Proteine, Peptide i Aminoacizi

Proteinele reprezint dup ap constituenii cei mai importani ai organismelor vegetale i animale. n aceste organisme, proteinele ndeplinesc roluri multiple i variate: intr n structura celulelor din diverse esuturi i organe, sunt constitueni principali ai enzimelor, au rol n aprare, sunt hormoni ce intervin n reglarea proceselor metabolice. Indiferent de originea lor, de specia de la care provin, proteinele sunt constituite din 20 aminoacizi deosebii structural unii de alii, ceea ce confer proteinelor o diversitate i o complexitate extraordinar. Deoarece numeroase proprieti ale proteinelor se datoresc faptului c sunt constituite din aminoacizi, este necesar n prealabil prezentarea aminoacizilor care intr n constituia lor, precum i unele proprieti ale acestora. n afara faptului c reprezint unitile funcionale ale lanurilor polipeptidice i proteice, L--aminoacizii i derivaii lor particip la desfurarea unor funcii biologice diverse, cum ar fi transmiterea impulsului nervos, biosinteza porfirinelor, purinelor, pirimidinelor, ureei, etc. Polimeri mici ai aminoacizilor numii peptide joac roluri importante n sistemul neuro-endocrin, acionnd ca hormoni, regulatori ai secreiei hormonale, neuromodulatori, neurotransmitori. n timp ce proteinele conin numai L--aminoacizi, microorganismele pot sintetiza peptide care conin att L-- ct i D--aminoacizi. Unele dintre aceste polipeptide au o valoare terapeutic acionnd ca antibiotice (bacitracina, gramicidina S) sau ca ageni antitumorali (bleomicin). Alte peptide microbiene pot fi toxice. De exemplu microcistina i nodularina, peptide secretate de cianobacterii, sunt letale n doze mari, n timp ce n doze mici induc apariia unor tumori hepatice. Oamenii i organismele superioare sunt incapabile s sintetizeze n cantiti suficiente pentru funcionarea normal a organismului 10 din cei 20 L--aminoacizi, astfel nct este important ca hrana s conin cantiti suficiente din aceti aminoacizi eseniali.

1. Aminoacizii Aminoacizii reprezint o clas de compui difuncionali cu o semnificaie biologic deosebit, datorit faptului c ei sunt unitile de baz care intr n alctuirea proteinelor. Deoarece cele dou grupri funcionale dintr-un aminoacid sunt una cu caracter acid i cealalt cu caracter bazic, aceti compui sunt amfoteri, iar molecula lor exit preponderent sub form desare intern sau amfion (zwitterion). De exemplu glicina, cel mai simplu aminoacid se prezint mai curnd ca afion dect ca specie neionizat.

+ H3NCH2COO
amf ion (zwitterion)

H2NCH2COOH
f orma neionizata

Aminoacizii i datoreaz importana faptului c au capacitatea de a forma o legtur amidic ntre dou molecule de aminoacid. O astfel de legtur se numete legtur peptidic , iar compuii rezultai se numesc peptide.

legatura peptidica

O + H3NCH2C

NHCH2COO

glicil-glicina dipeptida

n funcie de numrul aminoacizilor componeni putem ntlni di-, tri-, tetra-, oligopeptide. Pe msur ce numrul aminoacizilor componeni crete , se obin polimeri care alctuiesc clasa polipeptide. Proteinele sunt polipeptide a cror secven de aminoacizi este determinat genetic . 1.1. Aminoacizi care intr n constituia proteinelor (aminoacizi proteinogeni) Prin hidroliza acid, bazic sau enzimatic a proteinelor, rezult -aminoacizi, care reprezint unitile chimice de baz ale macomoleculelor proteice.

COOH C H2N

COOH H2N

R H

R
proiectie Fischer L--aminoacid (conf iguratie S)

f ormula perspectiv ica

Din cei peste 300 aminoacizi naturali, numai 20 sunt cei care intr n alctuirea proteinelor, acest lucru fiind determinat prin codul genetic, care este u niversal pentru toate vieuitoarele. Structura celor 20 aminoacizi este prezentat n Tabelul 1, mpreun cu abrevierile acceptate n mod convenional (de trei litere i de o liter). Ambele tipuri de abrevieri pot fi utilizate pentru a reprezenta succesiunea aminoacizilor n peptide i proteine.

Tabelul 1. -Aminoacizi naturali care intr n alctuirea proteinelor. Structurile prezentate sunt cele care predomin la pH-ul fiziologic (pH = 7,3 pentru om). pKa1 pKa2 pKa3 Abundena (R) Nume Simbol Formul structural medie n ((structura COOH) NH2) proteinelor Aminoacizi cu lan alifatic monoamino monocarboxilici Glicin
H H C COO NH3 +
H CH 3 C COO NH3 +
CH 3CH H C COO

Gly (G)

2,4

9,8

7,5%

Alanin

Ala (A)

2,4

9,9

9.0%

Valin*

Val (V)

2,2

9,7

6.9%

CH3 NH3 +

Leucin*

Leu (L)

H CH3CHCH2 C COO CH3 NH3 +

2,3

9,7

7.5%

Izoleucin*

Ile (I)

H CH3CH2CH C COO CH3 NH3 +

2,3

9,8

4.6%

Aminoacizi cu grupri hidroxil (OH) Serin

Ser (S)

H HOCH2 C COO NH3 +

H CH 3CH C COO OH NH3 +

2,2

9,2

13

7.1%

Treonin*

Thr (T)

9,2

9,1

13

6.0%

Tirozin*

Vezi mai jos

Aminoacizi cu sulf Cistein Cys (C)

H HSCH2 C COO NH3 + H CH3SCH2CH2 C COO NH3 +

1,9

10,8

8,3

2.8%

Metionin*

Met (M)

2,1

9,3

1.7%

Aminoacizi monoaminodicarboxilici i amidele lor Aspartat

acid aspartic

Asp (D)

OOCCH2 CH-COO NH3 +

2,0

9,9

3,9

5.5%

Glutamat
acid glutamic

Glu (E)

OOCCH2CH2 CH-COO NH3 +

2,1

9,5

4,1

6.2%

O
Asparagin Asn (N)

H2NCCH2 CH-COO NH3 +

O H2NCCH2CH2 CH-COO NH3 +

2,1

8,8

4.4%

Glutamin

Gln (Q)

2,2

9,1

3.9%

Aminoacizi cu grupri bazice Lizin* Lys (K)

+ H3NCH2CH2CH2CH2 CH-COO NH3 +
+ NH2

2,2

9,2

10,8

7.0%

Arginin*

Arg (R)

H2NCNHCH 2CH2CH2 CH-COO NH3 +

1,8

9,0

12,5

4.7%

Histidin*

His (H)

H CH2 C COO N NH NH3 +

4

1,8

9,3

6,0

2,1

Aminoacizi cu resturi fenil Fenilalanin* Phe (F)

CH2 CH-COO NH3 +

2,2

9,2

3,5%

Tirozin

Tyr (Y)

HO

CH2 CH-COO NH3 + Aminoacizi heterociclici

2,2

9,1

10,1

3,5%

Histidin* Prolin

His

Vezi mai sus O

N + CO H -

Pro (P)

2,0

10,6

4,6

H CH2 C COO
Triptofan* Trp (W)

NH3 + N H

2,4

9,4

1,1

*Aminoacizi eseniali Aminoacizii naturali care intr n compoziia poteinelor difer doar prin substituentul R ataat la carbonul . Marea varietate a acestor substitueni laterali este ceea ce confer proteinelor diversitatea lor structural i n consecin marea lor diversitate funcional. Codul genetic specific 20 L -aminoacizi care intr n constituia proteinelor. Unele proteine conin i ali aminoacizi care apar datorit modificrii biochimice a unui aminoacid deja prezent n protein. Astfel de transformri includ conversia unei peptidil-lizine sau peptidil proline n peptidil-hidroxilizin i respectiv peptidilhidroxiprolin, metilarea, formilarea, acetilarea, fosforilrea, etc. a diverselor resturi aminoacil. Astfel de modificri mresc gradul de complexitate al proteinelor producnd modificri ale solubilitii, stabilitii, ca i asupra interaciilor cu alte proteine. Toi cei 20 de aminoacizi au o serie de caracteristici stucturale comune: au o grupare amino n poziie , cu excepia prolinei, care conine o grupare imino , membr a unui ciclu pirolidonic; 5

cu o singur excepie, glicina, toi aminoacizii au atomul de carbon chiral (centru de chiralitate), avnd deci activitate optic; atomul de carbon are configuraie S (cu excepia cisteinei, explicai de ce!); n proiecie Fischer gruparea NH2 este orientat spre stnga, deci aminoacizii naturali sunt L --aminoacizi;

prezena simultan a celor dou grupri, carboxilic si amino, nvecinate spial, face posibil formarea legturii peptidice, legtur cu mare importan biologic.

Cu excepia glicinei, atomul de carbon din poziia este chiral, deci unii aminoacizi sunt dextrogiri iar alii sunt levogiri. Toi au aceeai configuraie cu L-glicerinaldehida, deci fac parte din seria L . Exist un numr de -aminoacizi liberi cu roluri importante n procesele metabolice. De exmplu ornitina, citrulina i argininosuccinatul particip la sinteza ureei; tirozina i a parte la formarea hormonilor tiroidieni; glutamatul este implicat n biosinteza unor substane neurotransmitoare. Exist i D-aminoacizi care se ntlnesc n natur: D -serina i D-aspartatul se gsesc n esutul cerebral; Dalanina i D-glutamatul se gsesc n pereii celulari ai bacteriilor gram-negative, etc. 1.2. Aminoacizi care nu intr n constituia proteinelor n afara celor 20 aminoacizi care intr n structura proteinelor, n natur exist o serie de aminoacizi care sunt constitueni ai altor biomolecule sau produi intermediari n diferite procese biochimice.

