INSTITUTUL DE GENETICĂ, FIZIOLOGIE ȘI

PROTECŢIE A PLANTELOR

TEHNICI MODERNE
DE CERCETARE
Doctor habilitat în biologie, profesor cercetător
Leonid VOLOŞCIUC

Chişinău, doctoranzi USM, 24.02.2022

 Toată ştiinţa nu este nimic mai mult decât o rafinare a gândirii de
zi cu zi. =Albert Einstein=
PRINCIPIILE CARE STAU LA BAZA CUNOAȘTERII
ȘTIINȚIFICE
 principiul realismului, potrivit căruia lumea înconjurătoare există
independent de observaţia noastră, nefiind creată de simţurile noastre;
 principiul determinismului, în conformitate cu care relaţiile din lumea
înconjurătoare sunt organizate în termeni de cauză-efect;
 principiul cognoscibilităţii, lumea înconjurătoare poate fi cunoscută prin
observaţii obiective.
MODALITĂȚI DE ABORDARE A CONCEPTULUI DE
ADEVĂR
 modul autoritarian (sau argumentul autorității) - se considera că anumiți preoţi, regi,
astrologi, etc. ar avea atributul natural sau supranatural de a produce adevărul. Cu
alte cuvinte, calităţile excepţionale ale producătorului enunțurilor garanta adevărul
acestora. Se aseamănă cu modul mistic de cunoaștere, unde calitatea adevăratei
cunoașteri rezidă în revelația divină.
 modul logico-raţional face apel la principiile logicii formale, adevărul stabilindu-se
prin deducție logică. Corespondența cu realitatea nu reprezintă o prioritate, ci
adevărul propozițional. Este o gândire specifică perioadei moderne.
 modul ştiinţific de determinare a adevărului, care combină aplicarea metodelor de
cunoaştere cu observația fenomenelor. Metoda ştiinţifică conferă obiectivitate
cunoaşterii, încercând să construiască o imagine cât mai apropiată de realitate a lumii
înconjurătoare.
 - modul observaţiei obiective, prin care se obţin enunțuri empirice cu valoare de
adevăr prin utilizarea metodelor potrivite.
 POSTULATELE FUNDAMENTALE ALE
METODEI ȘTIINȚIFICE
 se bazează pe evidențe empirice;
 utilizează concepte relevante;

 formulează numai considerații obiective;

 presupune neutralitate etică, având ca scop doar formularea

unor afirmații adecvate și corecte;
 are ca rezultat apariția unor predicții probabilistice;

 metodologia este cunoscută de toți cei interesați pentru analiza

critică, fiind folosită pentru testarea concluziilor prin replicare;
 are ca scop formularea unor axiome generale.
Rezultatele depind de ceea cum experimentezi
Hippocrates of Cos II (~460 BCE – ~370 BCE)
 MODALITĂŢI DE STUDIU
 in
vivo - când celulele sau organele ale căror celule
dorim să le studiem sunt abordate în organismul intact.

 Avantaje: rezultatele obţinute sunt edificatoare pentru

procesul studiat la nivel de organism.
 Dezavantaje: rezultatele experiențelor sunt dificil de
interpretat datorită influenţelor celorlalte componente
ale organismului
7
 MODALITĂŢI DE STUDIU
 in
situ – când organul de interes este
menținut la locul său în organism dar sunt
controlate unele influențe, cum sunt cele
nervoase sau endocrine.
 Avantaje:se pot studia variaţiile procesului
în condiţii controlate.
 Dezavantaje: nu se poate identifica
rezultatul cu cel în vivo. 8
invitro – când organul , ţesutul sau
celulele sunt izolate din organism.
Avantaje: se permite un control
riguros al experimentului.
Dezavantaje: nu se poate garanta
obţinerea aceloraşi rezultate in vivo.
9
SELECŢIA TULPINILOR DUPĂ ACUMULAREA
POLIEDRELOR «IN VITRO»
 Jansen

