Designul primerilor

Primerul este un fragment scurt oligonucleotidic (de 15 40 de baze), monocatenar care

serveste ca punct de pornire pentru sinteza ADN-ului. El este necesar pentru replicarea ADN deoarece
enzimele care catalizeaza acest proces, polimerazele ADN, pot doar prelungi o molecula de ADN prin
adaugarea de noi nucleotide la capatul 3' al primerului, copiind astfel catena opusa.

In biologia moleculara primerii sunt utilizati in tehnici ca: RT-PCR, Real Time - PCR, PCR sau
secventierea ADN. Pentru designul primerilor in scop de clonare este nevoie sa se tina cont de cateva
reguli. Secventele primerilor trebuie sa corespunda (total sau pe o zona de 15-25 nucleotide, la capatul
3 al primerului) cu capetele moleculei de clonat/amplificat (matritei).

Primerul Forward (Fwd) contine codonul start ATG si prezinta aceeasi secventa nucleotidica cu
cea din capatul 5 al moleculei de interes. Primerul Revers (Rev), in general contine unul din cei 3
codoni stop (ex. TGA) si trebuie sa fie invers (in sens opus) si complementar cu capatul 3 al matritei.

La capetele 3 ale fiecarui primer este de preferat sa se regaseasca 1-2 nucleotide de tipul G sau
C, care formeaza legaturi stabile.

Secventa de clonat trebuie aleasa in functie de organismul din care provine. Daca este un
procariot se poate utiliza genomul (fiind util CDS-ul), insa daca este un organism eucariot se foloseste
ARNm deoarece acesta este lipsit de introni (ADN necodificator).

1. Accesati site-ul NCBI si cautati secventa CDS a genei pentru adenilat ciclaza din Bordetella
pertussis (GI: 580667), in format fasta (cu extensia .fas sau .fasta).

2. Selectati cate un fragment de 15-20 nucleotide de la fiecare capat al CDS-ului pentru a face
designul primerilor dupa indicatiile de mai sus.

La nevoie puteti folosi programul BioEdit. Pentru obtinerea secventei invers (in sens opus) si
complementara se acceseaza meniul Sequence/Nucleic Acid/Reveres Complement.

3. Instalati progamul PerlPrimer si deschideti-l. Programul poate fi descarcat de la adresa:

http://perlprimer.sourceforge.net/download.html.

4. Accesati modulul Primers si introduceti secventele primerilor in casutele corespunzatoare.

Apasati butonul Calculate TM.

Tm = temperatura de melting (temperatura la care ADN-ul este denaturat).

Pentru PCR temperatura de anelare (Ta) se ajusteaza in functie de Tm-ul primerilor. Este de
preferat ca Ta sa fie cu aproximativ 5C mai jos fata de Tm-ul primerilor (Tm = 50 77C). Dar exista
situatii experimentale in care aceasta teorie nu este valabila. Atunci Ta trebuie determinata empiric.
 Trebuie avut in vedere ca Tm-urile primerilor sa fie echilibrate (diferenta intre ele sa nu fie mai
mare de 3-5C). De asemenea nu ar fi bine sa existe o diferenta prea mare de dimensiune intre primerii
din cadrul aceleiasi perechi (max 5-10 nucleotide).

5. Asigurati-va ca nu exista dimeri de primeri, extensibili (situati la capetele 3 ale primerilor).

Acestia se pot vizualiza in regiunea Most stable 3' extensible primer-dimers (at 37C), if any.
In cazul in care exista dimeri de primeri, extensibili, se pot scoate sau adauga nucleotide (in
functie de matrita) la capatul 3 al primerilor in cauza.

6. In scopul clonarii se realizeaza primeri degenerati (primeri care nu sunt complet complementari
cu fragmentul de interes). Pentru acestia se aleg enzime care nu prezinta situsuri in cadrul
fragmentului de interes.
Adaugati, la inceputul fiecarui primer situsul de restrictie corespunzator: pentru Fwd NdeI
(situsul sau de restrictie contine codonul start ATG: CATATG), iar pentru Rev BamHI (situsul GGATCC).
Pentru o eficienta buna de digestie a enzimelor de restrictie, in fata situsurilor (la capatul 5) se
pun 4-6 nucleotide.
Ex.: Fwd Nde: 5' GGTGGTCATATG............. 3';
Rev Bam: 5' GTGGTGGATCCTCA......... 3'.

7. Odata designul primerilor realizat, acestia trebuie verificati pentru a ne asigura ca nu exista alte
zone in cadrul genomului sursei moleculei de interes, complementare cu primerii ce urmeaza a
fi folositi. Asfel se folosesc programele BLAST din cadrul NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Accesati programul nucleotide blast (adresa
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blastho
me).

8. Se introduce secventa primerului de analizat, in casuta corespunzatoare (Enter accession

number(s), gi(s), or FASTA sequence(s))

9. Pastrati bifat Others si setarea nucleotide colection (nr/nt) din dreptul Database.

10. Mentionati Bordetella pertussis in casuta din dreptul Organism deoarece molecula de clonat
(adenilat ciclaza) provine din acest organism. Se poate preciza chiar si tulpina ce urmeaza a fi
folosita pentru extragerea genei respective (ex. Tohama I).

11. Pastrati bifat Optimize for Highly similar sequences (megablast) din dreptul Optimise for din
domeniul Program Selection.

12. Apasati butonul BLAST.

Este de preferat ca zona 3 a primerilor (extensibila) sa prezinte complementaritate doar in cadrul genei
de interes.
Aceasta etapa este foarte importanta in cazul selectiei primerilor pentru secventiere sau Real Time
PCR.