Tabelul 2. Aminoacizi neproteinogenici Formul Denumire -alanin Acid aminobutiric (GABA) sarcozin betain

Rol biologic component a dipeptidelor carnozin i anserin a acidului pantotenic i coenzimei A transmiterea impulsului nervos; agent de blocare a sinapselor utilizat n tratamentu cancerului rol lipolitic

H2N-CH2-CH2-COOH H2N-(CH2)3-COOH

H3C-NH-CH2-COOH

H2 C COO+ N(CH3)3
H2N-CH2-CH2-SO3H

taurin

component a acizilor biliari

H H2 N-(CH2)3 C COOH NH2

O H H2N C HN-(CH2)3 C COOH NH2

ornitin

intermediar al cilului ureogenetic

citrulin

intermediar al cilului ureogenetic

1.3. Proprietile aminoacizilor Gruprile COOH i cea NH2 pot exista att n forma neutr, cat i n form ionizat.

R-COOH R-NH3+

R-COO- + H+ R-NH2 + H+

Aminoacizii pot fi ncrcai pozitiv, negativ, sau pot avea sarcina net zero. Dei ambele grupri RCOOH i R-NH3+ sunt slab acide, R-COOH este mult mai tare dect R-NH3+. La pH-ul fiziologic (pH = 7,3-7,4) gruprile carboxil se gsesc preponderent n stare ionizat R -COO-, iar gruprile amino predominant ca R-NH3+. Moleculele care conin un numr egal de grupri ionizabile cu sarcini opuse se numesc amfioni sau zwitterioni.
R H OH O
A

H2N

R + H3N

H O O

amf ion (zwitterion) B

Aminoacizii din fluidele biologice (snge, majoritatea esuturilor) trebuie sc scrii ca amfioni. Structura B nu poate exista ntr-o soluie apoas deoarece la orice pH suficient de mic pentru a protona gruparea carboxil, gruparea amino va fi i ea protonat. Analog, al un pH suficient de mare pentru ca gruparea amino neprotonat s predomine, gruparea caroxil va dona i ea un proton, transformndu -se n carboxilat, -COO-. Formula B se folosete ns de multe ori atunci cnd reaciile nu implic echilibre acido-bazice. Mai jos este prezentat efectul pH-ului asupra gradului de ncrcare electric a acidului aspartic. 7

O O OH + NH3 HO O
n mediu puternic acid (pH < 1) sarcina net = +1

H+
pKa1 =2,09 ( -COOH)

O OH + NH3 O
pH 3, sarcina net = 0

H+
pKa2 =3,86 ( -COOH)

O + NH3 O

H+
pKa3 =9,82 (-NH3+)

O NH2 O

pH 6-8, sarcina net = - 1

n mediu puternic bazic (pH > 11) sarcina net = - 2

Tria aminoacizilor este exprimat de indicele pKa (Tabelul 1). Gruparea imidazol din histidin i gruparea guanidino din arginin exist sub forma unor hibrizi de rezonan cu sarcina pozitiv distribuit ntre cei doi atomi de azot (histidin) sau cei trei atomi de azot (arginin).

R
N H

+ N

H NH2 + RNH=C-NH2

+N H

+ NH2 RNH-C-NH2

NH2 + RNH-C=NH2

O specie molecular care are un numr egal de sarcini pozitive i negative este neutr din punct de vedere electric (form izoelectric). Valoarea pH-ului la care moleculele de aminoacid sunt au suma de sarcini negative egal cu suma sarcinilor pozitive este cunoscut ca pH-ul izoelectric (pI) al aminoacidului respectiv. La pH-ul izoelectric, sarcina net a unui aminoacid este zero. n cazul unui aminoacid monoamino monocarboxilic,
pKa1 + pKa2 2
2,35 + 9,69 2

pI =

De exemplu, pI pentru alanin este :

pI = = 6,02

Pentru acizii polifuncionali, pI este tot o medie ntre pKa-urile aflate de o parte i de alta a pI-ului. De exemplu, pI pentru acidul aspartic este:
pKa1 + pKa2 2 pKa2 + pKa3 2

pI =

2,09 + 3,96 2

= 3,02

iar pentru lizin,

pI = = 9,2 + 10,8 2 = 10

Calcule similare se folosesc i pentru acizii poliprotici (de exemplu proteinele), indiferent de numrul gruprilor disociabile prezente. Valoarea pKa a unei grupri disociabile este un parametru care depinde de natura mediului care nconjoar gruparea respectiv. Vecintatea unei grupri disociabile poate influena pKa-ul gruprii. Valorile pKa ale gruprilor R (prezentate in Tabelul 1) reprezint valori determinate n soluii apoase pure ale aminoacizilor respectivi. Aceste valori ne dau doar o idee asupra valorilor pKa ale acelorai aminoacizi cnd sunt prezeni ntr-o protein. Un mediu polar favorizeaz o form ncrcat electric (R-COO- sau R-NH3+), pe cnd un mediu nepolar favorizeaz apariia formelor nencrcate electric (R COOH i R-NH2). Aadar, un mediu nepolar mrete valoarea pKa gruprii carboxil (fcnd -o un acid mai slab) dar n acelai timp scade pKa-ul unei grupri amino (fcnd -o un acid mai tare). Existena unor grupri adiacente ncrcate electric poate s accentueze sau s diminue ze efectele solventului. Prin urmare, pKa-ul unei grupri funcionale este dependent de poziia sa n molecula de protein. n funcie de vecintile unei grupri, pKa-ul su se poate schimba chiar cu cteva uniti de pH. Diferene de 2 -3 uniti de pH fa de valorile pKa prezentate n Tabelul 1. sunt frecvente n special n situsurile active ale enzimelor. Ca un exemplu extrem, un reziduu de acid aspartic ngropat n structura unei enzime numit tioredoxin are pKa > 9, observndu-se un salt mai mare de 6 uniti de pH. Solubilitatea i punctul de topire al aminoacizilor: dovad a caracterului lor ionic. Prezena gruprilor ncrcate electric in structura lor fac e ca aminoacizii s fie solubili n solveni polari (ap, etanol), dar insolubili n solveni nepolari (benzen, hexan, eter). Aminoacizii sunt substane solide, albe, cristalizate. Anumii aminoacizi sunt mai greu solubili n ap (tirozina, cisteina). Datorit acestei insolubiliti, cisteina n anumite condiii formeaz o calculoz renal cisteinuria. Aminoacizii nu absorb n domeniul vizibil, aa nct sunt substane incolore. Tirozina, fenilalanina i mai ales triptofanul prezint un maxim de absorbie n UV (250 -290 nm), prin urmare prezena 9

triptofanului n structura unei proteine i confer acesteia proprietatea de a absorbi lumina ultraviolet n jurul valorii de 280 nm. Gruprile -R sunt importante pentru proprietile unui aminoacid. De multe ori glicina, cel mai mic aminoacid (R = H), este gsit n locurile unde lanul proteic se n doaie puternic, deoarece ea poate ptrunde n locurile inaccesibile celorlali aminoacizi. Gruprile R hidrofobe din fenilalanin, tirozin i triptofan se gsesc n special spre interiorul proteinelor citosolice. Gruprile R ncrcate electric din aminoacizii cu caracter bazic sau acid stabilizeaz conformaia unei molecule proteice prin intermediul legturilor ionice. Astfel de grupri funcioneaz ca tafete de sarcin n timpul catalizei enzimatice. Histidina, de exemplu, joac un rol unic n cataliza enzimatic, datorit pKa-ului protonului imidazolic care i permite s funcioneze la pH-ul fiziologic att ca acid ct i ca baz. Gruprile OH din serin sau SH din cistein sunt buni ageni nucleofili i pot funciona ca atare n cataliza enzimatic. n acelai timp, gruparea OH (alcool secundar) din treonin, dei un bun nucleofil, nu se bucur de aceeai importan n cataliza enzimatic. Gruprile OH din serin, treonin i tirozin pot participa la reglarea activitii unor enzime a cror activitate enzimatic depinde de gradul de fosforilare a acestor grupri. Gruprile funcionale determin reactivitatea chimic a aminoacizilor. Gruprile funcionale ale aminoacizilor prezint majoritatea reaciilor caracteristice gruprii respective. Astfel, gruparea carboxil din aminoacizi se poate esterifica, poate forma amide, anhidride, cloruri acide, azide; gruprile amino se pot acila, gruprile OH i SH se pot oxida, esterifica, etc. Aminoacizii dau o reacie de culoare cu ninhidrina, reacie des utilizat pentru detectarea i cuantificarea aminoacizilor. Ninhidrina formeaz un produs purpuriu cu gruparea -amino din aminoacizi i un produs galben cu gruparea imino din prolin i hidroxiprolin. n urma reaciei cu ninhidrina, numai azotul gruprii amino apare n produsul final.

10

O OH OH
ninhidrina

O + RCHCOO
aminoacid

NH2

+ H2O

O H .. . N C C O .. . R O + H2O

O NH2 O
O O O

O N CHR O + HO -

.. . O .. . N CHR O H O H + CO2

O + RCH

O N O

O + HO -

O N O

O + H2O O

H O

produs colorat

Reacii ale gruprii carboxil cu importan biologic Formarea de amide constituie un proces de mare importan biologic, avnd loc n mod continuu n organism.

O HO O O
Glu

NH3

H2O

O H2N O O
Gln

NH + 3 O
NH3 H2O

NH + 3 O

O O OH NH + 3
Asp

O NH2 NH3 +
Asn

11

-Aminoacizii se pot decarboxila, formnd aminele respective. Reaciile de decarboxilare a aminoacizilor sunt catalizate de enzime numite aminoacid decarboxilaze care aparin clasei liazelor i folosesc drept coenzim piridoxal fosfatul (derivat de la vitamina B6).

O R NH + 3
Multe amine produse n organism prin decarboxilarea aminoacizilor au aciuni remarcabile, sau sunt intermediari n diverse reacii metabolice.

aminoacid decarboxilaza

R NH2 + CO2

Tabelul 3. Exemple de amine biogene formate prin decarboxilarea aminoacizilor n organism Aminoacidul Denumirea Formul Rol biologic de origine aminei Glu acid aminoglutaric cisteamin etanolamin cadaverin tiramin histamin HOOC-(CH2)3-NH2 mediator chimic; transmiterea impulsului nervos

Cys Ser Lys Tyr

HS-CH2-CH2-NH2 HO-CH2-CH2-NH2 H2N-(CH2)5-NH2 HO-C6H4-(CH2)2-NH2

component al coenzimei A component al fosfolipidelor diamin toxic hipertensiv, contracia uterului

His

CH2 -CH2 -NH2 N N H

mediator chimic; transmiterea impulsului nervos

Reacii ale gruprii amino Alchilarea aminoacizilor poate avea loc in vitro n prezena iodurii sau sulfatului de metil, sau poate avea loc in vivo sub aciunea unei substane specializate pentru aceast reacie: metionina activat sau S-adenozil-metionina (SAM). 12

H2C COO NH2

Gly

SAM

H2C COO N(CH3)3 +

betaina

Betaina se administreaz n cazurile de insuficien hepatic. Dezaminarea este o reacie prin care aminoacizii se transform n cetoacizi, intermediari metabolici de mare importan.
NAD+
+ NADH + H

H R C COO NH2
-aminoacid

O -R C COO
-cetoacid

deaminaza

Cea mai important reacie a aminoacizilor o constituie formarea legturii peptidice (legturile ncercuite).
+ NH3
O O N H SH O O

H N

alanil-cisteinil-glicina

1.4. Aminoacizi eseniali Biosinteza proteinelor specifice unui organism este direct corelat cu aportul de aminoacizi exogeni provenii din alimentaie. Sinteza tuturor celor 20 -aminoacizi ce intr n constituia proteinelor nu poate fi fcut n totalitate dect de plante i microorganisme. n cursul evoluiei, organismele umane i animale au pierdut capacitatea de a sintetiza 8 aminoacizi, pe care nu i pot obine dect prin aport exogen din proteinele de natur vegetal sau microbian. Aminoacizii care sunt absolut necesari pentru creterea i dezvoltarea organismelor umane i animale i care sunt furnizai prin alimentaie se numesc amino acizi eseniali (indispensabili, vezi Tabelul 1). Lipsa acestor aminoacizi din alimentaie provoac tulburri foarte grave. Doi aminoacizi, histidina i arginina, sunt indispensabili organismelor n cretere , sinteza lor endogen nefiind suficient pentru a acoperi nevoile mai mari din periodele de cretere (aminoacizi semieseniali). Ceilali aminoacizi pot fi sintetizai n organism printr-o serie de reacii care au ca 13

puncte de plecare diveri metabolii; ei sunt aminoacizi neeseniali (dispensabili) i prin urmare pot lipsi din hran. Carena n anumii aminoacizi prin aport alimentar insuficient se manifest printr -o simptomatologie complex, ca de exemplu: carena n lizin: determin ncetinirea creterii; carena n triptofan: determin tulburri vasculare i modificarea tabloului leucocitar; carena n tirozin: determin atrofierea tiroidei i hipofizei; carena n tioaminoacizi: determin atrofierea testiculelor, degradarea ovarelor i sterilitate.