Sacharias Jansen was a Dutch spectacle-maker credited with inventing, or

Sacharias Jansen (~1575-
contributing advances towards the invention of, the telescope. In 2008, the
Netherlands commemorated the 400 th anniversary of the telescope,
honoring Jansen as one of the two possible inventors, the other being
Hans Lippershey. Jansen is credited with inventing the first compound
microscope. Jansen's life was documented very well before WWII. Many of
the archives were destroyed by a bombardment during the Nazi invasion of
the Netherlands. If there had not been earlier studies, we would not know

~1632)
1595-1660 S & H Jansen, R Hooke
anything of Jansen's life, since all primary files were lost in the fires
development of the first compound microscopes and illumination systems
following the bombardment. Janssen invented the microscope, with the
help of his father, Hans, in 1595.
Primul care a
observat
celulele
a fost
Robert Hooke.
 Anton van Leeuwenhoek
1668 A van Leeuwenhoek (1632-1723)
invention of a simple microscope, observation of bacteria
 Anton van Leeuwenhoek (1632-1723)
1668 A van Leeuwenhoek invention of a simple microscope, observation of bacteria
 CULTURI DE CELULE
 Digestia enzimatica a tesutului cu obtinerea unei
suspensii de celule
  Izolarea unei populaţii celulare pure
  Însămânţarea în flacoane de cultură sau plăci Petri
obţinându-se astfel o cultură primară
 Pasarea - resuspendarea celulelor din cultura primara
urmată de de reînsămânţarea în flacoane de cultură
sau plăci Petri obţinându-se culturi secundare
15
 CULTURI CELULARE - EVOLUŢIE
1.    Faza de lag sau de inducţie - celulele îşi refac suprafaţa şi se acomodează cu
mediul de cultură
2.   Faza exponenţială - celulele se divid rapid, exponenţial
3.   Faza staţionară - numărul de celule rămâne constant. In această fază se
efectuează pasarea
4. Faza de declin - scăderea nr. de celule datorită îmbătrânirii şi morţii .
Medii de cultură – Componente
1. Amimoacizi şi vitamine
2. Săruri – necesare menţinerii echilibrului ionic şi pH mediului de cultură
3. Glucoza pentru necesarul energetic
4.  Ser fetal
16
5. Antibiotice
6. Rosu fenol ca indicator de pH
 (THOMAS
CARLYLE)
 Ilustrul biolog I.I.Mecinicov,
Societatea Naturaliştilor din Basarabia,
 Staţia Bioentomologică din Chişinău (I.Krasilșcik).
 Catedra PP UASM
(Verderevskii D.D.).
CĂUTA ADEVĂRUL ŞI NU ESTE O COLECŢIE DE
ADEVĂRURI
SCRININGUL PERMANENT ŞI TITRAREA SUŞELOR
NOI DE VIRUSURI
ACUMULAREA BIOMASEI VIRALE PENTRU TITRAREA
ULTERIOARĂ
 1. Morfologia si morfometria
2. Citometria in flux
3. Fractionarea celulara
4. Citochimia si citoenzimologia
5. Imunocitochimia
6. Fluorescenta si imunofluorescenta
7. Microfiziologia si microinjectia
8. Radioautografia
9. Metode biochimice
10. Tehnici si metode de biologie moleculara
23
IDENTIFICAREA CU AJUTORUL MICROSCOPIEI
OPTICE
ELEMENTELE STRUCTURALE ALE
VURUSURILOR COMPLEXE
 MORFOMETRIA
- utilizează un analizor de imagine.
- se stabileşte criteriul dupa care se va efectua analiza, precum şi limitele maximă şi
minimă ale acestuia
- Rezultat: diferite populaţii celulare.
 Citometria în flux
permite analiza şi separarea celulelor pe baza unor caractere morfologice şi biochimice
Oferă informaţii asupra:
1.     mărimii relative a celulelor
2.     granularităţii interne (neomogenitatea internă citoplasmatică) relativă
3.     intensitatea relativă a fluorescenţei.
 măsurarea caracteristicilor fizice ale celulei
 2.     identificarea si separarea populaţiilor de celule sanguine ( granulocite, monocite , limfocite T sau B)
 3.     măsurarea cantităţii de ADN din celulă
 4.     măsurarea cantităţii intracelulare de Ca
26
 5.     masurarea pH-ului intracelular
 FRACŢIONAREA CELULARĂ

