Determinarea conţinutului de proteine prin metoda Kjeldahl

Metoda Kjeldahl cuprinde 3 etape principale:

1. Digestie
2. Distare
3. Titrare

Etapa 1 – DIGESTIA
Scopul digestiei este ruperea legăturilor dintre polipeptide şi transformarea acestora în
molecule mai simple (cum ar fi apa, dioxidul de carbon și sulfatul de amoniu). Aceste reacții pot fi
accelerate de temperatura utilizată în timpul digestiei (cu cât temperatura utilizată este mai mare, cu
atât digestia este mai rapidă) și prin prezența acidului, a sării și a catalizatorilor (seleniu, cupru,
mercur, titan). Vaporii emanaţi din tuburi sunt aspiraţi prin capacul de aspirare printr-o pompă de
recirculare a apei JP și eliminaţi într-un scruber SMS. Această configurație optimizează eficiența
operației. Se va evita utilizarea digestoarelor fără un sistem de evacuare întrucât acest lucru va
reduce semnificativ durata de viaţă a aparatului și ar putea provoca pagube costisitoare.
Digestia este etapa cu cea mai mare durată din această analiză şi este redată în graficul:

Cântarirea Adăugarea acidului şi Pregătire pentru

probei catalizatorului digestie

Digestie Răcire Probă pentru distilare

Cântărirea probei: se cântăresc aproximativ 1-3 g din proba de analizat şi se notează masa
probei (în cazul probelor sub formă de pulbere, dimensiunea particulelor trebuie redusă <1 mm;
probele trebuie omogenizate înainte de efectuarea oricărei operaţii). Dacă proba este lichidă, se va
1
măsura volumul cu o pipetă şi se va transfera într-un pahar, unde se va omogeniza cu o bară
magnetică. Dacă este necesar se va elimina CO2 din probă (de exemplu la băuturile carbogazoase).
Adăugarea acidului şi catalizatorului: în tubul de digestie, care conţine proba, se adaugă
12-20 ml de acid sulfuric concentrat, după cum se specifică în metodă. Cantitatea totală de acid
necesară digestiei poate varia de la un tip de probă la altul. Un alt factor care trebuie considerat sunt
pierderile de acid care au loc ca urmare a evaporării prin sistemul de evacuare utilizat. Aparatul este
prevăzut cu un sistem de control al pierderilor de acid (aproximativ 1,2 ml acid/probă).
O problemă întâlnită în timpul digestiei este pierderea probei de analizat prin uscare, proces
denumit „efect de sare” care apare datorită unui debit prea mare.
Se adaugă tabletele de catalizator, care sunt selectate în funcţie de analiză, după cum
urmează:
 VELP KjTabsTM VCM: sunt recomandate în cazul în care este necesară o cantitate redusă
de cupru (A00000274);
 VELP KjTabsTM VKPC: sunt recomandate în cazul în care este necesară o cantitate
ridicată de cupru (A00000275);
 VELP KjTabsTM VCT: sunt destinate probelor la care digestia are loc mai greu şi au ca
efect accelerarea procesului (A00000276);
 VELP KjTabsTM VST: sunt recomandate pentru uleiuri sau probe cu un conţinut mare de
grăsimi (A00000277);
 VELP KjTabsTM VTCT: sunt similare tabletelor VCT, însă au o masă mai redusă
(A00000281);
 VELP KjTabsTM VW: sunt recomandate pentru aplicaţii bazate pe metoda Wieninger
(A00000282);
 VELP KjTabsTM VS: sunt tablete care împiedică spumarea (A00000283).
Cuprul dă rezultate satisfăcătoare, însă reacţionează foarte greu; utilizarea cuprului are
impact redus asupra mediului înconjurător. Catalizatorul pe bază de seleniu reacţionează foarte
repede şi este utilizat de obicei pentru probe la care digestia este dificilă (de exemplu grăsimi şi
uleiuri).
Pregătire pentru digestie: se selectează programul din meniu (cele mai utilizate aplicații sunt
preinstalate, iar altele sunt programabile de utilizator). Prin apăsarea tastei Meniu, Programs se
poate alege care program standard se doreşte a fi selectat sau se poate crea un nou program
personalizabil. Se coboară probele în blocul de încălzire din aluminiu (este rezistent şi nu necesită
întreținere) și se încălzeşte amestecul din tuburi la temperatura indicată în Metoda Standard. Blocul
de încălzire din aluminiu asigură cea mai bună omogenitate posibilă pe toate tuburile și o digestie
completă în fiecare tub. Poate atinge atinge temperatura de 450 °C, asigurând o recuperare a azotului
de peste 99% în etapele următoare.
Digestie: se încălzeşte amestecul pentru durata de timp indicată în metodă pentru a obține o
soluție clară și incoloră. În această fază, acidul sulfuric reacționează cu proba transformând tot