2. Peptide
2.1. Clasificarea i nomenclatura peptidelor. Peptidele sunt substane naturale sau sintetice constituite dintr-un numr restrns de aminoacizi care se obin formal prin condensarea intermolecular a unei grupri carboxil de la un aminoacid cu gruparea amino de la aminoacidul urmtor. Peptidele alctuite din 2 -10 aminoacizi se definesc ca oligopeptide (di-, tri-, tetra-, etc.). Peptidele alctuite din 10 -50 aminoacizi se definesc ca polipeptide. Ca origine, peptidele prezente n organismul uman pot proveni fie din aminoacizi, prin biosintez, fie ca produi intermediari n procesele biochimice de degradare i biosintez a proteinelor. Cu excepia peptidelor ciclice, o polipeptid conine o grupare NH2 liber (captul N-terminal) i o grupare carboxil liber (captul C-terminal).

aminoacid N-terminal

aminoacid C-terminal

H N O R

O N H
n

H2N

COOH

Prin convenie, structura unei peptide este prezentat cu aminoacidul N -terminal n stnga i cu aminoacidul C-terminal n dreapta. Pentru a denumi o peptid se specific n ordinea de succesiune ncepnd cu aminoacidul N-terminal numele radicalilor aminoacizilor, iar la sfrit se adaug numele

14

ntreg al aminoacidului C-terminal. Deoarece denumirile devin complicate, de multe ori se prefer abrevierile prezentate n Tabelul 1.

O + H3NCH2C

NHCHCOO CH3

O + H3NCH2C

O NHCHC NHCH2COO CH2C6H5

a

glicilalanina Gly -Ala, sau GA

O + H3NCH2C

O NHCHC CH2OH

O NHCHC

NHCHCOO

CH2C6H5 CH2SH

glicilserilf enilalanilcisteina Gly -Ser-Phe-Cy s, sau GSFC

Exerciiu: denumii tripeptida a Dac se utilizeaz codul de abreviere cu trei litere (Tabelul 1), aminoacizii se pot separa prin cratime; dac se utilizeaz codul de o liter, cratimele se omit. Cnd este cunoscut doar identitatea aminoacizilor fr a fi cunoscut i ordinea lor, aminoacizii se separ prin virgule. n pentapeptida reprezentat mai jos, aminoacidul N-terminal este valina, iar histidina este aminoacidul C-terminal. Aminoacizii sunt numerotai ncepnd cu aminoacidul N-terminal. Astfel, restul de glutamat este Glu 4, deoarece este al patrulea aminoacid de la captul N-terminal.

Glu, Cys, His, Val, Ala

Pentapeptida conine aminoacizii indicai, dar ordinea lor nu este cunoscut

1Val-2Cys-3Ala-4Glu-5His

Pentapeptida conine aminoacizii n ordinea indicat

2.2. Structura legturii peptidice Datorit delocalizrilor electronice, legtura peptidic are aproximativ 40% caracter de legtur dubl. Atomii de carbon din doi aminoacizi adiaceni se gsesc n poziie trans unul fa de cellalt datorit mpiedicrilor sterice care determin stabilitatea configuraiei trans n detrimentul configuraiei cis. 15

O + N
R H

.. N
H

configuraie trans

Din cauza caracterului parial de dubl legtur, rotaia liber in jurul legturii peptidice este mpiedicat. Atomii de carbon i azot care aparin legturii peptidice, precum i ceilali doi atomi de care acetia sunt legai direct formeaz un plan rigid. Aceast coplanaritate local influeneaz modul n care un lan polipeptidic se poate plia, cu implicaii directe asupra structurii tridimensionale a polipeptidelor i protein elor.

H N
R

O N H

H N
O R

O N H

H N
O R

O N H

H N
O R

Figura 1. Fragment dintr-un lan polipeptidic. Planul definit de fiecare legtur peptidic este reprezentat ca un patrulater haurat. Gruprile R legate de C- alterneaz de o parte i de alta a scheletului polipeptidic

Singurul tip de legtur covalent care mai apare n structura unei peptide n afara legturii peptidice este legtura disulfidic. Aceasta poate lua natere ntre dou resturi de cistein.

O 2 HSCH2CHCO NH3 +
cistein

oxidare slab

O OCCHCH2S NH3 +

O SCH2CHCO NH3 +

cistin

Disulfurile, R-S-S-R se formea n urma oxidrii slabe a tiolilor, iar legtura disulfidic poate fi uor redus pentru a regenera tiolii.
oxidare

2 R SH

reducere

R S S R

16

Cnd o astfel de legtur apare ntre dou resturi de cistein, se poate forma o bucl, aa cum se formeaz de exemplu n hormonul hipofizar oxitocin.

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH 2 S
oxitocin

Dac resturile de cistein se afl n lanuri diferite, legturile disulfidice fac lagtura ntre cele dou lanuri, ca n cazul insulinei.
legtur intracatenar

lan A: Gly -Ile-Val-Glu-Gln-Cy s-Cy s-Thr-Ser-Ile-Cy s-Ser-Leu-Ty r-Gln-Leu-Glu-Asn-Ty r-Cy s-Asn

S S

legturi intercatenare
S

lan B: Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cy s-Gly -Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Ty r-Leu-Val-Cy s-Gly -Glu-Arg-Gly -Phe-Phe-Ty r-Thr-Pro-Ly s-Ala

Insulina este un hormon secretat de pancreas care controleaz nivelul glucozei din snge prin reglarea metabolismului glucozei. Insulina este o polipeptid dimer alctuit dintr-un lan mai scurt ( lanul A, 21 aminoacizi) i unul mai lung (lanul B, 30 aminoacizi). n structura sa ntlnim att puni disulfidice intracatenare, ct i puni disulfidice intercatenare. Legtura peptidic este nencrcat electric indiferent de pH. Peptidele sunt ins ncrcate electric la pH-ul fiziologic datorit gruprii amino libre de la captul N-terminal i datorit gruprii carboxil libere de la captul C -terminal, ca i datorit eventualelor resturi de aminoacid cu grupri bazice sau acide. Prin urmare, polipeptidele sunt polielectrolii. Ca i n cazul aminoaciziilor, pKa-urile gruprilor ionizabile depind mult de natura mediului care le nconjoar. Peptidele sunt i ele caracterizate de pI, (pH-ul izoelectric, pH-ul la care suma sarcinilor pozitive este egal cu suma sarcinilor negative). n Tabelul 34 sunt prezentai parametrii ctorva peptide simple n soluie apoas.

Tabel 4. Valorile pKa pentru cteva peptide sintetice Peptida pKa1 pKa2 pI + COOH NH3 Gly-Gly 3.14 8.25 5.70 Gly-Ala 3.15 8.23 5.69 Ala-Gly 3.17 8.18 5.68 Gly-Gly-Gly 3.23 8.09 5.66 Ala-Ala-Ala-Ala 3.42 7.94 5.68

17

2.3. Oligopeptide cu rol biologic. n organismul uman au fost identificate i caracterizate peptide care ndeplinesc importante funcii biochimice. Principalele dipeptide naturale sunt carnozina i anserina, cu structuri asemntoare. Ambele dipeptide sunt considerate atipice nefiind constituite numai din -aminoacizi. Ele sunt componente specifice esutului muscular, carnozina fiind prezent n muchiul mamiferelor, iar anserina n muchiul pectoral al psrilor. Ambele iau natere prin condensarea histidinei cu alanina, diferena constnd n faptul c anserina conine o grupare metil n ciclul imidazolic.

+ H3 N
O

H N

O O

+ H3 N
O

H N

O O

N N H

N N CH3

carnozin -alanilhistidin

anserin -alanil-N-metilhistidin

Ambele dipeptide au rolul de substane tampon meninnd pH-ul fiziologic n timpul contraciei musculare. Carnozina exercit o aciune hipertensiv i este un stimulator al secreiei glandulare. Joac un rol activ n transportul acidului fosforic n cursul procesului de glicoliz i n formarea creatinfosfatului. Sub form de carnozinfosfat este donor de grupri fosfat n contracia muscular. Glutationul este o tripeptid prezent n toate celulele de origine vegetal i animal. Este un tripeptid atipic, format din glutamat, cistein i glicin.

O O NH3
+

O HS N H

H N O

glutation -glutamilcisteinilglicin

18

Prezena unei grupri tiolice libere, provenit de la cistein, confer glutationului proprieti reductoare. Hidrogenul gruprii tiolice poate fi cedat unei substane acceptoare de hid rogen cu unirea a dou molecule de glutation, formndu -se glutation oxidat.

G-SH + HS-G
glutation redus

G-S-S-G
glutation oxidat

Funcia principal a glutationului este de a detoxifia organismul de diveri ageni oxidani toxici care apar n diferite procese biochimice redox. Agenii oxidani sunt implicai n procesele de mbtrnire sau de inducere a diferitelor cancere, iar glutationul are capacitatea de a-i reduce, diminundu-le astfel potenialul toxic. Encefalinele sunt pentapeptide sintetizate de corp pentru a controla durerea. Ele au fost denumite i analgezice naturale. Aceti compui diminueaz senzaiile de durere prin legarea de anumii receptori cerebrali. O parte din structura lor tridimensional este probabil similar cu cea a morfinei, deoarece se leag de aceeai receptori.

