BUN VENIT SI SUCCES IN NOUL AN

UNIVERSITAR!
Microbiologie medicală
 Definiţii

 Microbiologia = ştiinţa care se ocupă cu studiul

microorganismelor.
 Microorganism = organism unicelular care poate fi
pus în evidenţă numai cu ajutorul microscopului optic
sau electronic.
Istoric
• sute de ani existenţa microbilor a fost bănuită
dar prezenţa lor a putut fi documentată doar
odată cu apariţia microscopului;
Istoric
• 1665 Robert Hooke, un tânăr
cercetător englez, a fost primul
care a văzut şi descris fungii cu
ajutorul unui microscop
rudimentar.
Istoric
• În 1673 Antonius van
Leeuwenhoek,
cercetător olandez, a
observat primele
microorganisme tot la
un microscop propriu,
rudimentar.
• Este considerat
“părintele
microbiologiei”
 Istoric
• Desenele cu
„animalculi” publicate
la Londra în 1784 au
zdruncinat lumea
ştiinţifică de atunci.
• A fost pentru prima dată
când bacteriile au putut
fi „văzute”.
Desenele cu „animalculi” ale lui Antonius van
Leeuwenhoek
 Teoria generaţiei spontane
• Francesco Redi, un
filosof italian, a arătat
că „viermii” nu se nasc
spontan din carne ci din
ouăle depuse de muşte.
 Teoria generaţiei spontane
• John Needham, un preot englez, susţinea că
moleculele inerte din lichidele biologice se pot
grupa formând “animalculi”
• Lazaro Spallanzani, în 1765, a demonstrat
că un bulion fiert, lăsat în contact cu aerul,
după câteva zile se tulbură, dar rămâne
limpede dacă balonul este închis.
 Combaterea teoria generaţiei
spontane
• În 1859 chimistul
francez Louis Pasteur
discreditează definitiv
această teorie prin
conceperea balonului cu
„gât de lebădă” în care
aerul nu avea acces şi
bulionul fiert putea fi
păstrat indefinit fără ca
în el să se devolte
microorganisme.
Combaterea teoriei generaţiei
spontane
 Istoric

• Consecinţele acestor experimente au fost:

– imaginarea primului mediu de cultură pentru
bacterii – bulionul de carne - folosit şi astăzi;
– elaborarea unor metode simple de dezinfecţie
(distrugerea tuturor microorganismelor dar nu şi a
sporilor);
– introducerea conceptului manipulării aseptice a
obiectelor, produselor patologice, etc. (la adăpost
de microorganisme);
 Intemeietorii microbiologiei:

Luis Pasteur (1822-1895)

- Pune bazele sterilizării şi metodicii lucrului
aseptic.
- Descoperă natura microbiană a proceselor de fermentare
anormală a vinului.
- Face legatura între “bolile vinului” şi unele boli infecto-
contagioase la animale şi om.
- Descoperă numeroşi agenţi etiologici ai acestora.
- Realizează vaccinuri prin inactivarea sau atenuarea
patogenităţii unor microorganisme (rabie, antrax, holera
găinilor).
 Istoric
• În 1776, Edward Jenner,
medic englez, realizează
prima vaccinare
experimentală împotriva
variolei.
• In prezent, variola este
singura boală
infecţioasă eradicată.
 Istoric
• În 1841, cu 30 de ani înainte de formularea
teoriei germenilor, Ignaz Semmelweis
introduce pentru prima dată în lume „spălatul
pe mâini” şi folosirea halatelor curate în
maternitatea pe care a condus-o la Viena
(prima aplicaţie practică a antisepsiei).
 Teoria germenilor
• În anii 1870 Robert Koch,
medic german, a evidenţiat
agentul etiologic al
antraxului, holerei şi
tuberculozei;
• a introdus mediile solide în
practica microbiologică.
 Robert Koch (1843-1910)