2
azotul în formă organică în formă anorganică, care este stabilă și poate fi determinată.
Dacă apare vreo problemă în timpul procesului și/sau dacă pregătirea probelor nu a fost
corectă, se poate observa prezența reziduurilor de carbon (colorate în negru) în amestecul supus
digestiei și pe pereții tuburilor. Acestea indică o mineralizare incompletă a probei care nu poate fi
procesată în continuare.
Răcire: se ridică probele din blocul de încălzire din aluminiu şi se lasă să se răcească fără a
se interveni prin metode rapide de răcire. După răcire, probele sunt supuse distilării.

Etapa 2 – DISTILAREA

Distilare, UDK 149 Poziţionarea tubului Poziţionarea paharului

Adăugare de H2O, NaOH şi H3BO3 Îndepărtare reziduuri Distilat

Sulfatul de amoniu prezent în proba obţinută în urma digestiei este amoniac (gaz), care este
încălzit și distilat. Amoniacul este dus într-o soluție de captare a acidului, unde se dizolvă și devine
din nou ion de amoniu. Folosind metoda Kjeldahl, nitriţii și nitrații nu sunt detectați. Pentru a
cuantifica aceste elemente, este necesară o reducere a eșantionului (folosind aliaj Devarda) înainte
de stadiul de digestie.
 Se adaugă apă distilată sau deionizată în eprubeta care conține proba pentru a o dilua. În
acest fel, este mai ușor să se determine tot amoniacul din probă.
 Se separă azotul din amestec prin distilare cu abur (producţie reglată la 10-100%), pentru a
extrage amoniacul din soluția alcalină.
 Se creşte pH-ul amestecului folosind hidroxid de sodiu (35%) pentru a converti NH 4+ (în
3
 formă solid) în NH3 (gazos), care va fi determinat prin titrare.
 Se captează vaporii distilați într-o soluție dedicată de 25-30 ml acid boric pentru a capta tot
azotul, eliminând riscul de pierdere.
Etapa finală este titrarea amoniacului distilat din din probă, având în vedere că, dacă
conținutul de azot este mare, este necesar un acid concentrat pentru titrare. O altă soluție este
reducerea cantității de probă utilizată pentru analiză, dar în unele cazuri poate provoca erori care duc
la rezultate greșite.

Etapa 3 – TITRAREA
Scopul titrării este determinarea cantităţii de amoniac din probă şi astfel calcularea
conţinutului de azot sau proteină, exprimat în %.
Una dintre cele mai utilizate soluții indicatoare este indicatorul Tashiro, care se adaugă în
soluția de acid boric. Punctul final corespunde unei culori gri/roz. Soluția de acid este adăugată în
proba care conține amoniac distilat de către analist, folosind o biuretă. Se înregistrează volumul
soluției de acid care a fost necesar pentru a atinge punctul final și se face calculul final pentru a
determina cantitatea de azot din probă, exprimată în % N sau % proteine.