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
leucin-encefalin

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
metioninin-encefalin

Bradikinina, vasopresina i ocitocina sunt nonapeptide cu rol hormonal. Bradikinina inhib inflamarea esuturilor. Vasopresina controleaz tensiunea arterial prin reglarea pe care o exercit asupra contraciei muchilor netezi, fiind n acelai timp i antidiuretic. Ocitocina provoac contraciile n timpul naterii i stimuleaz secreia laptelui la femeile lehuze. Vasopresina i ocitocina posed o legtur disulfuric intracatenar, iar cruparea carboxil C -terminal este preponderent sub form amidic. n ciuda rolului fiziologic diferit, vasopresina i ocitocina difer structural doar prin doi aminoacizi.

bradikinin vasopresin

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH 2 S S

ocitocin

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH 2 S S

19

n Tabelul 5 sunt consemnate i alte polipeptide cu roluri biologice foarte divers, n special hormonal.

Tabelul 5. Hormoni polipeptidici Denumire Numr de aminoacizi Roluri biologice insulina glucagonul corticotropina 51 29 39 aciune hipoglicemiant aciune hipergicemiant stimuleaz biosinteza hormonilor corticosteroizi stimularea secreiei gastrice stimularea secreiei gastrice controleaz secreia pancreasului stimuleaz producerea de pigment n celulele melanocite ale pielii stimuleaz producerea de pigment n celulele melanocite ale pielii

gastrina I gastrina II secretina hormonul () hormonul ()

17 17 27 melanocit 13

melanocit 18

Antibioice cu structur polipeptidic . Exist o serie de polipeptide naturale eliberate de microorganisme (bacterii) dintre care unele manifest ac iune antibiotic, prezentnd un larg interes n chimioterapia modern. Din aceast catgorie fac parte gramicidine, tirocidiine, bacitracine, polimixine, actinomicine, kapreomicine, walinomicine, etamicine, etc. Caracteristica esenial a acestor substane este prezena n lanul peptidic al acestora, alturi de aminoacizii din seria L, a unor aminoacizi din seria D, formnd uneori o structur ciclic. Frecvent n structura acestora se ntlnesc acizii L-aspartic i L-glutamic. Gramicidina S este un antibiotic decapeptidic cu structur ciclic. Conin e aminoacizii Lornitin (L-Orn), D-ornitin (D-Orn) i D-fenilalanin. (Ornitina este un aminoacid asemntor lizinei, cu o grupare metilen mai puin).

20

L-Val L-Pro L-Phe L-Leu D-Orn L-Val

gramicidin S

L-Orn L-Leu D-Phe L-Pro

ornitin

+ H3NCH2CH2CH2CHCOO NH3 +

3. Structura proteinelor
Proteinele sunt biocomponente structurale i funcionale de nsemntate primordial pentru procesul vieii i care prezint cel mai inalt grad de complexitate, varietate i specificitate. Denumirea de protein deriv de la cuvntul grecesc proteos, primul, n deplin acord cu rolul fundamental al acestor substane n lumea vie. Proteinele ndeplinesc funcii extrem de variate, rolurile biologice fiind diferite, n funcie de tipul proteinelor. Din unirea unui numr mare de aminoacizi (de regul mai mare de 50) rezult lanurile peptidice din constituia proteinelor. Aceste lanuri difer unele de altele sub raportul lungimii, naturii i secvenei aminoacizilor constitutivi. De multe ori n constituia unei proteine nu intr un singur lan polipeptidic, ci mai multe, iar acestea nu sunt desfurate n lungime ci rsucite sau cu catena dispus in zigzag, n mai multe planuri. Pe de alt parte, datorit diverselor grupri funcionale libere din radicalii aminoacizilor, lanurile se pot consolida prin stabilirea unor legturi intra - sau intercatenare. innd seama de toate acestea, la moleculele proteice se ntlnete o organizare special, care const n patru categorii de structuri sau niveluri de organizare: 1) Structura primar , determinat de succesiunea aminoacizilor n catena polipeptidic i de poziia punilor disulfurice. 2) Structura secundar descrie fragmente cu conformaie regulat din constituia lanului proteic i cum acesta se pliaz n spaiu. 3) Structuta teriar descrie structura tridimensional a ntregii molecule proteice. 4) Structura cuaternar descrie modul n care lanurile proteice individuale se aranjeaz n spaiu n raport cu alte poteine.

21

Proteinele ndeplinesc cele mai diverse funcii n organism. Exist o reea proteic intracelular cu rol structural care asigur forma i integritatea celular. Filamentele de actin i miozin formeaz aparatul contractil al muchiului. Hemoglobina transport oxigen, n timp ce anticorpii ndeprteaz agenii strini celulei. Enzimele catalizeaz practic toate reaciile din organism. Receptorii confer celulei capacitatea de a sesiza diferite semnale hormonale sau produse de ali mesageri chimici. Un scop primordial al medicinii moleculare l constituie identificarea acestor proteine a cror prezen, absen sau deficien este asociat cu anumite stri fiziologice sau boli. Determinarea structurii primare a proteinelor ofer datele necesare identificrii precum i informaia necesar identificrii i clonrii genei care o codific.

3.1. Purificarea proteinelor Pentru a putea determina secvena aminoacizilor dintr-o protein, este esenial ca aceasta s fie n prealabil izolat n stare pur. O celul conine mii de proteine diferite, fiecare n cantiti diferite. Izolarea unei anumite proteine n cantitate suficient pentru a putea fi analizat poate presupune mai multe etape succesive de purificare. Metodele clasice se bazeaz pe diferenele de solubilitate a proteinelor n funcie de pH (precipitare izoelectric), n funcie de polaritate (precipitar e cu etanol sau aceton) sau n funcie de trie ionic (precipitare cu sulfat de amoniu). Ulterior precipitrii difereniale, proteinele se purific prin metode cromatografice i electroforetice. La separrile cromatografice se realizeaz partiia moleculelor ntre dou faze: una mobil i cealalt staionar. Pentru separarea moleculelor mici (aminoacizi, monozaharide) faza staionar poate fi hrtie cromatografic (cromatografie pe hrtie) sau un strat subire de celuloz, silicagel sau oxid de aluminiu (cromatografia n strat subire) Cromatografia pe coloan . Cromatografia pe coloan a proteinelor utilizeaz ca faz staionar o coloan de particule sferice de celuloz, acrilamid sau silicagel. De obicei, suprafaa acestor sfere este mbrcat cu grupri funcionale, astfel nct s se permit interacii ntre faza staionar i moleculele proteice, interacii bazate pe ncrcarea electric, hidrofobicitate sau legare de ligand. Un amestec proteic se aplic pe coloan, dup care faza mobil este trecut (eluat) prin aceast coloan, antrennd diferit moleculele proteice. Pe masur ce eluantul trece prin coloan, antreneaz diferenial moleculele proteice.

22

Figura 2. Componentele unui aparat cromatografic. R: rezervorul fazei lichide (furnizat gravitaional sau cu ajutorul unei pompe). C: coloana care conine faza staionar. F: colectorul de fracii care culege porii de eluat n eprubete separate.

Cromatografia de partiie. Separarea prin cromatografie pe coloan depinde de afinitatea relativ a diferitelor proteine pentru o anumit faz staionar sau pentru o anumit faz mobil. Asocierea dintre fiecare protein i faza staionar este slab i tranzitorie. Proteinele care interacioneaz mai puternic cu faza staionar sunt reinute pe coloan mai mult i sunt eluate mai trziu. Durata asocierii unei proteine cu faza staionar depinde att de natura fazei staionare ct i mobile. Separarea optim a unei proteine dintr-un amestec depinde de compoziia acestor dou faze. Cromatografia de excluziune sau gel filtrarea separ proteinele n funcie de raza Stokes, adic diametrul sferei pe care molecula e protein o ocup n soluie. Raza Stokes depinde de masa molecular a proteinei i de forma sa (o protein alungit ocup un volum mai mare dect o protein sferic cu aceeai mas). Cromatografia de excluziune folosete ca faz staionar granule poroase. Proteinele cu raz Stokes prea mare pentru a putea ptrunde prin porii granulelor (proteinele excluse) ramn n faza mobil i sunt eluate primele, naintea proteinelor care pot penetra prin pori (proteinele incluse). Astfel, proteinele pot fi separate n ordinea razelor lor Stokes.

23

Figura 3. Cromatografia de excluziune. A.Un amestec de molecule mari (ptarte) i mici (cercuri) se aplic pe o coloan de gel filtrare. B. Dup intrarea n coloan, moleculele mici ptrund n porii fazei staionare, n timp ce moleculele mai mari sunt excluse. C. Pe msur ce faza mobil nainteaz prin coloan moleculele mari curg mpreun cu ea, n timp ce moleculele mici rmn din ce n ce mai n urm.

Cromatografia de absorbie. n cromatografia de absorbie, amestecul proteic este aplicat pe coloan n condiiile n care proteina de interes se asociaz strns cu faza staionar. Moleculele neaderente sunt eluate primele i se arunc, dup care proteinele sunt eliberate succesiv prin ruperea legturilor care stabilizeaz complexul protein-faz staionar, de cele mai multe ori folosind un eluent cu gradient cresctor de concentraii de anumite sruri. Compoziia fazei mobile este schimbat gradat astfel nct moleculele s fie eliberate n ordinea afinitii lor pentru faza staionar. Cromatografia cu schimbtori de ioni. n cromatografia cu schimbtori de ioni, proteinele interacioneaz cu faza staionar n funcie de ncrcarea lor electric. Proteinele care au o incrctur pozitiv la un anumit pH vor adera la faza staionar ncrcat negativ cu grupri funcionale de tip carboxilat sau sulfat (schimbtori cationici). Invers, proteinele care au o incrctur negativ la un anumit pH vor adera la faza staionar ncrcat poztiv cu grupri funcionale de tip amine teriare sau cuaternare (schimbtori anionici). Proteinele, care sunt poli -ioni, concureaz impotriva ionilor mono sau divaleni n legarea de suportul staionar schimbtor de ioni. De exemplu, proteinele se leag de DEAE (dietilaminoetil)-celuloz prin nlocuirea contraionilor (de obicei Cl- sau AcO-) care neutralizeaz amina protonat. Proteinele legate sunt apoi ndeprtate selectiv ridicnd gradat concentraia de ioni din faza mobil. Proteinele sunt eluate n ordine invers forei de interacie cu faza staionar. Deoarece sarcina net a unei proteine depinde de pH, eluarea secvenial a proteinelor se poate face i prin modificarea pH-ului n faza mobil. Pentru a fi purificat, o protein poate suferi mai multe runde de ion-cromatografie la pH-uri diferite, astfel nct proteine care de exemplu sunt co-eluate la un anumit pH, pot fi separate folosind ulterior alt pH. Cromatografia prin interacii hidrofobe. Acest tip de cromatografie separ proteine pe baza tendinei lor de a se asocia cu o faz staionar acoperit cu grupri hidrofobe (fenil -Sepharose, octilSepharose). Proteinele cu fragmente hidrofobe expuse la suprafa ader la faza staionar prin interacii hidrofobe, care sunt mrite prin folosirea unei faze mobile cu trie ionic mare. Proteinele neaderente sunt eluate primele, dup care polaritatea fazei mobile este sczut gradat prin scderea