- A examinat microorganismele în preparate

fixate prin caldură şi colorate cu coloranţi
bazici.
- A introdus mediile solide în practica
diagnosticului microbiologic.
- A reprodus experimental boli infecţioase prin
inocularea agentului etiologic la animale de
laborator.
 Robert Koch
- A descris secvenţe experimentale pentru susţinerea relaţiei
cauzale între un microorganism şi manifestările de boală
(postulatele lui Koch):
• microorganismul care a determinat boala este depistat la
toţi bolnavii iar distribuţia în organism corespunde
leziunilor caracteristice bolii;
• microorganismul care a determinat boala poate fi izolat în
cultură pură şi subcultivat pentru a fi studiat;
• cultura pură inoculată la un animal receptiv reproduce
boala cu leziuni specifice de unde poate fi reizolat.
 Istoric
• Chirurgul englez
Joseph Lister a
folosit principiile
antiseptizării şi
asepsiei şi a redus,
în 1860, la 15%
mortalitatea datorată
intervenţiilor
chirurgicale.
 Alte descoperiri importante:

• 1884 - Cristian Gram dezvoltă o metodă de

colorare şi diferenţiere a bacteriilor;
• 1887 - Petri realizează plăcile Petri;
• 1892 - Ivanovski descoperă virusurile;
• 1910 - Paul Ehrlich descoperă „salvarsanul” –
primul chimioterapic folosit în terapia
sifilisului;
 Alte descoperiri
• 1928 Alexander Fleming descoperă penicilina;
• 1977 Gilbert şi Sanger secvenţializează ADN-ul;
• 1983 Mullis pune bazele reacţiei de amplificare
genică (PCR);
• 1983 Luc Montaigner şi Robert Gallo descoperă HIV;
• Microbiologi români: Victor Babeş (co-autor la
primul tratat de bacteriologie) şi Ion Cantacuzino
(creatorul Şcolii de microbiologie în România).
 Lumea microorganismelor

- Microorganisme cu structură celulară:

• Eucariote (regnul Eucaryota), constituite din celule cu

structură evoluată: fungi şi protozoare;
• Procariote (regnul Procaryotae), constituite din celule
cu structură primitivă: bacterii şi alge albastre-verzi.

- Entităţi acelulare, la limita viului: virusuri (strict parazite

intracelular).
 Clasificarea bacteriilor

1. Clasificarea fenotipică;
2. Clasificarea analitică;
3. Clasificarea genotipică;

Taxonomie: clasificarea sistematică a

bacteriilor în grupe ordonate şi numirea
lor.
 Clasificarea fenotipică
• După afinitatea tinctorială:
 Gram pozitive;
 Gram negative;
• După formă:
 Sferice sau ovalare – coci;
 Alungite – bacili;
 Virgulă – vibrioni;
 Spiralate – spirochete;
Coloratia Gram
 Clasificarea fenotipică
• După caracterele de cultură:
 Hemoliza, pigmentogeneza, forma, mărimea
coloniilor, mirosul degajat de o cultură;
• După prezenţa sau absenţa unor markeri
biochimici specifici.
• Serotipare: anticorpii formaţi faţă de
antigenele bacteriene unice pot fi folosiţi
pentru identificarea lor.
• După comportamentul faţă de antibiotice
(patern de rezistenţă).
 Clasificarea analitică
• Regn – ordin – familie – gen- specie –
subspecie.
• Ex. Ordin: Eubacteriales
• Ex. Familie: Enterobacteriaceae
• Ex. Gen: Escherihia
• Ex. Specie: Escherihia coli
• Ex. Subspecie: Fusobacterium nucleatum
subsp. nucleatum
 Clasificarea genotipică
• Analiza materialului genetic:
Raportul guanină – citozină
Hibridizarea ADN
Analiza secvenţelor nucleotidice
Ribotipare
Analiza ADN-ului cromosomal
Analiza ADN-ului plasmidic
 Lumea microorganismelor

