Sunteți pe pagina 1din 32

Introducere

Termeni şi abrevieri

I. Clonarea – Trecut, prezent si viitor

II. Strategii de clonare

II.1. Clonarea unei gene utilizând vectori

i. Enzimele utilizate în clonare

ii. Biologia vectorilor

1. Plasmide

2. Bacteriofagi

3. Obţinerea vectorilor recombinanţi

iii. Obţinerea de ADNc prin revers-transcripţie

II.2. Reacţia de polimerizare în lanţ

III. Bibliotecile de gene

III.1. Construirea bibliotecilor genomice

III.2. Construirea bibliotecilor de ADN complementar

III.3. Identificarea unei gene

Concluzii

Bibliografie
Introducere

Pănă în 1970, genele erau entităţi materiale inaccesibile analizei directe din cauza dimensiunlior foarte
mici şi imposibilităţii obţinerii unei cantităţi suficiente de material pentru studiu. În acel an s-au descoperit
enzimele de restricţie şi la foarte scurt timp au fost introduse si noi tehnologii de studiu ADN, care au făcut
posibilă selecţionarea, izolarea şi combinarea moleculelor de ADN de la diferite specii, precum şi clonarea
genelor.

Termenul de ADN recombinant se referă la combinaţiile noi de ADN obţinute între anumite secvneţe
ADN uman (sau de la alte oirganisme) şi molecule de ADN bacterian, capabile să se replice indefinit (formând
clone moleculare) sau să exprime, într-o celulă gazdă, informaţia genetică pe care o conţin (Covic, 2004).

Tehnicile de ADN recombinant au inaugurat "era ingineriei moleculare" care schimbă statutul
geneticienilor, transformându-i din observatori în "manipulatori" de gene. Punerea la punct a clonării genelor a
permis descifrarea structurii şi funcţiei genelor şi aplicarea noilor cunoştinţe în medicină (pentru depistarea,
diagnosticul şi tratamentul bolilor), industria farmaceutică (obţinerea de proteine terapeutice şi vaccinuri),
agricultură şi zootehnie.

Cu toate că pronunţarea cuvântului "clonare" stârneşte o reacţie cu încărcătura emoţională, conceptul


este unul neaşteptat de familiar pentru multi oameni. De exemplu, orice persoană pasionată de grădinărit ştie
că este posibil să înmulţeşti plantele utilizând segmente din acestea şi că astfel se vor obţine plante identice cu
cea din care provin segmentele. Acestea sunt clone. Acelaşi lucru se întamplă şi în procedura de purificare a
unei tulpini bacteriene, atunci când dintr-o colonie purificată se inoculează mai multe culturi proaspete.
Procedura de clonare, aplicată genelor permite secvenţializarea materialului genetic, studierea expresiei
genice, exprimarea informaţiei în proteine, inducerea de mutaţii pentru observarea diferenţelor în proprietăţile
genei, obţinerea plantelor şi animalelor transgenice, obţinerea de medicamente noi şi elaborarea de proceduri
de tratament noi şi eficiente.

Când oamenii de ştiinţă au descoperit anestezia, energia atomică şi ADN recombinant, nu s-a ştiut
dacă aceste descoperiri vor fi utilizate doar în beneficiul omenirii. Pe lângă aportul adus în aprofundarea
cunoştinţelor de biologie moleculară, în înţelegerea mecanismelor de declanşare şi dezvoltare a cancerului, cât
şi a procesului de îmbătrânire, clonarea a fost utilizată pentru îmbunătăţirea medicinii şi agriculturii dar rămâne
la latitudinea societăţii să aleagă care dintre aplicaţiile acesteia sunt etice şi care nu.

Pagina 3 din 32
Termeni şi abrevieri

ADNc - ADN complementar


ARNm – ARN mesager
dNTP- deoxiribonucleotidtrifosfat
PCR – reactia de polimerizare in lanţ

amp
R - rezistentă la ampicilină

EK – eucariote
PK – procariote
RT-PCR – reacţia de polimerizare în lanţ în timp real
bp – perechi de baze
I. Clonarea – Trecut, prezent şi viitor

Primele legi ale eredităţii au fost descoperite în a doua jumătate a secolului al XIX-lea de Gregor Mendel,
considerat a fi unul din fondatorii geneticii ca ştiinţă. Pe baza unor experiente de hibridare efectuate timp de
mai multi ani, el îşi elaborează propria teorie asupra existenţei factorilor ereditari, care ulterior au fost numiţi
gene şi descoperă primele legi ale ereditatii. Acestea sunt Legea purităţii gameţilor şi Legea segregării
independente a perechilor de caractere.
Cu numai 4 ani mai tarziu, în 1869, biologul suedez Friedrich Miescher a identificat şi izolat o nouă
substanţă existentă în nucleul unor anumite celule, despre care însă nu credea ca ar fi implicată în ereditate.
În anul 1880, Wilhelm Roux şi August Weismann, în mod independent, propuneau teoria plasmei
germinative. Ei care considerau că imediat ce zigotul începe să se divida are loc o separare a germenului sau
a plasmei germinative de somă sau de corp. Transmiterea ereditara a caracterelor se realizează exclusiv de
către plasma germinativă, care are o structură discontinuă, fiind alcatuită din "determinanţi". Aceştia sunt
înzestraţi cu capacitatea de a transmite caracterele organismelor de la o generaţie la alta. Deşi teoriile
corpusculare au caracter speculativ, deoarece corpusculii ereditari erau ipotetici, un aspect pozitiv al acestor
teorii îl constituie încercarea de a găsi un suport material eredităţii.
În 1888, Wilhelm Roux face primul experiment pentru teoria plasmei germinative: distrugerea cu un ac
fierbinte a unei celule dintr-un embrion binucleat de broască cu obţinerea dezvoltării unei jumătăţi de embrion
şi susţinând astfel, în mod eronat, teoria plasmei germinative.
În 1894, Hans Dreisch izolează blastomere de 2 şi 4 celule din embrioni de arici de mare şi observă
dezvoltarea blastomerelor în larve mici dar complete. Rezultatul experimentului contrazice teoria plasmei
germinative.
În anul 1901, Hans Spemann reuşeşte scindarea unui embrion binucleat de salamandră cu obţinerea a
două larve.
În anul 1914, Hans Spemann realizează transfer nuclear.
Între 1940-1950, embrioni ai diferitelor specii de mamifere sunt clonaţi prin scindarea embrionului, dar
succesul este limitat la stadiile anterioare implatării în uter.
În 1952, Robert Briggs şi Thomas J.King realizează transferal unui nucleu provenind dintr-o celula
somatică a unui embrion de broască într-un oocit nefertilizat cu obţinerea de mrmoloci şi broaşte tinere.
Tehnica aplivată de cei doi, transferal nuclear, devine prototipul experimental pentru clonarea organismelor
multicelulare.