24

concentraiei ionice. Dac interaciile dintre protein i faza staionar sunt prea puternice, se pot aduga n faza mobil etanol sau glicerol pentru a micora polaritatea fazei mobile i slbi interaciile hidrofobe. Cromatografia de afinitate. Cromatografia de afinitate se folosete de selectivitatea pe care majoritatea proteinelor o manifest fa de anumii liganzi. De exemp lu, enzimele pot fi purificate utiliznd o faz staionar de care sunt legate substratele, produii de reacie, coenzimele sau inhibitorii enzimelor respective. Teoretic, numai proteinele care interacioneaz cu ligandul imobilizat vor adera la faza staionar. Proteinele aderente sunt ulterior eluate fie cu o soluie de ligand sau, mai puin selectiv, prin ruperea legturilor protein-ligand cu uree, clorhidrat de guanidin, soluii tampon cu pH slab acid sau soluii concentrate de ioni. Printre cele mai performante faze staionare sunt cele utilizate pentru purificarea proteinelor recombinante (modificate genetic), cum ar fi faze staionare cu ioni de Ni2+ ce leag proteinele cu coad polihistidinic, sau faze staionare cu glutation care leag proteinele recombinante legate de un fragment de glutation-S-transferaz. Peptidele pot fi purificate prin HPLC. Fazele staionare utilizate n coloanele cromatografice clasice sunt materiale poroase a cror compresibilitate mare limiteaz scurgerea fazei mobile. Cromatografia n faz lichid la presiune ridicat (High -Pressure Liquid Chromatography, HPLC) utilizeaz granule necompresibile de silicagel sau alumin ca faz staionar i presiune de pn la cteva mii de psi. Umplutura necompresibil a coloanei permite att viteze mari de eluie ct i rezoluie crescut. HPLC poate separa amestecuri complexe de lipide i peptide a cror proprieti difer doar puin. Pentru separarea peptidelor, se utilizeaz HPLC cu faz inversat (reversed -phase HPLC) n care faza staionar este hidrofob (oligomeri alifatici cu 3 -18 atomi de carbon). Amestecul peptidic este eluat cu un gradient apos al unui solvent organic miscibil cu apa (acetonitril, metanol). Puritatea unei proteine se determin prin electroforez. Electroforeza separ molecule ncrcate electric n funcie de viteza cu care acestea migreaz ntr-un cmp electric aplicat. Cea mai utilizat metod pentru determinarea puritii unei proteine este SDS -PAGE, sau cromatografia n gel de poliacril amid n prezena dodecilsulfatului de sodiu (SDS). (PAGE = PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Pentru SDS-PAGE, acrilamida este nti co-polimerizat cu o cantitate mic de N,N'metilen bis-acrilamid, formnd o reea poroas prin care vor migra moleculele supuse electroforez i. SDS denatureaz proteina i se leag de ea ntr-un raport de o molecul SDS la dou legturi peptidice. Numrul mare de molecule SDS ataate face ca molecula proteic s capete o ncrctur negativ, astfel nct proteinele vor migra prin gelul electro foretic n funcie numai de masa lor molecular. Proteinele individuale migate n gel pot fi vizualizate cu anumii colorani, cum ar fi Coomasie blue.

25

3.2. Determinarea structurii primare a proteinelor Dup purificarea unei proteine, urmtorul pas este reducerea legturilor disulfidice eventual prezente, de obicei cu 2-mercaptoetanol, urmat de o reacie cu acid iodacetic, care impiedic reformarea punilor disulfidice .

O NHCH CH2 S S CH2 NHCH O C

2 HSCH2 CH2 OH

O NHCH CH2 SH SH CH2 NHCH O C

ICH 2 COOH

O NHCH CH2 SCH2 COOH + 2 HI SCH2 COOH CH2 NHCH O C C

+ SCH2 CH2 OH SCH2 CH2 OH

Urmtorul pas const n determinarea felului i numrului de aminoacizi componeni. Pentru aceasta, o prob de protein se hidrolizeaz :

proteina

6 N HCl 100 o C 24 hr

aminoacizi

Acest tratament distruge toate legturile amidice, inclusiv cele din Asn i Gln. Numrul de Asn i Gln se determin prin alte metode. Hidroliza acid distruge nucleul indolil din Trp, aa c pentru determinarea Trp se folosete separat hidroliza n mediu bazic. Amestecul de aminoacizi obinut prin hidroliz este trecut printr-un analizor de aminoacizi care determin numrul i tipul de aminoacizi.

Identificarea aminoacidului N-terminal Exist cteva metode de determinare a aminoacidului N-terminal. Metoda Sanger utilizeaz proprietatea gruprii NH2 de a reaciona cu 2,4 -dinitrofluorbenzen dnd derivai 2,4 -dinitrofenil galbeni.

26

NO2 O2N

NO2 O2N

NO2
- HF

.. F + H2NR

.. -

F NH2R +

O2N

NHR

Reactantul Sanger reacioneaz uor cu aminoacidul N-terminal al unei proteine, transformnd gruparea amino n grupare arilamino. Dup hidroliz, aminoacidul N-terminal rmne legat de gruparea 2,4-dinitrofenil putnd fi uor separat de ceilali aminoacizi i identificat. Principalul dezavantaj al acestei metode este ca nu poate fi aplicat secvenial ca metoda Edman.

NO2 O2 N

O proteina

F + H2 NCHC

R
NO2 O2 N

O proteina
H3 O+

NO2 O2 N

HNCHC R

HNCHCOH + aminoacizi R

Metoda Edman. Fenilizotiocianatul (PITC) sau reactivul Edman reacioneaz selectiv cu aminoacidul N-terminal, iar derivatul tiazolinonic rezultat poate fi clivat n condiii acide blnde. Derivatul tiazolinonic este extras cu un solvent organic i n prezena acidului trece intr -un derivat de feniltiohidantoin (PTH) mai stabil, genernd un nou capt N -terminal. Se pot face astfel mai multe serii succesive de degradri Edman pe aceei prob de protein. Din pcate nu se poate realiza secvenializarea complet a unei proteine, deoarece se acumuleaz produi secundari care denatureaz rezultatele. Secvenializarea Edman a fost automatizat, utilizndu -se o matrice solid pentru imobilizarea peptidei i HPLC pentru a identifica derivaii PTH. Secveniatoarele moderne pot efectua pna la 50 degradrii succesive, pe o prob de civa picomoli.

27

O .. H2NCHC R

O NHCHC R'

O NHCHC R"

f enil izotiocianat (PITC) (reactiv Edman)

C S

O .. HNCHC R

O NHCHC R'
HF

O NHCHC R"

N + S

H F O NHCHC

O NHCHC R"

. . . O. ..
R HN+ S O

R'

HN
deriv at tiazolinonic

O + H3NCHC R'

O NHCHC R"

peptida f ara acidul N-terminal original

R HN S N

PTH-aminoacid

Determinarea aminoacidului C-terminal. Aminoacidul C-terminal se identific pin hidroliza cu o enzim numit carboxipeptidaz, care catalizeaz specific hidroliza aminoacidului C -terminal. Carboxipeptidazele sunt exopeptidaze (enzime care catalizeaz hidroliza unei legturi peptidice aflate la marginea lanului peptidic).

28

H N R"

O N H

R'

H N O R

COO

carboxipeptidaza

H N R"

O N H

R'

+ - H3N COO +
R

COO

Pe msur ce primul aminoacid este ndeprtat, enzima atac urmtorul aminoacid, pn cnd ntreaga protein este hidrolizat. Prin determinarea vitezei de apariie a diverilor aminoacizi n hidrolizat se pot identifica astfel primii 3-4 aminoacizi de la captul C-terminal. Fragmentarea lanurilor proteice. Metoda Edman poate fi utilizat fr probleme pentru secvenializarea primelor 20 -30 resturi de aminoacizi, numai c moleculele proteice au minim 50 aminoacizi (foarte multe de ordinul sutelor). n consecin, majoritatea proteinelor necesit clivare nainte de a putea fi secvenializate. Acest lucru se face prin hidroliz parial n mediu slab acid, cnd numai anumite legturi peptidice sunt atacate. Fragmentele rezultate se separ, se purific (prin reversed-phase HPLC) i se secvenializeaz. Secvena proteinei originale se poate deduce aliniind secvenele fragmentelor i cautnd poriunile care coincid.

Peptida X Peptida Z

Peptida Y

Poriunea C-terminal a peptidei X

Poriunea N-terminal a peptidei Y

Figura 3.4. Secvena de aminoacizi a peptidei Z, care coincide parial cu cea a peptidelor X i Y, demonstreaz c peptidele X i Y se regsesc n proteina original n ordinea XY i nu YX.

