloza, poliglutamat de sodiu, polietilen glicol etc. Fibroina din matase are avantajul ca poate fi prelucrata in filme, geluri, pudre sau spume cu o rezistenta foarte buna. Fibroina pudra a fost folosita pentru obtinerea materialelor nanocompozite hidroxiaptita-fibroina in scopul de a produce os artificial si radacini dentare Fibroina sulfonata are actiune anti-HIV-1. Ea poate fi de asemena folosita in locul colagenului ca substrat pentru cultura celulelor animale. Studii anterioare au demonstrat ca fibroina poate fi legata de colagenul recombinat uman (RHLC, recombinant human like collagen) pentru a prepara un nou tip de film biocompatibil utilizat in aplicatii ale tesutului hepatic. Proteina fibroasa este un material biologic folosit pentru fabricarea pielii artificiale. Membrana de fibroina poate fi folosita ca fotosenzor pentru analiza peroxidului de hidrogen. Hidrogeluri de matase Hidrogelurile sunt reele polimerice 3D ce utilizeaz polimeri stabili din punct de vedere fizic i chimic si sunt capabili de a absorbi o cantitate mare de ap fr a-i modifica structura. Abilitatea lor de a imita esutul uman ct i capacitatea de a rspunde la stimulii externi le-au fcut foarte importante asigurndule aplicaii n domeniul ingineriei esuturilor, eliberarea controlat a dispozitivelor, biosenzori, activatori mecanici ,etc. Studiile anterioare referitoare la fibroin sub forma de gel au arata ca formarea si stabilitatea acestora depinde de concentraia fibroinei, temperatur i pH. Pentru obinerea unor hidrogeluri cat mai stabile, fibroina a fost amestecat cu ali polimeri ce includ molecule sintetice ca alcool polivinilic, macromolecule naturale ca gelatina, colagenul, elastina, etc.

3. Partea experimentala Purificarea matasii naturale din Bombyx mori Coconii de matase de Bombyx mori se spala cu o solutie 0.02 M CaCO 3 si NaHCO3 la fierbere timp de 30 min. Se adauga si dodecilsulfat de sodiu. Operatia se repeta de 3 ori. La final se spala bine cu apa distilata pentru indepartarea completa a sericinei. In urma acestui proces de degomare rezulta fibra purificata de fibroina care va fi supusa testelor ulterioare. Obtinerea solutiilor de fibroina Datorita gradului mare de cristalinitate si a legaturilor de hidrogen, fibroina este insolubila in majoritatea solventilor cunoscuti. Fibroina se dizolv totusi in solutii de bromura de litiu concentrate (9,5M, 10,5M sau 11M) sau in amestecuri CaCl2/CH3CH2-OH/H2O. Fibroina este dizolvata in solutie de LiBr 10,5M la temperatura de 55C timp de 2-4h (solutie fibroina 3%). Solutia rezultat este dializata timp de 4-5 zile pentru inlaturarea ionilor de Li din solutia rezultata si apoi este pastrata in frigider pentru utilizari ulterioare. Obtinerea hidrogelurilor de fibroina si poliacrilamida Pentru obtinerea hidrogelurilor pe baza de firboina si poliacrilamida (F/PAA) se alege initial un raport volumetric 50/50 intre solutie de fibroina si cea de acrilamida. Hidrogelurile se obtin prin polimerizarea acrilamidei in solutie de fibroina 3%. Reactie este initiata de un sistem redox format din persulfat de potasiu (K2O2S8 ) si trietanolamina (TEA): raport gravimetric KP/TEA = 1/2; TEA/AA = 1/100. Reactia de polimerizare are loc la 35-40 C timp de 4 zile (pentru exemplificare in cadrul laboratorului se vor alege geluri pregatite anterior). Hidrogelurile tip retele semi-interpenetrante obtinute au sunt extrase cu un amestec metanol/apa distilata pentru inlturarea monomerului rezidual (acrilamida). Evaluarea gradului de gonflare pentru hidrogelurile F/PAA Din punct de vedere practic este foarte important sa se cunoasca capacitatea biopolimerilor reticulati de a se gonfla in lichide sau medii de vapori diferite. Aceasta capacitate este exprimata prin gradul de gonflare, ce reprezinta cantitatea de lichid (sau vaporii acestuia) absorbit de unitatea de masa sau de volum a polimerului. Gradul de gonflare poate fi determinat prin metoda gravimetrica sau volumetrica.

Metoda gravimetrica - consta in cantarirea hidrogelului inainte (perfect uscat) si dupa diferiti timpi de gonflare si calculul gradului de gonflare gravimetric cu relatia: GG = W W0 W0

unde: W= masa hidrogelului la timpul t de gonflare (g) si W0 = masa hidrogelului uscat (g). Timpi de gonflare se vor alege la inceputul laboratorului de comun acord pentru desfasurarea optima a lucrarii. 4. Rezultate Se vor calcula gradele de gonflare pentru 3 probe de hidrogel fibroina/PAA (compozitie 50/50) la diferiti timpi alesi la inceputul lucrarii. Datele obtinute pentru cele 3 probe vor fi analizate si comparate de fiecare echipa de lucru. 5. Concluzii Fiecare echipa de lucru va prezenta un referat in care se vor prezenta aspectele teoretice si practice ale lucrarii de fata. Se vor discuta aspecte legate de purificarea matasii, dizolvarii fibroinei si obtinerii hidrogeluri pe baza de fibroina si poliacrilamida. Se va discuta mecanismul formarii retelelor semi-interpenetrante si se vor intepreta valorile gradelor de gonflare obtinute functie de structura hidrogelurilor. Se vor analiza eventualele utilizari ale acestor hidrogeluri.