Pagina 5 din 32
Între anii 1961 şi 1962, John B. Gurdon şi Robert G. McKinnell, folosind tehnica transefrului nuclear la
diferite specii de broască, obţin adulţi cu capacitate normal de reproducere, demonstrând astfel totipotenţa
nucleilor embrionari.
Între anii 1962 şi 1965, Robert G. McKinnell, Thomas J. King şi Marie A. Di Berardino obţin larve mobile
din oocite anucleate înjectate cu nuclei provenind din celule canceroase de la nivelul rinichilor de broască
adultă. Acest experiment arată că unele celule cancerigene pot fi controlate de procesul de diferentiere şi,
astfel, inducerea diferenţierii celulare poate opri avansarea cancerului.
În anii ’70 se obţin mormoloci, prin transfer de nuclei provenind din celule diferenţiate din tegument şi
limfocite.
În 1986, Steen Willadsen clonează miei prin fuziunea nucleilor proveniţi de la embrioni de 8 celule cu ovul
anucleat, utilizând un impuls electric. Alti cercetători obţin oi, porci, capre, soareci folosind aceeaşi procedură,
atâta timp cat extracţia nucleilor din blastomere se facea anterior implantării embrionului.
În 1997, obţinerea primului mamifer, oiţa Dolly, dintr-o celulă adultă.
Dacă până în 1970, genele erau entităţi material inaccesibile analizei directe din cauza dimensiunilor foarte
mici şi imposibilităţii obţinerii unei cantităţi suficiente de material pentru studio, după descoperirea enzimelelor
de restricţie, veritabile “bisturie” genetice, a devenit posibilă secţionarea ADN şi izolarea genelor. Aproape
concomitent, au fost introduse alte noi tehnologii de studiu ADN, care au făcut posibilă combinarea moleculelor
de ADN de la diferite specii, precum şi clonarea genelor. Clonarea se referă la multiplicarea unui element
iniţial, fie el un organism, fie doar anumite fragmente de material genetic.
Când oamenii de ştiinţă au descoperit anestezia, energia atomică şi ADN recombinant, nu s-a ştiut dacă
aceste descoperiri vor fi utilizate doar în beneficiul omenirii. Pe lângă aportul adus în aprofundarea
cunoştinţelor de biologie moleculară, în înţelegerea mecanismelor de declanşare şi dezvoltare a cancerului, cât
şi a procesului de îmbătrânire, clonarea a fost utilizată pentru îmbunătăţirea medicinii şi agriculturii dar rămâne
la latitudinea societăţii să aleagă care dintre aplicaţiile acesteia sunt etice şi care nu.
II. Strategii de clonare

Clonarea (gr. Klon- ramură mică) reprezintă introducerea unei molecule ADN străine într-o celulă aflată în
replicare pentru amplificarea acelui fragment ADN (Mohan, Ardelean, 2004).
A clona înseamnă a face copii identice; în trecut, termenul desemna numai procedura de izolare a unei
celule dintr-o populaţie mai mare de celule, care apoi se multiplică pentru a genera multe celule identice. Prin
analogie, clonarea ADN implică separarea unei gene specifice sau a unui segment de ADN din cromozom,
ataşarea ei la o moleculă mică de ADN numit purtător şi apoi replicarea acestui ADN modificat de mii sau
milioane de ori. Rezultatul este o amplificare selectivă a acelei gene sau a segmentului de ADN.
Clonarea unei gene se referă la fenomenul de obţinere a numeroase copii ale unei gene.
Procedura simplă de clonare este cea în care se cunoaşte exact ce se clonează şi este situaţia
substrategiilor de clonaj, când un fragment este izolat dintr-un vector de clonare şi introdus într-un alt vector.
În cazul în care fragmentul de ADN este reprezentat de o genă provenind din genomul uman, situaţia se
complică deoarece fragmentul de ADN ţintă este însoţit de un număr mare de secvenţe nedorite. Astfel, pentru
izolarea secvenţelor de ADN din surse complexe se va utiliza una din cele două strategii majore de clonare:
a) Prima strategie presupune obţinerea ADN-ului sursă, fragmentarea acestuia şi clonarea tuturor
segmentelor obţinute. Astfel se obţine o colecţie de de clone care poartă numele de bibliotecă sau bancă de
gene. Următoarea etapă a acestei strategii de clonaj este reprezentată de trierea clonelor obţinute pentru
depistarea fragmentului ADN de interes.
b) Cea de-a doua strategie de clonare presupune obţinerea fragmentului ADN de interes si clonarea
acestuia utilizând reacţia de polimerizare în lanţ.
Metodologiile folosite pentru a realiza aceste etape şi altele similare sunt denumite colectiv “tehnologia
ADN recombinat” sau “clonare moleculară”, “clonarea genelor”, “clonarea ADN”.