   Omogenizarea –distrugerea integrităţii tisulare şi apoi celulare
cu obţinerea unei suspensii de organite şi membrane veziculate în
mediul de omogenizare
 Separarea prin centrifugare şi/ sau ultracentrifugare.
 a.   prin soc osmotic. Diferenţa de osmolaritate între mediul i.c.
si cel e.c. duce la umflarea celulelor pana la ruperea
membranelor.
 b.   prin ultrasonicare – presupune ruperea membranelor sub
acţiunea undelor ultrasonice
 c.    cu omogenizatoare se realizeaza sub acţiunea forţelor de
frecare şi torsiune care contribuie la ruperea membranelor.
27
 PURIFICAREA VIRUSURILOR ÎN
GRADIENTUL DENSITĂŢII ZAHAROZEI
 SEPARAREA
    
diferenţială – cand organitele se depun la
baza tubului , în ordinea densităţii lor prin
centrifugari repetate la forţe din ce în ce mai
mari
 în gradient de densitate –printr-o
singură centrifugare la forţe suficient de
ridicate se obţin organitele ca fracţii separate29 .
 Se p a ra re a c o n s titu e n tilo r
c e lu la ri p rin v ite ze d e c e n tri-
fu g a re c re s c a n d e

Pu rific a re in
g ra d ie n t
d e d e n s ita te

Me m b ra n e
Mito c o n d rii c e lu la re
G o lg i
Lizo zo m i
NUC LEI m ic ro s o m i
Ultra s o n ic a re
30
Rib o s o m i re tic u l e n d o p la s m ic
 AUTORADIOGRAFIA
 tehnica de investigare celulară ce permite identificarea
morfologică şi ultrastructurală a unor compuşi radioactivi.

 trasori radioactivi :
- aminoacizi, glucide, nucleotide
- fosfat sau sulfat radioactiv.

- liganzi radioactivi specifici.

31
1857> L Pasteur father of microbiology
1876
Robert Koch (1843-1910)
R Koch with Pasteur, the founder of microbiology, first incontrovertible proof that a microorganism can cause disease (Bacillus anthracis—
anthrax)
 Ilya Ilyich
Mechnikov
(1845-1916)

1883> E Metchnikoff, J Bordet, E von Behring, founding of immunology, hematology and chemotherapy
P Ehrlich, Shiga Kiyoshi
 Descoperirea virusului
mosaicului tutunului

Dmitry Ivanovsky
1892 D Ivanovsky
1864-1920
discovery of tobacco mosaic virus *see next slides
 ELECTROFOREZA
 PRINCIPIU: particulele încărcate electric migrează într-un mediu
vâscos, sub acţiunea unui câmp electric.
 Aplicaţii practice: studiul proteinelor şi a acizilor nucleici.
 a.    unidimensională , cand migrarea se realizează în gel într-o
singură direcţie
 b.    bidimensională , când migrarea se realizează succesiv în două
direcţii
 Aplicaţii practice – electroforeza unidimensională
 SDS – PAGE, FOCALIZAREA IZOELECTRICA.
 realizează separarea proteinelor dintr-un amestec pe baza
gabaritului molecular direct proporţional cu masa moleculară.
 Principiu: adsorbţia dodecilsulfatului de sodiu unitar pe proteine,
realizând o densitate de sarcină negativă uniformă. 36
 FOCALIZAREA IZOELECTRICA
-separarea proteinelor dintr-un amestec se face pe baza
punctului lor izoelectric.
 Principiu: migrarea proteinelor în funcţie de punctul
izoelectric, până în zona cu pH-ul identic cu cel al
punctului lor izoelectric, unde devin neutre oprindu-şi
miscarea.