Proteinele pot fi fragmentate i cu endopetidaze (enzime care catalizeaz hidroliza unei legturi peptidice aflate n interiorul lanului peptidic). Tripsina, chimotripsina, elastaza sunt endopeptidaze care hidrolizeaz specific anumite legturi peptidice. De exemplu, tripsina catalizeaz scind area legturilor peptidice n care sunt implicate lizina sau arginina. 29

C- Ly s

C-Arg

H N R

O N H

R'

H N O

O N H

R"

H N O

O N H

R"'

CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 +

CH2 CH2 CH2 NH + C NH2

NH2

Principalii ageni de clivare specific a proteinelor sunt prezentai n Tabelul 3.4. Tabelul 4. Specificitatea agenilor de clivare a proteinelor Reactiv Specificitate nltur aminoacidul N-terminal nltur aminoacidul N-terminal Met-X Asn-Glz Asp-Pro nltur aminoacidul C-terminal (nu i Arg sau Lys) nltur aminoacidul C-terminal (doar Arg i Lys)

Reactivi chimici Reactiv Sanger Reactiv Edman CNBr (bromcian) Hidroxilamin Acid slab Exopeptidaze* Carboxipeptidaza A Carboxipeptidaza B Endopeptidaze Tripsin* Chimotripsin* Elastas* Endopeptidaz Lys-C Endopeptidaz Arg-C Endopeptidaz Asn-N

Arg-X, Lys-X aminoacid hidrofob (Phe, Tyr, Trp)-X Gly-X, Ala-X Lys-X Arg-X X-Asn Glu-X, mai ales cnd X este hidrofob

*Clivarea nu are loc cnd prolina e implicat n legtur. Mecanismul clivrii cu bromcian (BrCN) este prezentat mai jos:

30

Br CH3 . . . S. CH2 O CH2 O C

CH3 . . S+ C CH2

N + Br

O NHCHC R'

CH2 O C

NHCHCNHCH R

NHCHCNHCH R

O .. NHCHC R' N

+ CH3SC O O O + NHCHCNHCH C NHCHC OH CH2 O CH2 O COH

H3O+

R
H3 O+

R'

O NHCHCNHCH R

O C

O O + NHCHC R'

NHCHCNHCH R

Detectarea modificrilor covalente prin spectrometria de mas. Spectrometria de mas, care face distincie ntre specii moleculare exclusiv pe baza masei lor, poate fi utilizat pentru a depista modificrile posttranslaionale (care survin dup ce proteina a fost biosintetizat la nivel ribozomal) ale aminoacizilor dintr-o protein. Astfel, pot fi detectate grupri hidroxi, fosfat, etc. fiecare grupare contribuind cu un increment specific la masa aminoacidului modificat (Tabelul 3.5). Tabelul 5. Creterea de mas produs de modificrile posttranslaionale Creterea de mas (Da) Modificare Fosforilare 80 Hidroxilare 16 Metilare 14 Acetilare 42 Miristilare 210 Palmitilare 238 Glicozilare 162 Spectrometrele de mas convenionale sunt utilizate pentru determinarea moleculelor cu mas molecular pn la 1000 Da, dar exist i spectrometre speciale pentru analiza compuilor cu mase 31

moleculare mari. Iniial, analizarea polipeptidelor i proteinelor prin spectrometrie de mas a fost mult ngreunat de dificultatea cu care aceti compui pot fi volatilizai. ntre timp, tehnici de felul MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) i dispersie prin electropulverizare (electrospray dispersion) permit ca pna i polipeptide mari (> 100 000 Da) s fie detectate cu o acuratee extraorinar ( 1 Da). Utiliznd dispersia prin electropulverizare, peptidele scoase dintr-un cromatograf HPLC sunt imediat introduse n spectrometrul de mas pentru analiz. Aici, peptidele sunt fragmentate prin bombardare cu atomi de heliu, iar masele diverselor fragmente sunt nregistrate. Deoarece legrura peptidic este mult mai labil dect legturile C-C, cele mai abundente fragmente vor diferi ntre ele cu uniti echivalente de 1-2 aminoacizi. Deoarece cu excepia leucinei i izoleucinei masele individuale ale aminoacizilor sunt unice, secvena unei polipeptide poate fi dedus din masele fragmentelor componente. Amestecurile complexe de peptide pot fi acum analizate fr o purificare anterioar utiliznd echivalentul a dou spectrometre de mas legate n serie (spectrometria de mas n tandem). Biologia molecular a revoluionat metodele de determinare a structurii primare a proteinelor. Cunoaterea secvenei de ADN care codific o protein perm ite deducerea structurii primare a proteinei respective. Pn n prezent, genomurile multor specii, inclusiv genomul uman, au fost secvenializate complet, bazele de date fiind accesibile liber pe Internet. Algoritmuri computerizate de cutare permit identificarea fragmentelor de ADN (ORF, open reading frame) care codific proteine prezumptive. Invers, secvene scurte de aminoacizi pot fi utilizate pentru a identifica secvena de ADN codificator. n timp ce genomul uman a fost complet descifrat , proteomul (totalitatea seturilor de proteine caracteristice unei specii, sintetizate de celule n diferite condiii) este departe de a fi neles, iar bioinformatica este metoda care va avea un rol de baz n descifrarea sa.

32

3.3. Nivele Superioare de Organizare a Structurii Proteinelor

Proteinele catalizeaz reaciile metabolice, induc mobilitatea celular, alctuiesc frnghiile i cablurile ce confer integritate structural prului, oaselor, tendoanelor, dinilor. n natur, forma urmeaz funciei. Varietatea structural a proteinelor umane reflect deci diversitatea i sofisticarea funciilor lor biologice. Maturarea unei polipeptide nou-sintetizate ntr-o protein funcional presupune plierea lanului polipeptidic ntr-un aranjament spaial specific numit conformaie. n timpul maturrii, modificri postranslaionale pot avea loc cu adugarea unor grupri chimice noi sau cu ndeprtarea unui fragment peptidic cu rol tranzitoriu. Deficienele genetice sau nutriionale care afecteaz maturarea proteinelor pot avea efecte majore asupra strii de sntate. Exemple din prima categorie includ maladia Creutzfeldt-Jakob, maladia Alzheimer i encefalopatia spongiform b ovin (boala vacii nebune). Scorbutul este o deficien nutriional provocat de lipsa vitaminei C, care perturb maturarea anumitor proteine structurale (colagenul).

3.3.1. Clasificarea proteinelor. Oamenii de tiin au clasificat iniial proteinele pe baza unor proprieti cum ar fi solubilitatea, forma sau prezena n structura lor a unor componente neproteice. De exemplu, proteinele care pot fi extrase din celule utiliznd soluii cu pH-uri i trii ionice fiziologice sunt proteine solubile, celelalte fiind considerate proteine insolubile. n funcie de forma lor, pot fi proteine globulare i proteine fibrilare. Proteinele globulare au o form aproximativ sferic sau ovoidal avnd raportul axial (raportul dintre cea mai mare dimensiune i cea mai mic dimensiune) mai mic dect 3. Majoritatea enzimelor sunt globulare, cu un volum intern mare care furnizeaz un spaiu amplu pentru a se putea forma caviti cu geometrii, ncrcri electrice, hidrofilicitate sau hidrofobicitate specifice , necesare pentru a lega substratele enzimatice i pentru a promova cataliza. Prin contrast, majoritatea proteinelor structurale adopt conformaii alungite. Acestea sunt proteine fibrilare i au raportul axial 10 sau mai mare. n funcie de produii rezultai la hidroliz, proteinele pot fi proteine simple sau heteroproteine (holoproteine). La hidroliz acid, bazic sau enzimatic proteinele simple pun n libertate numai -aminoacizi. Heteroproteinele au o compoziie complex fiind formate dintr -o parte proteic (apoproteina) i o parte neproteic (componenta prostetic). Componenta prostetic poate fi de natur chimic diferit (glu cide, lipide, acizi nucleici, porfirine, metale). n cazul heteroproteinelor, legarea gruprii prostetice de apoprotein se face prin legturi chimice covalente sau necovalente care le confer stabilitate. Lipoproteinele i glicoproteinele conin lipide i respectiv carbohidrai legai covalent. Mioglobina, hemoglobina, citocromii conin ioni metalici strns asociai, fiind denumite metaloproteine, etc. Odat cu dezvoltarea i aplicarea tehnicilor de determinare a structurii primare a proteinelor au aprut scheme de clasificare mai precise, bazate pe similariti sau pe gradul de

33

omologie privind secvena sau structura. Cu toate acestea ns, muli termeni din vechea clasificare rmn n continuare n uz. Natura modular a sintezei i organizrii spaiale a proteinelor este materializat n conceptul de nivele de structur: structura primar , care este determinat de succesiunea aminoacizilor n lanul polipeptidic; structura secundar , care este dat de plierea unor fragmente polipeptidice scurte (3-30 resturi de aminoacizi) n uniti ordonate geometric; structura teriar, sau asamblarea tridimensional a unitilor structurale secundare pentru a forma uniti funcionale mai mari cum ar fi polipeptida matur i domeniile sale ; structura cuaternar, dat de numrul i tipul de lanuri proteice i aranjamentul lor spaial.

INSOLUBILE PROTEINE FIBRILARE

Actin Miozin Fibrinogen

PROTEINE SIMPLE

GREU SOLUBILE
Albumine Globuline Histone Protamine

Colagen Elastine Keratine Scleroproteine

PROTEINE GLOBULARE

PROTEINE

HETEROPROTEINE

Lipoproteine Glicoproteine Fosfoproteine Nucloproteine Metaloproteine Cromoproteine

Figura 4. Clasificarea proteinelor

34

3.3.2. Structura secundar a proteinelor Datorit rigiditii legturii peptidice rotaia liber este permis numai n jurul a dou din cele trei tipuri de legturi din scheletul polipeptidic: C -Ccarbonil i C-N.

O C

R' C

H C O

H N C H R"

O C N H

N H

Unghiul de rotaie n jurul legturii C -N este denumit phi ( ), iar unghiul de rotaie n jurul legturii C-Ccarbonil este denumit psi (). Pentru orice aminoacid diferit de glicin, majoritatea combinaiilor sunt interzise din cauza mpiedicrilor sterice. Conformaiile care implic prolina sunt chiar mai restricionate, din cauza absenei rotaiei libere n jurul legturii C -N. Regiuni cu structur secundar ordonat apar atunci cnd o serie succesiv de aminoacizi adopt unghiuri i similare. Exist dou categorii de structuri secundare, -helix i -pleated sheet (planuri pliate). Segmente extinse de aminoacizi (de exemplu buclele) posed o gam variat din aceste unghiuri. 3.3.2.1. Structura -helix Scheletul polipeptidic dintr-un -helix este rsucit n mod egal n jurul fiecrui C cu un unghi de aproximativ -57 i un unghi de aproximativ -47. O spir complet a helixului conine n medie 3,6 resturi de aminoacizi, iar nalimea spirei este de 0,54 nm.

35

A B

0,54 nm

0,15 nm
Figura 5. Structura -helix. A. Aranjarea catenei polipeptidice n jurul axei unui helix. B. Reprezentarea convenional a unui -helix

Gruprile R din fiecare rest de aminoacid inclus ntrpun -helix sunt ndreptate spre exterior.

Figura 6. Vedere de sus i de-a lungul axei unui -helix. Gruprile R sunt orientate n afara helixului.

Proteinele naturale conin numai -aminoacizi, motiv pentru care -helixul spre dreapta este mai stabil dect cel spre stnga, i numai -helixuri orientate spre dreapta exist n natur. Diagramele schematice convenionale ale proteinelor reprezint -helixurile prin cilindri sau panglici spiralate (Fig. 5B). Stabilitatea -helixurilor deriv din legturile de hidrogen care se formeaz ntre atomii de 36

oxigen din carbonilul peptidic i atomul de hidrogen de la azotul peptidic care aparine aminoacidului din poziia a patra. Capacitatea de a forma un numr maxim de legturi de hidrogen precum i interaciile van der Waals din miezul acestei structuri compacte face ca -helixul s fie foarte stabil. Deaorece resturile de prolin nu au hidrogen la atomul de azot peptidic i prin urmare nu pot forma legturi de hidrogen, prolina nu poate fi inclus ntr-un -helix dect n prima spir. Cnd este prezent n alt parte, prolina perturb -helixul. i glicina, din cauza dimen siunilor sale reduse produce rupturi n -helix.