II.1. Clonarea unei gene utilizând vectori


Ideea principală în clonarea moleculară este de a insera un fragment de ADN care va efectua în mod
autonom reproducerea fragmentului de ADN inserat şi care se va numi vehicul sau vector de clonare. Clonarea
unui asemenea “vector himeric” într-un organism gazdă adecvat cum ar fi bacteria Escherichia coli sau drojdii,
are ca rezultat producerea unor cantităţi mari din segmentul de ADN care a fost inserat. Dacă gena clonată
este flancată, însoţită de secvenţe de control bine precizate şi specifice, atunci gazda poate produce cantităţi
mari de ARN mesager şi proteina specificată de acea genă.
Clonarea unui segment de ADN implică cinci etape (Fig.1) şi metode generale.

Pagina 7 din 32
1) Prima etapă presupune utilizarea unei metode de clivare a ADN într-o poziţie specifică utilizându-se
endonucleazele de restrictie. Clivarea în locuri specifice a moleculei de ADN este un proces extrem de
important deoarece este necesar cel puţin în două faze ale clonării moleculare:
- pentru izolarea fragmentelor de ADN ce reprezintă gene de interes (clivarea ADN donor);
- pentru pregătirea vectorului de clonare pentru a primi gena de interes (ADN vector).
2) A doua etapă presupune folosirea unei metode de a lega covalent două fragmente de ADN; aceasta
este realizată de enzime numite ADN ligaze.
3) A treia etapă presupune selecţionarea unei molecule mici de ADN capabilă de autoreplicare (numită
vector de clonare). Segmentul de ADN de clonat se leagă de vectorul de clonare rezultând o moleculă de ADN
numit ADN recombinat, ce conţine segmente de ADN legate covalent provenind din diverse surse.
4) A patra etapă cuprinde o metodă de a muta ADN recombinat din eprubetă într-o celulă gazdă care
poate furniza complexul enzimatic necesar pentru replicarea ADN recombinat.
5) În a cincea etapă se folosesc metode de a selecţiona sau identifica celulele gazdă ce conţin ADN
recombinat din totalul de celule gazdă.

Figura 1 Clonarea genelor


II.1.i. Enzimele utilizate în clonare
O etapă cheie în desfăşurarea experimentului de clonare îl reprezintă inserarea ADN-ului de interes în
vectorul de clonare. Clonarea unui anumit fragment de ADN presupune identificarea şi obţinerea sa în stare
pură din genomul unei celule. Această operaţie este practicabilă numai pentru genomul de mici dimensiuni.
ADN donor al genei de interes ca şi ADN vector, este clivat astfel încât să se poată forma extremităţi
monocatenare omoloage, având posibilitatea de a realiza o sinapsă moleculară.
Decisivă pentru îndeplinirea acestei necesităţi a fost descoperirea enzimelor de restricţie. Aceste
endonucleaze recunosc în molecula de ADN o secvenţă anumită de baze şi clivează câte o legătură fosfat
diesterică de pe ambele catene, într-un loc particular al secvenţei recunoscute. Endonucleazele de restricţie se
găsesc într-un număr mare de specii bacteriene.
În anii '60, Werner Arber a descoperit că funcţia biologică a endonucleazelor de restricţie este de a
recunoaşte şi de a scinda un ADN străin (de exemplu ADN al unui virus infectant); acest ADN se spune că este
“restrâns”. ADN propriu al celulei nu este clivat în mod obişnuit pentru că secvenţa recunoscută de
endonucleaza de restricţie este metilată de o enzimă, ADN metilază specifică, fiind astfel protejată. În celula
bacteriană endonucleaza de restricţie şi ADN metilaza corespunzătoare este uneori asimilată cu sistemul de
restricţie – modificare.
Există trei tipuri de endonucleaze notat cu cifrele romane I, II şi III.
Endonucleazele de restricţie de tip I şi III sunt în general complexe mari cu mai multe subunităţi conţinând
ambele activităţi: de endonuclează şi de metilază. Tipul I de endonucleaze de restricţie scindează ADN în
poziţii aleatoare care pot fi la distanţă de 1000 de perechi de baze sau mai mult, de la secvenţa de
recunoaştere. Tipul III de endonucleaze de restricţie scindează ADN la distanţă de 25 de perechi de baze de la
secvenţa de recunoaştere. Amândouă tipurile se deplasează de-a lungul ADN printr-o reacţie care necesită
energie din molecule de ATP.
Endonucleazele de restricţie de tipul II izolate iniţial de Hamilton Smith sunt mai simple, nu au nevoie de
ATP şi scindează ADN chiar la nivelul ei de recunoaştere. Utilitatea extraordinară a enzimelor de restricţie de
tip II a fost pusă în evidenţă mai întâi de Daniel Nathans şi acestea sunt cel mai mult folosite în tehnologia ADN
recombinat. Sunt deci enzime cu ajutorul cărora se realizează scindarea exactă în locuri bine definite ale
moleculelor de ADN bicatenare. Ele sunt instrumentele indispensabile atât pentru excizarea fragmentelor de
ADN (gene) din diferite molecule de ADN viral, bacterian sau din celule eucariote, cât şi pentru conversia
moleculelor circulare ale vectorilor în molecule liniare. Fără ele nu se pot executa operaţiuni de fragmentare şi
modelare a diferitelor molecule de ADN. Sunt numite şi “bisturie moleculare”. În diferite specii bacteriene au
fost descoperite peste 800 de endonucleaze de restricţie. Peste 100 de secvenţe specifice diferite sunt
recunoscutede una sau mai multe din aceste enzime. Aceste secvenţe sunt aproape întotdeauna scurte (4-6