• Bacteriile au dimensiuni cuprinse între 1 şi 10 μm

şi sunt observate la microscopul optic.
 Structura celulei bacteriene

- Structuri constante
• material nuclear sau nucleoid
• citoplasmă
• membrană citoplasmatică
• perete celular
- Structuri facultative
• glicocalix
• flageli
• pili comuni (fimbrii) şi pili sexuali
• endospor
Structura celulei bacteriene -
schematic
 STRUCTURI ESENTIALE:

Materialul nuclear

Citoplasma

Membrana citoplasmatica

Peretele bacterian (exceptie:

Mollicutes - Mycoplasma)
 Material nuclear

echivalentul nucleului celulelor eucariote, fără

membrană nucleară şi nucleol;
Cromosomul bacterian unic este format dintr-o
moleculă circulară unică de ADN (1000-2000 µm) cu
structură bicatenară complementară şi antiparalelă;
pentru a ocupa un spaţiu cât mai redus, dublul helix este
rulat în sens negativ sub efectul ADN-girazei;
unele bacterii au în citoplasmă plasmide, molecule mici
circulare de ADN care conferă avantaje selective (e.g.
rezistenţa la antibiotice, producerea de toxine, etc.)
 Material nuclear
funcţii:
- reprezintă suportul genetic al caracterelor
ereditare;
- transmite informaţia genetică la celulele fiice
prin autoreplicare;
- transmite informaţia catre ribozomi prin
heteroreplicare;
Cromozomul bacterian şi
plasmidele
STRUCTURI ESENTIALE:

Materialul nuclear

Citoplasma

Membrana citoplasmatica

Peretele bacterian (exceptie:

Mollicutes)
 Citoplasma bacteriană

 hidrogel coloidal ce prezintă:

- o fază dispersantă ce conţine apă, substanţe organice şi
săruri anorganice;
- o fază dispersată reprezentată de:
• ribozomi, mai mici decât la celulele eucariote (50S şi
30S), sediul sintezelor proteice;
• incluzii, acumulări de substanţe organice sau
anorganice prezente la unele bacterii (reprezintă
depozite de nutrienţi; pot avea carcater taxonomic –
e.g. granulaţiile de volutină prezente la
Corynebacterium diphteriae).
Ribozomii bacterieni
Ribozomii bacterieni
Sintetizarea proteinelor
 STRUCTURI ESENTIALE:

Materialul nuclear

Citoplasma

Membrana citoplasmatică

Peretele bacterian (excepţie:

Mollicutes - Mycoplasma, Ureaplasma).
 Membrana citoplasmatică

mărgineşte la exterior citoplasma;

constituită din două straturi fosfolipidice în
care flotează molecule proteice;

nu conţine steroli (excepţie micoplasmele);

Membrana citoplasmatică
Membrana citoplasmatică
la b.g.n.
 Membrana citoplasmatică

funcţii:
- barieră osmotică, cu proprietăţi de permeabilitate
şi transport selective;
- sediul metabolismului energetic;
- include enzime implicate în sinteza unor
structuri celulare;
- rol în chimiotaxie;
- structura şi funcţionalitatea pot fi afectate de
unele antibiotice şi dezinfectante.
 STRUCTURI ESENTIALE:

Materialul nuclear

Membrana citoplasmatica

Citoplasma

Peretele bacterian (excepţie: nu

este prezent la Mollicutes)
 Peretele celular

structură particulară celulelor procariote;