Figura 7. Legturile de hidrogen dintre O i H stabilizeaz structura polipeptidic ntr-o conformaie -helix.

Multe -helixuri au grupri R predominant hidrofobe pe o parte a axei helixului i grupri R predominant hidrofile pe cealalt parte. Aceste helixuri amfipatice sunt bine adapate pentru a forma interfee ntre regiuni polare i regiuni nepolare, cum ar fi miezul intern al proteinei i nveliul su apos. Grupuri de helixuri amfipatice pot forma canale cu pori care permit anumitor molecule polare s treac prin interiorul hidrofob al membranelor celulare. 3.3.2.2. Structura -pleated sheet (planuri pliate). Al doilea tip de structur secundar regulat ntlnit n structura proteinelor este structura -sheet. Resturile aminoacil dintr-o structur sheet sunt dispuse n zig-zag formnd un aranjament de tip foaie pliat, n care gruprile R ale aminoacizilor adiaceni sunt orientate n direcii opuse. n contrast cu aranjamentul compact din helix, scheletul peptidic din -sheet este foarte extins. Ca i n cazul -helixului, structura -sheet i 37

datoreaz marea stabilitate legturilor de hidrogen care se formeaz ntre atomii de oxigen carbonilici i atomii de hidrogen din legturile peptidice, doar c aceste legturi se formeaz ntre atomi aparinnd la dou catene diferite.

N
Figura 8. A. Aranjarea catenei polipeptidice ntr-o structur de tip -pleated sheet. B. Reprezentarea convenional a unei structuri -pleated sheet.

Structurile -sheet care se afl n interacie pot fi aranjate paralel (segmentele polipeptidice adiacente merg n aceeai direcie NC) sau antiparalel (segmentele polipeptidice adiacente merg n direcii opuse, una NC, cealalt NC).

Figura 9. Reprezentarea unei catene polipeptidic cu structuri -sheet n orientarea antiparalel (A i B) i paralel (B i C).Gruprile R sunt omise pentru claritate.

38

Ambele structuri permit un numr maxim de legturi de hidrogen ntre fragmentele catenare. Structura -sheet nu este perfect plan, ci are o uoar rsucire spre dreapta. Mnunchiuri de segmente cu structuri -sheet formeaz miezul multor proteine globulare. Schematic, structura -sheet este reprezentat ca o sgeat orientat de la captul N-terminal spre captul C-terminal. 3.3.2.3. Bucle i cotituri. Aproximativ jumtate din resturile de aminoacizi care intr n constituia unei proteine globulare se gse sc n structuri -helix i -sheet, restul aflndu-se n bucle (loops), cotituri(turns) ndoituri (bends) i alte conformaii mai laxe. Cotiturile se refer la segmente peptidice scurte care unesc dou uniti de structur secundar, de exemplu dou catene adiacente cu structur -sheet. Cotiturile ( -turns) implic patru aminoacizi, din care primul este legat de al patrulea rest prin legturi de hidrogen, rezultnd o cotitur de 180. Prolina i glicina sunt deseori prezente n cotiturile .
COOH H2C C C CH3 H C C O H N C CH2OH H H O

H H H N C C O

H N

Figura 10. O cotitur care leag dou segmente antiparalele cu structur -sheet. Linia punctat indic legtura de hidrogen dintre primul i al patrulea aminoacid din segmentul Ala-Gly-Asp-Ser.

Buclele sunt segmente care conin mai muli aminoacizi dect numrul minim necesar pentru a conecta dou uniti adiacente de structur secundar. Dei au conformaii neregulate, buclele au roluri biologice importante. De exemplu, pentru multe enzime, buclele care unesc domeniile responsabile de legarea substraturilor i a produilor de reacie conin aminoacizi care particip la cataliz. Laitmotivele helix-bucl-helix (helix-loop-helix) reprezint locul de legare de ADN a unor proteine (factori care activeaz sau inhib transcripia ADN n ARN). Motive le structurale de tipul helix-bucl-helix sunt 39

intermediare ntre structura secundar i cea teriar, fiind uneori denumite structuri supersecundare. Deoarece multe din bucle sunt orientate spre exteriorul moleculei proteice, ele alctuiesc situsuri uor accesibile (epitopi) pentru a fi recunoscute i legate de ctre anticorpi. Buclele nu au regularitate structural; ele totui exist preponderent n anumite conformaii stabilizate prin legturi de hidrogen, puni electrostatice sau interacii hidrofobe cu alte regiuni ale proteinei. Nu toate regiunile unei proteine sunt ns organizate n structuri ordonate.
bucl -helix

cotitur

-sheet Figura 11. n catena unei proteine putem ntlni fragmente cu structuri secundare diferite.

Proteinele conin i zone dezorganizate, de cele mai multe ori aflate spre captul C -terminal, caracterizat printr-o flexibilitate conformaional mare. De multe ori, aceste regiuni dezorganizate pot adopta o conformaie organizat atunci cnd se leag de exemplu de un ligand. Aceast flexibilitate conformaional confer acestor regiuni capacitatea de a aciona ca regiune reglatoare , care atunci cnd leag un ligand duce la modificrea structurii i funciei proteinei. 3.3.3. Structura teriar i cuaternar a proteinelor Structura primar i secundar nu pot explica n totalitate proprietile fizico-chimice i biologice ale unei proteine. Termenul de structur teriar se refer la ntreaga conformaie tridimensional a unei proteine. Ea indic n spaiul tridimensional modul n care fragmentele cu structur secundar - -helixurile, -sheet, cotiturile, ndoiturile i buclele - se asambleaz pentru a forma regiuni distincte, i cum aceste regiuni se raporteaz spaial un a la alta. O regiune distinct este un fragment din structura proteinei suficient pentru a executa o anumit funcie fizic sau chimic, cum ar fi legarea unui substrat ori a unui ligand. Alte regiuni pot avea rolul de a lega o protein de o membran sau de a interaciona cu o molecul care i moduleaz funcia. Unele proteine (triozofosfat 40

izomeraza sau mioglobina) au o singur regiune funcional. Altele, cum ar fi protein kinazele au dou regiuni distincte. Protein kinazele catalizeaz transferul unei grupri fosfat de pe molecula de ATP la gruparea OH a unui rest de aminoacid hidroxilat dintr-o protein sau peptid. Fragmentul N-terminal, care este bogat n structuri -sheet leag ATP-ul, n timp ce regiunea C-terminal care este bogat n zone de -helix, se leag de substratul proteic. Gruprile care catalizeaz transferul gruprii fosfat se afl localizate n bucla care face legtura dintre cele dou regiuni.

-helix

-sheet

Figura 12. Structura teriar este modul n care structurile secundare se organizeaz pentru a forma o protein sau un protomer al unei proteine complexe (oligomere). Figura 13. Numai proteinele cu dou sau mai multe lanuri polipepdidice au structur cuaternar

n unele cazuri, proteinele sunt ansambluri de mai multe lanuri polipeptidice, numite protomeri. Structura cuaternar definete numrul i felul proto merilor, precum i relaia spaial dintre ei. Interaciunile prin care se realizeaz agregatul molecular i care stabilizeaz structura cuaternar se realizeaz de regul prin fore necovalente: legturi electrostatice, de hidrogen , hidrofobe si van der Waals. Proteinele monomere sunt alctuite dintr-un singur lan polipeptidic i nu au structur cuaternar . Proteinele dimere sunt alctuite din dou lanuri polipeptidice.

41

HIV-proteaz insulin Figura 14. Reprezentarea structurii cuaternare a ununi homodimer (HIV-proteaz ) i a unui heterodimer (insulin).

Homodimerii conin dou copii ale aceluiai lan polipeptidic, n timp ce heterodimerii conin dou lanuri polipeptidice diferite. Literele greceti , , sunt folosite pentru a face distincie ntre protomeri, iar indicii arat numrul din fiecare. De exemplu 4 desemneaz o protein homotetrameric, iar 2 2o protein pentameric cu trei tipuri de protomeri, doi , doi i unul Datorit faptului c proteinele, chiar cele mici, conin mii de atomi, reprezentarea unei proteine cu indicarea fiecrui atom este deosebit de dificil. De regul se utilizeaz diagrame simplificat e care s prezinte caracteristicile principale ale proteinei. 3.3.3.1. Factorii care stabilizeaz structura teriar i cuaternar Structura teriar i cuaternar a proteinelor este stabilizat prin interacii necovalente. Dintre acestea, interaciile hidrofobe orienteaz majoritatea catenelor laterale ale aminoacizilor nepolari spre interiorul moleculei de protein, punndu -i la adpost de contactul cu apa. Alte interacii importante sunt legturile de hidrogen sau punile electrostatice dintre ionii carboxilat ai resturilor glutamil i aspartil i gruprile ncrcate pozitiv ale resturilor lizil, arginil i histidil. Dei mai slabe dect legturile covalente, numrul mare al acestor interacii conformaiilor funcionale ale proteinelor. confer un grad mare de stabilitate

42

Structur- sheet

Interacii hidrofobe

Atracii electrostatice
C H2
H3 C

COOOH
O C

CH3 CHCH2 CH3

C H3 C H

(CH2 )4 NH3

O OCCH2

Legturi de hidrogen ntre grupri funcionale

HN

H2 C S S CH2

CH2 S S

CH2

-Helix

Legturi de hidrogen ntre grupri peptidice

O CH2 CNH H

Legturi disulfidice

H OCH2

Legturi de hidrogen

H3N+
Legturi de hidrogen

Legturi de hidrogen ntre o grupri funcionale i legturi peptidice

Figura 15. Tipuri de interacii care stabilizeaz structura teriar a proteinelor

Unele proteine conin legturi disulfurice (-S-S-) care leag gruprile tio - a dou resturi cisteinil. Formarea legturilor disulfurice presupune oxidarea gruprilor tiolice i necesit oxige n. Legturile disulfurice intracatenare confer un plus de stabilitate conformaiei proteinei, pe cnd legturile disulfurice intercatenare stabilizeaz structura cuaternar a anumitor proteine oligomere.