Pagina 9 din 32
perechi de baze, ocazional mai multe) şi palindromice. Un palindrom este definit ca un fragment de ADN în
care secvenţa nucleotidică, citită pe ambele catene în direcţia 5’ - 3’ este identică (conţin repetiţii inversate a
unor perechi de baze).
În Tabelul nr. 1 sunt prezentate cele mai uzuale endonucleaze de restricţie folosite în tehnologia ADN
recombinat. Numele fiecărei enzime este constituit din abrevierea a trei litere din denumirea speciei bacteriene
de la care derivă (ex: Bam de la Bacillus amyloliquefaciens; Eco de la Escherichia Coli)
Astfel, enzima de restricţie Eco R-I, izolată din Escherichia coli, recunoaşte secvenţa palindromică 5’ GAATTC
3’ şi taie între G şi A. Secvenţa de pe cealaltă catenă 5’ CTTAAG 3’ va fi tăiată tot între G şi A. Evident, rezultă
fragmente de ADN cu capete monocatenare complementare.
Table 1 Enzimele folosite în tehnologie ADN recombinant

Enzima Funcţia (Activitatea)


Endonucleaze de restricţie de tip II Scindează ADN în secvenţe ce conţin baze
specifice
ADN-ligaze Leagă două molecule de ADN sau două
fragmentede ADN
ADN-polimeraza I (E.coli) Foloseşte în procesul de replicare
semiconservativă a ADN
Revers transcriptaza Article I. Face ADN copii pe matriţă
de ARN
Polinucleotid kinaza Fosforilează unele lanţuri polinucleotidice
Transferaza terminală Transferă un homopolimer la gruparea 3’-OH finală
din structura duplexului liniar
Exonucleaza III Mută nucleotide reziduale din poziţia
Bacteriofag  exonucleaza Mută nucleotide din poziţia 5’ terminală a ADN
bicatenar eliberând catena la poziţia 3’ finală
Fosfataza alcalină Mută fosfatul terminal din fiecare capăt 5’ sau 3’
terminal din amândouă

Pentru a realiza această clivare se formează mai întâi un complex enzimă substrat între enzima de
restricţie Eco R-I cu structură de dimer şi substratul ei – un fragment de ADN. Complexul activ enzimă-substrat
se realizează prin formarea a 12 legături de hidrogen între bazele purinice ale ADN dintr-o anumită secvenţă
bine determinată şi şase resturi de aminoacizi din structura dimerică a enzimei (un rest de glutamină şi două
de arginină în fiecare subunitate a dimerului) .
Figura 2 Structura palindromului recunoscut de enzima EcoRI

Unele endonucleaze de restricţie scindează ambele catene de ADN, astfel încât nu rămâne nici o baze
nepereche la fiecare capăt ; aceste capete sunt numite “capete rotunjite”.
Alte endonucleaze de restricţie scindează neregulat, decalat cele două catene de ADN, astfel încât rămân
două până la patru nucleotide neîmperecheate la fiecare capăt al catenelor. Acestea sunt numite capete
coezive sau adezive (conţinând nucleotide complementare ) şi deci se pot împerechea între ele sau cu alte
capete adezive complementare ale unor alte fragmente de ADN.
Mărimea medie a fragmentelor de ADN produse prin clivarea ADN genomic cu endonucleaze de restricţie
depinde de frecvenţa cu care apare un anumit situs de restricţie într-o moleculă de ADN mai mare; această
frecvenţă depinde la rândul ei de mărimea secvenţei de recunoaştere. Dacă pe o moleculă de ADN există mai
multe situsuri de recunoaştere pentru o restrictază, aceasta va genera mai multe fragmente de ADN. Cu cât
secvenţa recunoscută de enzima de restricţie este mai lungă, cu atât fragmentele de ADN obţinute sunt mai
lungi. Într-o moleculă de ADN aleatoare în care cele 4 perechi de baze sunt la fel de frecvente, o secvenţă de 6
perechi de baze recunoscută de o endonuclează de restricţie ca BamH I va apare în medie odată la 46 perechi
de bază, adică după 4096 de perechi de baze. Enzima Eco R-I care recunoaşte o secvenţă de 6 perechi de
baze taie fragmente cuprinse între 10-20 000 perechi de bază care pot să corespundă la una sau mai multe
gene. Enzimele de restricţie care recunosc secvenţe de 4 perechi de baze pot produce segmente mai scurte,
adică 44 perechi de baze (256 perechi de baze). În realitate, aceste secvenţe de recunoaştere sunt mai rare
decât au fost prezentate mai sus, deoarece secvenţele de nucleotide în ADN nu sunt aleatoare şi cele 4
perechi de baze nu sunt la fel de frecvente. Dimensiunea medie a fragmentelor produse prin scindarea de
către endonucleaze de restricţie a unui ADN mare poate fi mărită prin simpla împiedicare a reacţiei să fie
completă. O astfel de reacţie incompletă este numită deseori digestie partial.
Odată ce o moleculă de ADN a fost tăiată în fragmente, fragmentul specific care îl interesează pe
cercetător poate fi separat de celelalte fragmente prin electroforeză în gel de agaroză sau HPLC. În cazul unui
genom tipic de mamifer, scindarea ADN poate conduce la câteva sute de mii de fragmente diferite. În acest

Pagina 11 din 32
caz izolarea unui fragment specific de ADN prin electroforeză sau HPLC nu este practică. Apare astfel
necesitatea construirii unei biblioteci de ADN, ca o etapă intermediară în clonarea unei gene specific.