37

Be n zi p ro te ic e la p u n c tu l izo e le c tric
 ELECTROFOREZA BIDIMENSIONALA
 -migrarea proteinelor în două direcţii :
 1.     in prima direcţie în funcţie de punctul lor izoelectric -
FOCALIZARE IZOELECTRICA
 2.     a doua direcţie - SDS – PAGE , în funcţie de greutatea moleculară a
proteinelor.
 Rezultatul se prezinta sub forma unei hărţi cu proteinele separate în
planul gelului. Ele c tro fo re za la p u n c t izo e le c tric

SDS-

38
 IMUNOELECTROFOREZA
  -o variantă a electroforezei ce combină migrarea în
câmp electric a proteinelor cu realizarea unei reactii
imune de tip Ag-Ac
 Reactia imuna:

 -dupa terminarea migrarii electroforetice,

 -concomitent (imunoelectroforeza în rachetă) -

apreciere cantitativă a Ag (= suprafaţa descrisă de
linia de precipitare cu linia de start).
39
REZULTATELE ANALIZEI SEROLOGICE ÎN
GELOZĂ
 PRECIPITAREA IN GELOZĂ

DUBLA DIFUZIE
RC. OUCHTERLONY
IMUNOELECTROFOREZA

42
 TRANSFERUL ELECTROFORETIC

-metodă
de extragere a proteinelor
separate electroforetic dintr-un gel , cu
adsorbirea lor pe niste hârtii cu
proprietăţi speciale.

 Proteinele suferă reacţii de recunoaştere

specifică prin intermediul unor
interacţiuni de tip receptor – ligand sau
Ag – Ac. 43
Metodologia cercetării
ELECTRONOGRAME SARS COV-
2
 Metode de cercetare
1. Îndeplinirea postulatelor Triadei Koch:
- Demonstrarea prezenţei permanente a particulelor virale în organismul
bolnav,
- Obţinerea culturii pure a patogenului pe culturi celulare.
- Reproducerea simptomelor similare prin infectarea artificială
experimentală a organismelor sănătoase cu cultura pură a patogenului.
Această regulă generală pentru toţi patogenii capătă un aspect deosebit
pentru virusuri (V. Rivers, 1954):
1.Izolarea virusului din organismul bolnav,
2.Cultivarea virusului în celule sau organisme indicatoare,
3.Demonstrarea caracterului de ultramicroorganism la ultrafiltrare,
4.Reproducerea bolii cu simptome similare la organismele sănătoase
5.Izolarea repetată a aceluiaşi virus.
 2. Simptomatologia,
3. Colonii negative pe medii agarizate de cultură
4. Colonii negative pe fibroblaştii embrionilor de găină
5. Lezarea membranelor horioalantoice de către vurusul mixomei, encefalitei
ş.a.
6. Metoda organismelor (plantelor) indicatoare,
7. Metodele de cercetare microscopică optică (microscopie optică simplă, cu
contrast de fază, cu fundal întunecat, luminiscent,
8. Metodele de cercetare electrono-microscopică (cu transmisie, cu baleiaj, cu
tunel),
9. Metode serologice de analiză
10. Analiza imunofermentativă
11. Analiza restricţională,
12. Reacţia polimerazică în lanţ,
13. Analiza roentgheno-structurală,
14. Editarea genonului.
 BLOTURILE
- Metodă de transfer a unor proteine, secvente ADN sau ARN, dintr-un gel
electroforetic pe un suport care permite vizualizarea lor ulterioară. Utilizate pentru
identificarea prezenţei unor proteine/ secvenţe ADN într-un lizat celular
- Southern Blot
- Utilizat pentru identificarea unei anumite secvenţe ADN, prin folosirea unei probe ce
conţine secvenţa complementară celei căutate. Proba de hibridizare este marcată
fluorescent sau radiografic, permiţând depistarea ulterioară a preparatelor care
conţin secvenţa căutată
- Northen Blot
- Detectarea anumitor secvente de ARN. Similară ca procedură Southern Blot –ului.
Furnizează informaţii legate de exprimarea anumitor gene în anumite populaţii
celulare
56
 WESTERN BLOT
- identificarea unei anumite proteine într-un omogenizat
tisular
-Proteinele din preparat sunt separate prin electroforeză
în gel, apoi transferate pe o membrană suport unde, prin
adăugarea Ac specific, se va identifica prezenţa/absenţa
proteinei sau cantitatea ei în proba dată.
 Utilizări:

Cea mai folosită metodă pentru determinare cantitativă

de proteine
Oferă informaţii legate de modificarea cantitativă a
unei proteine în funcţie de tipul celular sau tratamentele
aplicate unei populaţii celulare
57
PCR = POLYMERASE CHAIN REACTION
(REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI)
 Mullis & Faloona – Specific synthesis
of DNA in vitro via a polymerase-
catalyzed chain reaction, 1987.
 Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993.

 Amplificarea cu ajutorul unei enzime

(ADN-polimeraza) a numărului de
copii ale unei regiuni specifice dintr-
un lanţ ADN.
 PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
- Folosită pentru obţinerea unui număr mare de copii a
unei anumite secvenţe de ADN
 Etape

 1. denaturarea ADN cu separarea catenelor

complementare
 2. adaugarea primerilor (secvenţe ADN
complementare secvenţei-ţintă)
 3. sub acţiunea Taq-polimerazei se sintetizează 59noi
secvenţe de ADN dc
RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE PCR)
- Metodă foarte sensibilă de detectare şi
cuantificare a ARNm
- Iniţial din ARN-ul ţintă se sintetizează
secvenţa cADN, apoi urmează etapele PCR
- Utilizată în diagnosticul unor boli genetice,
cuantificarea expresiei diverselor gene prin
determinarea cantităţii de ARNm
60
 TEHNICA DE “EDITARE” A GENOMULUI

Editarea genetică include inserția, deleția sau înlocuirea unei porțiuni de ADN, utilizând
nucleaze sintetizate în laborator (ZFP , TALEN, CRISPR-cas9).
CRISPR-cas9 (Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats, scurte
repetiţii palindrom intercalate în mod regulat ) a fost recunoscută ca invenția anului 2015.
Elaborată în 2012 de Jennifer Doudna (SUA) și Emmanuelle Charpentier (Franța) ca un
instrument care permite corectarea defectelor ADN-ului, CRISPR funcționează
asemenea unor ”foarfece” moleculare ce permit decuparea selectivă a zonelor nedorite
din cadrul genomului și înlocuirea acestora cu noi fragmente de ADN.
Specialiștii din domeniul eticii consideră: editarea genetică a embrionilor umani este
„permisibilă moral”. (Premoil Nobel - 2020).
Progresele științifice actuale demonstrează că CRISPR este nu doar o tehnologie extrem
de versatilă, ci una care se dovedește a fi precisă și din ce în ce mai sigură de utilizat.
CERCETĂRI EPIDEMIOLOGICE
Pavlovskii E.N.,
epid.generală,
Lwoff A.,
epid.medicală,
Vlasov I.,
epid.fitosanitară.
Vectorii virusurilor
TORȚELUL (CUSCUTA)
 POSTACŢIUNEA PREPARATULUI
VIRIN-ABB-3 ASUPRA H.CUNEA
100