înveleşte protoplastul în contact intim cu
membrana citoplasmatică;
structura sa diferită condiţionează comportamentul
bacteriilor în coloraţiile diferenţiale: Gram şi
Ziehl-Neelsen;
 peptidoglicanul sau mureina reprezintă
constituentul de bază, constant prezent la bacterii
(excepţie chlamidiile şi micoplasmele) .
Compoziţia peretelui dictează comportamentul
diferit in coloraţia Gram
 Coloraţia Gram
• Gram negativ (roşii)
• Gram pozitiv (violet)
Bacterii Gram pozitiv – Streptococcus
(coci sferici, în lanţuri)
 Bacterii Gram negativ – b.g.n.
(Ex. Escherichia, Salmonella) (b.g.n., celule
inflamatorii)
Coloraţia Ziehl- Neelsen
(b.a.a.r şi ne-a.a.r.)
Peretele bacteriilor Gram (+)
Peretele bacteriilor Gram (-)
 Structura peptidoglicanului
 reţea macromoleculară alcătuită din lanţuri glicanice
legate prin punţi peptidice;
 este mai bine reprezentat cantitativ la bacteriile gram-
pozitive;
 lanţurile glicanice sunt formate din alternanţa a două
aminozaharuri: N-acetilglucozamina şi acidul N-
acetilmuramic;
 lanţurile tetrapeptidice constituite din alternanţa unor
aminoacizi în forma L sau D se leagă de grupările
carboxil ale acidului N-acetilmuramic ;
 la bacteriile gram-pozitive unităţile tetrapeptidice ale
lanţurilor glicanice adiacente sunt legate prin punţi
transversale polipeptidice.
Peptidoglicanul - BGN –bidimensional; puntea
pentaglicanica, BGP – tridimensional; punţi
polipeptidice
 Reţeaua macromoleculară alcătuită din
lanţuri glicanice legate prin punţi peptidice
L-alanine
D-glutamic acid
L-lysine/Diaminopimelic acid
D-alanine
D-alanine Peptidoglycan

Muramic acid

Glucosamine
Peptidoglican- schematic
 Sinteza peptidoglicanului – controlată de enzime de pe
suprafaţa externă a membranei citoplasmatice
(sunt proteinele de legare ale penicilinei – PLP – analog strutural de D-
ala-D-ala, se fixează pe PLP si inhibă sinteza peptidoglicanului)

Citoplasma Membrana celulara

undecaprenol Perete celular

zahar

amino
acid
 Sinteza peptidoglicanului

• Controlată de enzime de pe suprafaţa externă a

membranei citoplasmatice:
- transglicozilazele, leagă cele 2 zaharuri;
- transpeptidazele, catalizează formarea
subunităţilor şi punţilor peptidice – structuri care
conţin dipeptidul D-alanină-D-alanină.
• Peretele bacterian este ancorat în MC, prin lanţurile
de glican in formare.
 Sinteza peptidoglicanului

• Enzimele care controlează sinteza

peptidoglicanului sunt denumite:
proteinele de legare ale penicilinei –
PLP – analog strutural de D-ala-D-ala;
• Penicilina se fixează pe PLP si inhibă
sinteza peptidoglicanului – penicilina
face parte dintrre antibioticele care
acţionează asupra bacteriilor prin
distrugerea peretelui.
 Funcţiile petidoglicanului

 structură rigidă şi rezistentă, previne explozia

protoplastului în medii hipotone – echilibrează
presiunea osmotică intracelulară (5-20 atm);
 conferă forma stabilă caracteristică: coci, bacili,
cocobacili, spirili, spirochete;
participă la diviziunea celulară;
reprezintă ţinta de acţiune pentru lizozim şi
unele antibiotice.
 Interes medical
• sensibilitatea la lizozim;
• este ţinta unor antibiotice active asupra
peretelui bacterian (e.g. penicilinele);
• are proprietăţi antigenice şi de adjuvant
imunologic.
Forma bacteriilor
 Structuri speciale ale peretelui la
bacterii gram-pozitive
• acizi teichoici (legaţi de peptidoglican) şi
lipoteichoici (legaţi de membrana citoplasmatică)

• polizaharide neutre (e.g. antigenele Lancefield la

streptococi)