ADN ligazele
După izolarea fragmentului ţintă de ADN, acesta este inserat într-un vehicul de clonare folosind ADN
ligazele. Reacţia de legare este mult facilitată de prezenţa capetelor adezive complementare care se leagă
între ele. Eficienţa procesului de legare este influenţată de tipul endonucleazelor folosite pentru a genera
fragmente de ADN, deoarece endonucleaze diferite conduc la capete adezive diferite. În general, un fragment
generat de Eco RI nu va fi legat de un fragment generat de BamHI.
Înainte de legarea a două fragmente de ADN este deseori util de a adăuga la joncţiune secvenţa de
recunoaştere pentru o altă endonuclează pentru a permite tăierea ADN legat, în acelaşi loc, mai târziu.
Aceasta se face prin inserarea unui fragment ADN sintetic ce conţine secvenţa de recunoaştere cerută între
două fragmente de ADN. Acest fragment de ADN sintetic este numit în general linker. Un fragment sintetic ce
conţine secvenţa de recunoaştere pentru mai multe endonucleaze este numit polylinker.

Figura 3 Utilizarea polilinker în clonarea ADN

Importanţa capetelor adezive în unirea eficace a două fragmente de ADN în maniera dorita a fost pusă în
evidenţă de la primele experimente făcute cu ADN recombinat. Înainte ca endonucleazele să fie accesibile pe
scară largă, unii cercetători au descoperit că puteau genera capete adezive prin acţiunea combinată a unor
exonucleaze din bacteriofagul şi a unei transferaze terminale. Fragmentelor de unire li se puneau cozi
homopolimerice complementare. Astfel de metode sau similare au fost utilizate în crearea primelor molecule de
ADN recombinat conţinând segmente de ADN provenite de la specii diferite.
II.1.ii. Biologia plasmidelor şi vectorilor

Pentru îndeplinirea funcţiei de vector, o moleculă de ADN trebuie să îndeplinească anumite criterii. Cea
mai importată prorietate a acesteia este capacitatea moleculei ce va deveni vector de a se multiplica în
organismul celulei-gazde, astfel încât molecula de ADN recombinant să fie transmisă celulelor-fiice. Deoarece
moleculele de ADN de dimensiuni mari au tendinţa de a se fragmenta în timpul purificării, devenind astfel dificil
de manipulat, un vector de clonare trebuie să fie relativ mic, sub 10kb. Două tipuri de molecule de ADN ce
îndeplinesc aceste două criterii se găsesc în celulele bacteriene: plasmide şi cromosomi bacteriofagi.

II.1.ii.1 Plasmidele

Plasmidul (gr. Plasma – formaţiune) este o structură prezentă în celulă, alcătuită din ADN care poate să
existe şi să se replice independent de cromosomi (Fig.4.). În cazul bacteriilor, plasmidele conţin informaţia
genetică pentru unele activităţi celulare, cum ar fi rezistenţa la antibiotice (Mohan, Ardelean, 2004). Cele mai
multe plasmide conţin cel puţin o secvenţă ADN care poate acţiona ca origine de replicare, astfel asigurându-şi
independenţa replicării în cadrul celulei.

Figura 4 Plasmide (1612)

Plasmidele mai mici utilizează enzimele de replicare ale ADN-ului celulei-gazdă pentru propria
replicare, în timp ce plasmidele de dimensiuni mai mari conţin gene ce coifică enzyme special pentru replicarea
plamidelor. O altă categorie de plasmide prezintă capacitatea de a se insera în ADN-ul celulei gazdă, fiind
astfel replicat o data cu diviziunea celulei.

Dimensiuni si număr
Dimensiunile plasmidelor se află în intervalul 10- 250kb. Numărul plasmidelor se referă la numărul
moleculelor ADN independente dintr-o singură celulă bacteriană. Plasmidele de dimensiuni mai mari se găsesc
într-un număr mic în celule, pot fi şi numai două (plasmide low-copy), in timp ce plasmidele relaxate pot fi
prezente în număr de 50 copii/celulă sau chiar mai mult (plasmide high-copy).

Pagina 13 din 32
Clasificarea plasmidelor
Plasmidele pot fi clasificate în funcţie de diverse criterii:

a) Criteriul autotransferabilităţii. Autotransferabilitatea reprezintă capacitatea unui element genetic de