90

G 80

r
a
70
d

60
d
e
50

a
t 40

a
c
30
,

20
%
Pavlov

10 Urițchi

Kolițov

0 Râscani

1 Sângera
2
3
4 Oboleni
5
6
Ani dupa tratamente 7
EDWARD JENNER – PĂRINTELE VACCINĂRII

Descoperirea vaccinului antivariolic

 TIPURI DE VACCIN ELABORATE PENTRU COMBATEREA SARS COV-2
 Vaccinuri bazate pe proteine (vaccinuri subunitare) - conțin proteine ale patogenului țintă sau
fragmente din acestea obținute prin diferite procese tehnologice, dar nu și informația genetică
necesară producerii lor.
 Vaccinuri bazate pe vectori virali: vaccinul conține un virus modificat, nepatogen (vector), în care
sunt introduse fragmente din informația genetică a patogenului țintă. Unii vectori intră în celulele
organismului și le furnizează informația necesară pentru a produce singure proteine ale patogenului
țintă pentru a declanșa un răspuns imun, iar alții prezintă direct proteinele țintă pe suprafață.
 Vaccinuri genetice: vaccinurile conțin fragmente de informație genetică de la patogenul țintă care
odată ajunse în celulele de la locul administrării le permit acestora să producă singure proteine pentru
a declanșa un răspuns imun. Din această categorie fac parte vaccinurile bazate pe ADN și ARN-
mesager. Acestea nu presupun modificarea informației genetice a persoanei vaccinate. Fragmentele
genetice livrate în vaccin sunt degradate/eliminate la un interval de timp scurt după vaccinare.
 Vaccinuri inactivate: vaccinul conține o formă slabită (atenuată) sau inactivată a patogenului care
este incapabilă să producă îmbolnăvirea.
 ELABORAREA ŞI APLICAREA PREPARATELOR
BIOLOGICE ÎN BAZĂ DE BACTERIOFAGI

 Institutul de Protecţie Biologică din Germania – fagi în

combaterea bacteriozelor la culturile agricole,
 Institutul de Microbiologie de la Minsk (Belarus) -preparatul
Pentafag, care conţine 5 tipuri de fagi, cu acţiune asupra
bacteriilor patogene la pomii fructiferi şi faţă de făinarea mărului,
 IPPAE – preparatul Pentafag-M.
 BIOTEHNOLOGIA - UTILIZAREA CONTROLATĂ SAU DELIBERATĂ A
AGENȚILOR BIOLOGICI ÎN CADRUL UNOR OPERAȚII TEHNICE, SAU ÎN
CADRUL UNOR PROCESE TEHNOLOGICE CARE DUC LA OBȚINEREA UNUI
PRODUS FINIT
Utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei și ingineriei în scopul obținerii unei
aplicații tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor, culturilor de celule și
a părților componente ale acestora.
-producerea de biomasă pentru alimentație și hrana animalelor;
-a compușilor chimici utilizați în alimentație;
- în obținerea de produși celulari din plante și animale, obținerea materialului săditor
devirozat, obținerea biomasei și formelor preparative a diferitor preparate biologice
- tratarea epurarea apelor reziduale și soluționarea problemelor ecologice.
-În funcție de domeniul în care se aplica deosebim:
-industriale,
-agricole,
-medical veterinare,
-ecologice,
-sănătate publică.
 PREPARATE VIRALE
VIRIN-ABB-3 - pentru combaterea Omizii păroase a dudului (Hyphantria cunea) în livezi, plantaţiile silvice şi în
parcuri.
VIRIN-KS - pentru combaterea Buhei-verzii (Mamestra brassicae) la varză, tomate, culturile legumicole. Preparatul este
bazat pe virusul poliedrozei nucleare a buhei verzii.
VIRIN-OS - pentru combaterea Buhei-semanaturilor (Agrotis segetum) si buhelor din genul Agrotis (Ypsilon,
Exclamatoare) la culturile legumicole, tehnice (tutun, sfecla pentru zahăr), bostănoase şi ierburi medicinale.
VIRIN-HS-2 - pentru combaterea Buhei frucificaţiilor (Helicoverpa). Preparatul este bazat pe virusul poliedrozei
nucleare a gazdei nespecifice.
VIRIN-CP - pentru combaterea Viermelui-merelor (Cydia pomonella) în livezi.
Elaborarea prepartelor bacteriofagice pentru
combaterea Еrwinia amylovora, φX174
Elaborarea procedeelor tehnologice de
producere a biomasei
 SCHEMA TEHNOLOGIEI DE OBȚINERE A MATERIALULUI
SĂDITOR DEVIROZAT PRIN METODA MERISTEMELOR IN
VITRO

Anatomia meristemului apical

 ŞTIINŢA ESTE O UNEALTĂ TĂIOASĂ, CU
CARE OAMENII SE JOACĂ PRECUM NIŞTE
COPII ÎŞI TAIE DEGETELE
SAVANȚI MODELE
GENII
VĂ MULŢUMESC PENTRU ATENŢIE