3.3.3.2. Denaturarea proteinelor Denaturarea reprezint distrugerea organizrii structurii teriare i cuaternare a unei proteine. Acest lucru poate fi realizat de orice factor care rupe legturile implicate n meninerea structurii tridimensionale a unei proteine. Legturile care determin structura teriar sau cuaternar a unei proteine sunt n general legturi slabe, i din acest motiv proteinele pot fi uor denaturate. Conformaia total dezorganizat a unei proteine complet denaturate se numete conformaie ntmpltoare (random coil). Denaturarea proteinelor poate fi reversibil sau ireversibil. Agenii care provoac denaturarea proteinelor sunt de natur fizic (temperaturi de peste 60C, agitare, raze X, radiaii ultraviolete, ultrasunete) i chimic (acizi, baze, sruri ale metalelor grele, solveni organici, ageni tensioactivi). 43

Consecinele denaturrii sunt: pierderea activitii biologice, diminuarea solubilitii, creterea numrului de grupri SH libere, pierderea capacitii de a se combina cu apa, modificarea vscozitii i a presiunii osmotice, creterea susceptibilitii la hidroliza enzimatic. 3.3.3.3. Determinarea experimental a structurii tridimensionale a proteinelor Cristalografia cu raze X. De la determinarea structurii mioglobinei n 1960, structura a mii de proteine a fost ntre timp determinat prin cristalografie cu raze X. Etapa cheie n acest proces l constituie precipitarea proteinei n condiiile n care ea formeaz cristale regulate care difract razele X. Acest lucru se poate realiza prin tratarea unor picturi fine de soluie proteic cu diverse combinaii de pH-uri i ageni de precipitare (sruri, polietilenglicol). O structur tridimensional detaliat poate fi dedus combinnd datele structurii primare cu modul de difracie a unui mnunchi mon ocromatic de raze X. Apariia unor algoritmuri i programe computerizate au fcut ca interpretarea spectrelor de difracie s fie din ce n ce mai simpl; inconvenientul major rmne greutatea de a obine proteina n stare cristalin. Exist o serie de dovezi, printre care pstrarea proprietilor catalitice ale enzimelor, care sugereaz ca structurile determinate prin cristalografie reflect structura proteinelor din soluii. O metod complementar cristalografiei cu raze X este spectroscopia de rezonana magnetic nuclear (RMN). Modelarea molecular . Un instrument ajuttor la determinrile empirice de structur tridimensional a proteinelor este reprezentat de utilizarea tehnologiilor de calcul n modelarea molecular. n prezent exist dou tipuri de tehnici de modelare. n prima, structura tridimensional a unei proteine este folosit ca punct de pornire n construirea unui model de structur tridimensional posibil pentru o protein omoloag. n a doua, sunt utilizate programele soft pentru a manipula un model static furnizat de cristalografie. n astfel de programe se simuleaz schimbrile conformaionale ce ar avea loc n diferite condiii (schimbri de pH, temperatur, trie ionic, ligand). n paralel, oamenii de tiin studiaz i bazele de date ce conin structuri cunoscute, n ncercarea de a concepe un program soft care s prevad conformaia tridimensionl a unei proteine direct din structura sa primar.
3.3.3.4. Boli neurologice cauzate de modificri n conformaia proteinelor Prionii. Encefalopatiile spongiforme transmisibile sau bolile prionilor sunt maladii neurodegenerative fatale caracterizate prin modificri spongiforme i pierderi ale funciilor neuronilor cauzate de depunerea unor agregate proteice insolubile (prioni) n celulele nervoase. Acest tip de maladii include boala Creutzfeldt-Jakob la oameni, cpierea la oi i encefalopatia spongiform bovin la vaci (boala vacii nebune). Sursa i mecanismul transmiterii prionilor au fost mult vreme necunoscute, mai ales c nu s-a putut identifica nici o gen viral sau bacterian care sa i codifice. n momentul de fa se crede c maladiile prionice sunt de fapt maladii ale conformaiilor proteice transmise pe calea alterrii conformaie i, de unde i proprietile fizice neobinuite ale proteinelor endogene ale organismului bolnav. Proteina PrP, protein uman nrudit cu prionii, este o glicoprotein codificat de o gen aflat pe cromozomul 20. n mod normal, este monomeric i bogat n zone -helix. PrPc este un tip de proteine prionice patolog ice ce pot servi ca inductori pentru modificrile

44

conformaionale ale PrP normale n PrPsc. PrPsc este bogat n structuri -sheet cu multe catene hidrofobe provenite de la aminoacizii nepolari ndreptate spre faza apoas, condiii n care mai multe moclecule de PrPsc se asociaz puternic, formnd agregate rezistente la aciunea proteazelor. Deoare un prion patologic sau o molecu nrudit poate induce modificri conformaionale n lan, bolile prionice se pot transmite prin intermediul strict al proteinei, fr implicarea moleculelor de ADN sau ARN. Maladia Alzheimer. Caracteristica principal a maladiei Alzheimer o constituie replierea sau plierea incorect a unei proteine cerebrale, numit -amiloid. n timp ce cauzele maladiei ramn necunoscute, este clar c plcile senile caracteristice i fasciculele neurofibrilare conin agregate de -amiloid, o polipeptid de 4,3 kDa rezultat din clivarea de ctre o proteaz a unei proteine mai mari (proteina precursoare de amiloid). La pacienii cu maladie Alzheimer se observ o cretere semnificativ a nivelului de -amiloid, aceast protein suferind i modificri conformaionale de la forma bogat n -helixuri la cea bogat n structuri -sheet, devenind astfel capabile de autoagregare. Se pare ca mediatorul acestei transformri conformaionale este apolipoproteina E.

3.3.3.5. Structura colagenului Maturare proteinelor de multe ori implic ruperea i/sau formarea de legturi covalente, un proces numit modificare posttranslaional . Multe proteine sunt biosintetizate iniial ca precursori mai mari numii proproteine. De multe ori segmentele proteice care dispar ulterior servesc iniial pentru orientarea proteinelor ctre anumite compartimente celulare sau faciliteaz transportul prin membranele celulare. n alte cazu ri acestea au rolul de a inhiba activitatea potenial duntoare a unei proteine; astfel, proteaze de tipul tripsinei si chimotripsinei rmn inactive pn cnd aceste proteine ajung la destinaia final, moment n care fragmentele protectoare sunt ndeprtate prin proteoliz selectiv. Alte modificri chimice pot avea loc adugnd noi funcionaliti proteinei. Maturarea colagenului se face prin ambele aceste procese. Colagenul este o protein fibroas. Colagenul este cea mai abundent protein fibroas, reprezentnd mai mult de 25% din masa proteic uman. Alte proteine fibroase sunt keratina i miozina. Aceste proteine reprezint baza structural a celulelor (citoscheletul) i a esuturilor. Rezistena i elasticitatea pielii este dat de o reea de fibre de colagen i keratin, n timp ce oasele i dinii au la baz o reea de colagen asemntoare armturilor de oel din betonul armat. Colagenul intr i n alctuirea esuturilor con junctive (tendoane, cartilagii, ligamente). Marele grad de rezisten elastic a colagenului necesar pentru a duce la ndeplinire aceste roluri structurale deriv din secvenele repetate de aminoacizi i din structura secundar foarte regulat. Moleculele de colagen formeaz un triplu helix. Tropocolagenul este alctuit din trei fibre, fiecare avnd cca 1000 resturi de aminoacizi, mpletite ntr-o conformaie unic, numit triplu helix. O fibr matur de colagen are aspectul unui baston lung, cu un raport axial de aproximativ 200. Este alctuit dintr-o mpletitur de trei catene polipeptidice rsucite spre stnga. Aceast mpletitur se rsucete spre dreapta pentru a forma triplul helix al colagenului. Sensurile opuse de rsucire al acestui super helix i al componentelo r sale fac ca fibra de colagen s fie deosebit de rezis tent (acelai principiu se aplic la cablurile de susinere a podurilor suspendate). 45

-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-YStructura primar

Triplu helix de colagen

Figura 16. Structura colagenului.

Triplul helix al colagenului are 3,3 resturi de aminoacizi pe spir. Gruprile R din fiecare caten sunt aranjate att de compact, nct pentru a putea ncpea, fiecare al treilea aminoacid trebuie s fie o glicin. Colagenul este de asemenea bogat n prolin i hidroxiprolin, existnd secvena repetitiv Gly-X-Y, n care Y este de obicei prolin sau hidroxiprolin. Triplul helix este stabilizat prin legturi de hidrogen care se formeaz intercatenar. Gruprile OH ale hidroxiprolinei de asemenea particip la formarea legturilor de hidrogen intercatenare. Un plus de stabilitate este conferit de legturi covalente ncruciate (att intra ct i intercatenare) ntre resturi de lizin modificate chimic posttranslaional. Colagenul este sintetizat sub forma unui precursor mare. Colagenul este sintetizar iniial sub forma unei polipeptide numit procolagen, n care numeroase resturi prolil si lizil sunt hidroxilate de prolilhidrolaz i lizilhidrolaz, enzime care necesit acid ascorbic (vitamina C) pentru o bun funcionare. Resturile hidroxiprolil i hidroxilizil nou formate confer un plus de stabilitate prin formarea unor noi legturi de hidrogen. n plus, glucozil - i galactozil transferaze ataeaz resturi de glucoz sau galactoz la gruprile hidroxi de la anumite resturi de hidroxilizin. Ulterior acest or transformri, partea central a procolagenului se asociaz cu alte molecule formnd triplul helix. Acest proces este nsoit de ndeprtarea prin proteoliz selectiv a prii globulare amino -terminale precum i a extensiilor carboxi-terminale. Anumite resuri lizil sunt modificate de lizil oxidaz, o cupru-protein care transform gruparea amino n grupare aldehidic. Aceste grupri aldehidice se condenseaz cu gruprile amino ale lizinelor nemodificate, formnd baze Schiff (en-imine) care sunt ulterior reduse, cu formare de legturi simple C-N. Aceste legturi covalente leag ncruciat catenele polipeptidice, conferind fibrei de colagen o extraordinare rezisten i rigiditate.
3.3.3.6. Anumite insuficiene genetice i nutriionale perturb matur area colagenului. Cel mai bine cunoscut defect n biosinteza colagenului este scorbutul, care este provocat de lipsa vitaminei C din alimentaie. Aceast caren perturb buna funcionare a prolil- i lizil- hidrolazelor. Rezult un deficit n numrul resturilor de hidroxiprolin i hidroilizin care submineaz stabilitatea conformaional a fibrelor de colagen, ducnd la sngerarea

46

gingiilor, umflarea ncheieturilor, nevindecarea rnilor, i n cele din urm la moarte. Sindromul Menkes, caracterizat prin ntrzierea creterii, reflect o deficien de cupru n alimentaie, care duce la o proast funcionare a liziloxidazei, enzim care catalizeaz o reacie cheie n procesul de formare a legturilor ncruciate c e contribuie la rezistena fibrei de colagen. Deficiene genetice n biosinteza colagenului includ cteva forme de osteogenez imperfect caracterizate prin fragilitatea oaselor. n sindromul Ehlers-Dahlos, un grup de boli ale esutului con junctiv, apar defecte n genele care codific procolagen-N-peptidaza sau lizilhidrolaza, defecte care provoac anormaliti ale pielii i fragilizri ale ncheieturilor.

47