• proteine de suprafaţă cu funcţie de

- adezine (implicate în ataşare) sau cu
- efect antifagocitar (proteina M, proteina A, proteine de
legare la fibronectină etc )
 Structuri speciale ale peretelui la
bacterii gram-pozitive
• acizi teichoici (legaţi de peptidoglican) şi lipoteicoici
(legaţi de membrana citoplasmatică)
– apar ca structuri fibrilare pe suprafaţa celulei
– au următoarele funţii:
• Ag de specificitate;
• leagă ioni de Mg şi enzime autolitice;
• se ataşează de suprafaţa celulelor eucariote (factori de
ataşare/colonizare);
• se leagă de receptori de pe suprafaţa macrofagelor, cu
eliberare de citokine proinflamatorii;
• prezintă receptori pentru bacteriofagi (virusuri ale bacteriilor)
sau bacteriocine (antibiotice produse de bacterii);
Structuri speciale ale peretelui la bacterii
gram-negativ
• membrana externă reprezentată de
- 2 straturi asimetrice din fosfolipide;
- stratul extern care include LPS (lipopolizaharidul),
moleculă complexă cu trei regiuni:
• lipidul A (endotoxina);
• core (miez) sau Ag R, de natură polizaharidică;
• Ag O, cu specificitate de grup, format din unităţi
oligozaharidice repetate;
- lipoproteine care leagă membrana externă de
peptidoglican;
Structuri speciale ale peretelui la bacterii
gram-negativ
- porine, molecule proteice în triplet, care
formează pori pentru pasajul unor molecule
hidrofile;
- proteine cu rol în transportul specific al unor
molecule (vit. B12, aa, nucleozide);
- proteine receptor pentru complexul “Fe-
siderofor”, pentru bacteriofagi sau bacteriocine;
- proteine cu rol în patogenitate (adezine sau cu
efect antifagocitar).
 Membrana externă
* Membrana externă opreşte accesul spre protoplast
a unor substanţe cu greutate moleculară mare şi a
unor molecule hidrofobe potenţial nocive.

* In consecinţă, bacteriile gram-negative sunt

mai rezistente decât cele gram-pozitive la
dezinfectante, antiseptice, antibiotice.
 Spaţiul periplasmic

• situat între membrana externă şi membrana

citoplasmatică;
• conţine peptidoglican, lipoproteine, proteine de
transport şi enzime degradative (hidrolaze, enzime de
degradare a unor antibiotice);
• enzimele stocate în spaţiul periplasmic sunt
eliberate după necesităţi in mediul extracelular, spre
deosebire de bacteriile gram-pozitive care le
eliberează imediat după ce au fost sintetizate.
 Structuri speciale ale peretelui la bacterii
a.a.r.

• arabinogalactan, polizaharid cu unele proprietăţi ale endotoxinei;

• acizi micolici – acizi graşi cu catene lungă (C70-C90)
• Complexul arabinogalactan – acizi micolici conferă:
- comportarea particulară în coloraţia Ziehl-Neelsen ;
- rezistenţa la factori de mediu (desicaţie, dezinfectante, antibiotice) ;
• lipide de suprafaţă (sulfolipide, fosfolipide, cord factor), cu rol in
patogenitate; complexul lipoarabinoglican si fosfilipide, induce reacţia
patogenitate; complexul lipoarabinoglican si fosfilipide, induce reacţia
tisulară caracteristiă (formarea de granuloame, metaplazierea macrofagelor
în celule gigante (celule Langhans) şi celule epitelioide)
• micozide (sunt peptidoglicolipide, glicolipide), formează la exterior un
înveliş, care contribuie la supravieţuirea in celule fagocitare (rezistent la
enzimele lizozomale din fagolizozomul macrofagelor) – sunt bacterii
facultativ intracelulare.
 Bacterii cu perete modificat