a se autotransfera de la un individ bacterial la altul. De regukă, genele implicate sunt grupate într-
un operon (operon tra) iar elemental genetic purtător este denumit conjugon. Conform acestui
criteriu, se cunosc 3 clase de plasmide:
i. Plasmide conjugative – plamside care prezintă întreg operonul tra şi sunt
autotransferabile, putând genera process de conjugare bacteriană.
ii. Plasmide non-conjugative – sunt plasmidele ce nu prezintă operon tra nu sunt
autotransferabile şi nici mobilizabile.
iii. Plasmide mobilizabile – sunt plamsidele ce nu prezintă operonul tra dar au gene
mob care le permit mobilizarea în evenimente de conjugare initiate de alte
plasmide ce sunt conjugative.
b) Criteriul structurii moleculare. Marea majoritatea a plsmidelor sunt formate din ADN dublu catenar.
Clasificarea plasmidelor după acest criteriu se face astfel:
i. Plasmide circulare – alcătuite din ADN dublu catenar circular, iar în forma in vivo
pare să fie CCC (circular covalently closed). Se mai întâlnesc şi formele CO
(circular open) şi concatemeri.
ii. Plasmide liniare – alcătuite din ADN dublu catenar linear şi pot fi plasmide lineare
cu telomere hairpin (ex. Borrelia) şi plamside cu telomere invertroni (ex.
Streptomyces)
c) Criteriul incompatibilităţii plasmidiale. Într-o celulă pot fi întalnite câteva tipuri de plasmide, chiar şi
câteva tipuri de plasmide conjugative. Se cunoaşte faptul că la E.coli pot coexista până la şapte
tipuri de plasmide în acelaşi timp, de aceea este foarte important ca aceste plasmide să fie
compatibile. În cazul apariţiei incompatibilităţii, unul din cele două tipuri de plasmide va fi exclus
din celulă. Mecanismul stabilirii incompatibilităţii plasmidelor nu este bine cunoscut.
d) Criteriul genelor codificate. În funcţie de genele pe care le poosedă, plasmidele pot fi:
i. Plasmide F - plasmide ce contin operonul tra si nu au altă activitate decât
declanşarea conjugării.
ii. Plasmide R – plasmide ce conţin gene ce oferă rezistenţa celulei bacteriene la
una sau mai multe substanţe antibiotic
iii. Plasmide Col – plasmide ce conţin gene pentru codificarea proteinelor (colicine)
ce au capacitatea de a distruge alte bacterii (ex. ColE1 la E.coli)
iv. Plasmide catabolice - plasmide ce conţin gene pentru codificarea capacităţii de
metabolizarea a unor molecule cu ar fi acidul salicylic sau toluenul.
v. Plasmide de patogenitate şi virulenţă - conferă patogenitate celulei-gazdă.

Chiar dacă plasmidele sunt răspândite la bacterii, ele nu sunt la fel de des întalnite la alte organisme.
Cel mai bine cunoscut plasmid de la eucariote are 2µn şi apare la diferite subspecii de Saccharomyces
cerevisae iar descoperirea lui a dus la construirea vectorilor de clonare penru acest organism atât de important
pentru industrie.
II.1.ii.2. Bacteriofagi

Bacteriofagii (gr.bakterios – bastonaş, phagein – a mânca) , cunoscuţi şi sub denumirea de fagi, sunt
virusuri care pătrund şi se multiplică în celula bacteriană. Un fag anume este specific pentru un anumit gen,
families au tulpină bacteriană, specificitate data de prezenţa sau absenţa receptorilor pe membrane celulei-
gazdă. Structura fagilor este foarte simplă, constând într-o molecula de ADN (ocazional si ARN) ce conţine
genele, inclusiv pe cele codificatoare ale replicării fagului, protejată într-o capsidă de natură proteică. Unii fagi
pot conţine şi enzime ( lizozim, endolizină)

Figura 5 Tipuri de bacteriofagi: a) cap si coadă ( ex. B.λ) şi b) bacteriofag filamentos (Sursa: Brown, Gene cloning and DNA
analysis)

Infectarea celulei bacteriene poate fi litică (cu distrugerea celulei bacteriene la sfarsitul ciclului de
infectare) sau nelitică (celula infectată nu este distrusă pentru eliberarea fagilor). Etapele ciclului de infectare
sunt: adsorbţie, penetrare, expresia genomului viral, asamblarea fagilor şi eiberarea acestora (Fig.6). La unii
fagi, ciclul de infectare este foarte rapid, chiar 20 minute şi este întotdeauna litic.

Figura 6 Ciclul de infectare a celulei bacteriene

Bacteriofagul λ şi vectori derivaţi din fagul λ

Fagul I este un fag cu simetrie icosaedrică. Genomul fagic este format dintr-o moleculăde ADNdc lineară,
cu o lungime de 48kpb, prezentând capetele 5' monocatenare coezive. În timpul infecţiei fagice, în celula
bacteriană pătrunde numai numai genomul fagic care se circularizează la nivelul capetelor coezive sub

Pagina 15 din 32
acţiunea ADN ligazei gazdei bacteriene. Genomul fagului prezintă gene cu rol în replicare, recombinare şi
evoluţie litică/lizogenă

Aşa cum se cunoaşte, bacteriofagul are un genom reprezentat de o moleculă lineară λ de ADN dublu
catenar, ce conţine 48502 perechi de baze. La capetele acestei molecule lineare se găsesc secvenţe specifice,
complementare (coezive) de 12 nucleotide (situsul cos), care permit circularizarea ADN fagic în celulele
bacteriene infectate (tulpini de E.coli).

În forma sa naturală, fagul λ poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvenţe de ADN din genomul
gazdei în care s-a multiplicat (după ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea acestora fiind limitată
de capsida fagică. De asemenea, numărul mare de situsuri de recunoaştere pentru enzime de restricţie,
plasate la nivelul unor regiuni esenţiale pentru evoluţia litică a fagului limitează utilizarea sa ca vector
de clonare.

Cu toate acestea, pornindu-se de la genomul fagului λ, prin prelucrări "in vitro" au fost construiţi o serie
de vectori de clonare, încadraţi în două categorii: vectori de înlocuire şi vectori de inserţie. Pentru a se putea
obţine asemenea vectori, genomul fagului λ a fost modificat: au fost eliminate situsurile de restricţie din zonele
esenţiale, iar prin folosirea oligonucleotidelor sintetice, situsurile de restricţie au fost plasate în poziţiile cele mai
favorabile pentru clonare. Mai mult, ştiind că regiunea centrală a genomului viral (aproximativ o treime din
genom) nu este esenţială pentru evoluţia litică, ea poate fi ori eliminată complet, ori înlocuită cu ADN de
interes.