• protoplaşti (la bacterii gram-pozitive ) şi sferoplaşti (la bacterii

gram-negative);
- apar sub efectul unor agenţi inhibitori ai peptidoglicanului (lizozim,
antibiotice);
- pot supravieţui în medii hipertone, pot fi metabolic active dar nu pot să
se multiplice;
- sferoplaştii, în absenţa agentului inductor, pot reveni la forma de
origine.
• forme L
- apar spontan sau sub efectul unor agenţi inductori (şoc osmotic sau
termic, antibiotice);
- pot să se multiplice (mai lent), dând colonii cu aspect particular ( aspect
de “ou prăjit”);
- pot fi reversibile sau stabile.
 Consecinţe
Este posibil ca în medulara renală, sub efectul
unor antibiotice beta-lactamice să apară sferoplaşti
care pot explica recăderi ale infecţiei renale după
întreruperea antibioterapiei.
 Glicocalix
• a treia structură de înveliş, constiuită din polizaharide ( la
Bacillus anthracis structură polipeptidică);
• se prezintă sub două forme:
- capsula (glicocalix dens: nu poate fi separat prin centrifugare, nu
este penetrat de coloranţi, deci este vizibil doar in coloraţii negative cu
tuş de India sau nigrizină)
- glicocalix lax (slime: poate fi separat prin centrifugare, este
penetrat de particule colorate – vizibil in ME, după coloraţii speciale –
roşu ruteniu)
• funcţii:
- conferă rezistenţă la fagocitoză şi agenţi chimici
(antibiotice);
- ligant la receptorii de pe suprafaţa celulelor eucariote sau
suprafeţe inerte;
Ag de specificitate (Ag K).
 Structura celulei bacteriene

- Structuri constante
• material nuclear sau nucleoid
• citoplasmă
• membrană citoplasmatică
• perete celular
- Structuri facultative
• glicocalix
• flageli
• pili comuni (fimbrii) şi pili comuni
• endospor
 Flageli
• structuri filamentoase lungi şi subţiri, de natură proteică
(flagelina);
• constituiţi din filament flagelar flexuos, articulat printr-un croşet
la corpusculul/complexul bazal - cilindru axial asociat cu unul
sau două perechi de inele (la gram-pozitivi: inelul M si S,
respectiv gram-negativi: inelele M si S, la care se adaugă P şi L);
M- flotant in ME, S – supramembranar; P – în stratul de
peptidoglican; L – flotant în ME

• numărul şi dispoziţia flagelilor reprezintă un caracter

taxonomic;
• conferă mobilitate bacteriilor (bacili, vibrioni, spirili,
spirochete);
• prezintă Ag cu specificitate de tip (Ag H).
FLAGELI (ME)
 Structura celulei bacteriene

- Structuri constante
• material nuclear sau nucleoid
• citoplasmă
• membrană citoplasmatică
• perete celular
- Structuri facultative
• glicocalix
• flageli
• pili comuni (fimbrii) şi pili sexuali
• endospor
 Fimbrii (pili comuni)
• structuri fibrilare , mai scurte decât flagelii,
prezenţi pe toată suprafaţa unor bacterii
gram-negative;
• constituite din subunităţi proteice (pilina);
• aderă la receptori specifici celulari
(importanţi factori de colonizare);
• pot funcţiona ca Ag specifice.
 Pili sexuali

• structuri fibrilare în număr mai redus, mai lungi

decât flagelii, cu extremitatea liberă butonată;
• au rol în transferul ADN prin conjugare.
 Structura celulei bacteriene

- Structuri constante
• material nuclear sau nucleoid
• citoplasmă
• membrană citoplasmatică
• perete celular
- Structuri facultative
• glicocalix
• flageli
• pili comuni (fimbrii) şi pili sexuali
• endospor
 Endospor

• celulă bacteriană inactivă metabolic, cu citoplasma

deshidratată, protejată de structuri de suprafaţă
suplimentare (cortex, tunică, exosporium);
• protoplastul deshidratat conţine cantităţi mari de
dipicolinat de Ca (conferă termorezistenţa);
• sporul este deosebit de rezistent la factori de mediu
(agenţi fizici şi chimici);
• prezenţa, forma şi dispoziţia sporului constituie
criteriu taxonomic;
• poate germina în condiţii favorabile de mediu,
generând bacteria de origine.
 Sporularea versus germinarea
• Sporularea -transformarea bacteriei în
spor – în stare deshidratată, supravieţuire
îndelungată.
• Condiţii favorabile – germinarea: este
activată o autolizină a cortexului; apa şi
nutrienţii difuzează spre protoplast –
rehidratare – ruperea învelişurilor sporale
– eliberarea bacteriei sub formă
vegetativă.