Alţi vectori utilizaţi în clonare sunt (Covic, 2004):

a) Cosmidele sunt vectori artificiali constrituiţi dintr-un plasmid clasic la care s-au adăugat secvenţe
cos ale fagului lambda, secvenţe care permit împachetarea unor segmente de ADN exogen mai
lungi decat în fagi. Comismidele funcţionează iniţial ca nişte fagi şi după infecţia bacteriei, aceşti
pseudofagi se recircularizează şi se replică ca un plasmid, dar mai lent, fiind şi mult mai mari.
Avantajul cosmidelor este că permit inserţia şi clonarea unor fragmente foarte lungi de ADN (până
la 50kb).

b) Cromosomii artificiali bacterieni (BACs) derivă din plasmidul de fertilitate din E.coli şi este capabil
să încorporeze fragmente de ADN de până la 300kp.

c) Cromosomii artificiali de levuri (YACs) sunt plasmide care posedă centromerul şi telomerele
originale şi care, o data introduse în levuri, se comportă ca şi cromosomii normali. Pot incorpora
fragmente foarte mari de ADN, de până la 1000 kb şi permit replicarea ADN la eucariote cu
secvenţe repetitive de ADN.

d) Alţi vectori: vectorii "navetă" pot introduce o secvenţă de ADN in celulele eucariote, care ulterior
va fi recuperată prin clonaj într-o bacterie; vectorii "de expresie" sunt vectori cărăra li s-a inserat,
în vecinătatea situsului de insertie a ADN exogen, semnalele necesare transcriptiei; vectori virali.
II.1.ii.3. Obţinerea vectorilor recombinanţi

Dacă scopul experimentului este reprezentat de clonarea unei gene de interes utilizând plasmide ca
vectori, primul pas constă în izolarea ADN cromozomial, utilizându-se enzime de restricţie şi cu obţinerea de
fragmente mici de ADN (Fig.7) . ADN-ul plasmidial suferă acelaşi proces, presentând acum două capete
“lipicioase” complementare pentru ADN-ul de interes. Secventele de ADN de interes şi cele de ADN plasmidial
sunt mixate şi incubate în condiţii special pentru ca, sub acţiunea ligazei, să se facă legătura între fragmentele
de ADN de origini diferite. Vectorul obţinut astfel poartă material genetic plasmidialdar si strain şi poartă
numele de vector recombinant.

Următoarea etapă constă în introducerea vectorului recombinant în celule ce au fost pregătite pentru a
devein permeabile pentru molecula de ADN. Procesul poartă numele de transformare.

Electrotransformarea a fost descoperită pe baza studiilor efectuate asupra celulelor animale (hematii)
supuse acţiunii câmpurilor electrice (Zimmermann, 1981-1986) şi se bazează pe fenomenul
electroporării. Procesul de electroporare constă în inducerea unei permeabilizări reversibile a celulelor
procariote sau eucariote, prin utilizarea unui camp electric. Astfel, atunci când o celulă este expusă
într-un câmp electric, componentele membranei devin polarizate iar membrana este traversată de un
potenţial electric. Dacă diferenţa de potenţial depăşeşte o valoare prag, membrana se "rupe" în anumite zone,
iar celula devine permeabilă pentru molecule exogene. Permeabilitatea indusă este reversibilă cu condiţia ca
mărimea sau durata aplicării câmpului electric să nu depăşească o valoare critică limită, pentru că altfel celula
este afectată ireversibil.

Microinjectarea este o metodă relansată în ultimii ani, după ce a fost iniţial utilizată în experimente în
anii ’40, prin folosirea unor micromanipulatoare noi. Primele rezultate semnificative de transfer de gene prin
utilizarea acestei tehnologii au fost obţinute abia prin anii ‘70, când s-a reuşit transplantarea unor nuclei din
celule diferenţiate de amfibieni în celule ou enucleate. De asemenea, în 1974 s-au obţinut şoareci transformaţi
(mozaicaţi) prin injectarea în celule embrionare a ADN viral de SV40 (Jaenisch şi Mintz, 1974).

Metoda biolistică constă în "bombardarea" celulelor ţintă cu particule acoperite cu ADN. Metoda a fost
elaborată de Klein şi colab. (1987) fiind aplicată, de obicei, celulelor vegetale intacte. Principul metodei este
următorul: ADN de interes este depus pe suprafaţa unor particule de tungsten sau aur (cu un diametru de
aproximativ 1μm), prin precipitare cu CaCl2,acestea constituind "gloanţele". Particulele astfel pregătite sunt
introduse într-un dispozitiv special, numit "puşcă".

În Figura 7, clonarea genei s-a realizat utilizând celule bacteriene cu sensibilitate la ampicilina şi
vectori recombinanţi provenind din plamide cu genă de rezistenţă la ampicilină. După transformare, celulele
bacteriene sunt introduce in medii de creştere ce conţin şi ampicină. Celulele bacteriene care au asimilat
materialul genetic al vectorului recombinant cor continua să se dividă şi vor duce la formarea unei colonii.

Pagina 17 din 32
Figura 7 Etapele clonării unei gene (Brooker, 2012)
II.1.iii. Obţinerea de ADNc prin revers-transcripţie

În Figura 7, a fost redată clonarea unei gene


utilizând ADN de interes şi ADN plasmidial, dar
obţinerea ADN de interes pentru clonare se poate face
şi pornind de la o moleculă de ARN (Fig.8).
Din proba de celule, ARNm este extras şi
purificat, se adaugă o serie de primeri a căror catena
conţine nucleotide cu timină – poly-dT primer. Deoarece
molecula de ARNm prezintă o coadă polyA,
oligonucleotidele adăugate vor fi complementare
capătului 3' al ARNm. Prin adiţia revers-transcriptazei şi
a deoxiribonucleotidelor se obţine o catena ADN
complemetară catenei de ARNm. După obţinerea ADNc
, se introduce: ADN polimeraza, o RNazăH şi ADN
ligază.
Clonarea ADNc este utilă deoarece prezintă
marele avantaj că nu prezintă introni, aceştia putând
avea lungimi considerabile. Astfel, inserţia ADNc în
vectori este mult mai uşoară, cercetarea unei gene
codificatoare devine mai uşoară şi, de asemenea, se
indepărtează riscul de clivare şi clonarea a unor resturi de introni.
Figure 8 Sinteza de ADNC (Brooker, 2012)

II.2. Reacţia de polimerizare în lanţ

Cea de-a două metodă de clonare a genelor fără a utiliza vectori recombinanţi şi celule gazdă, este
reprezentată de PCR – reacţia de polimerizare în lanţ.
Reacţia de polimerizare în lanţ ( Eng. Polymerase Chain Reaction) - tehnică utilizată pentru replicarea
unui fragment de ADN în aşa fel încât să se obţină un număr mare de copii ale unei secvenţe a ADN ( (Mohan,
2005).
Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesivede replicare ADN in vitro,
folosind doi primeri oligonucleotidici hibridizează cu cele două catene ale secvenţei originale de ADN. Diferenţa

Pagina 19 din 32
esenţială dintre replicare din cadrul PCR şi replicarea in vivo este reprezentată de faptul că în cadrul PCR
procesele nu sunt mediate enzimatic, ci sunt realizate prin parcurgerea unor trepte de temperatură.

Principalele componente ale reacţiei sunt: ADN matriţă, o ADN polimerază termostabilă, primeri
oligonucleotidici (lungime de 15-20 nucleotide), dNTP, tampon de reactive, ioni de Mg++ (Vassu, 2001). Reacţia
PCR are loc într-un analizor numit thermocycler.

Reacţia PCR este formată din n cicluri (25-40), debutează cu o denaturare initială – timp de 2 minute
la 94-95ºC iar apoi, în fiecare ciclu fiind parcurse trei etape principale (Figura 9):
- Denaturarea termică a matriţei (desfacerea dublului helix) – 20-30 secunde la 94-95ºC;
- Ataşarea primerilor - 55-65ºC, temperatura stabilită de utilizator;
- Polimerizarea propriu zisă – 45 secunde la 72ºC pentru primele 10 cicluri si apoi 2-3 secunde pentru
urmnatoarele 20 de cicluri.
La terminarea unui ciclu de replicare in vitro, cantitatea de ADN rezultată este dublă fată de matriţă. Mai
mult, produsele rezultate într-un ciclu sunt folosite ca matrită în ciclul următor, astfel încât numărul final de copii
ADN este de 2nxy, unde y= numărul initial de copii, n= numărul de cicluri de replicare. Este de subliniat că
moleculele accumulate exponential reprezintă copii ale matriţei care la capete are incorporate primerii.
Reacţia PCR este o metodă prin care se obţin catităţi mari dintr-o anumită secvenţă ADN. Aceste molecule
pot fi ulterior manipulate/analizate fără a fi necesară o prealabilă clonare moleculară a acestora.
Prima raportare în literatura de specialitate a unui experiment de amplificare in vitro a unei secvenţe ADN
prin PCR a fost realizată de Karz Mullis în 1985. Ulterior, metoda a fost preluată de un grup de cercetători de la
Departamentul de Genetică Umana de la Cetus Corporation (SUA) pentru amplificarea secvenţei ADN ce
codifică β-globina umană şi pentru diagnosticul prenatal al anemiei falciforme.
Initial, reacţia PCR folosea ca replicază fragmentul mare (Klenow) al ADN polimerazei I de la E.coli.
această enzimă era însă inactivate de temperaturile ridicate necesare etapei de degenerare a matriţei. Ca
urmare, şa fiecare ciclu de replicare trebuia adăugată enzimă "proaspătă". Ulterior a fost descoperită şi
introdusă în reacţia PCR o ADN polimerază termostabilă izolată dintr-o tulpină de Thermus aquaticus.
Un alt pas important în dezvoltarea tehnologiei PCR a fost procesul de automatizare care a condus la
producerea în present a unor aparate ce desfăşoară întreg procesul PCR, parcurgând toate treptele de
temperatură în n cicluri.
Figure 9

Figura 9 Etapele PCR (Brooker, 2012)

Figura 10 Exemplu de date obţinute prin RT-


PCR (Brooker, 2012)

Variante ale reacţei PCR sunt:


- RT-PCR (Real Time PCR) ce utilizează bromura de etidiu şi se poate observa obţinerea ampliconului
în timp real prin cuantificarea fluorescenţei emanate de bromura de etidiu fixată de secventele ADN
(Fig.10);
- PCR cu revers transcripţie – atunci când se cuantifică ADN complementar obţinut prin revers-
transcrierea ARNm;
- PCR multiplex, atunci cand se aplifică mai multe secvente de ADN (de ex. 5 fragmente diferite).

Pagina 21 din 32
III. Bibliotecile de gene

Dezvoltarea tehnicilor de clonare a genelor, a permis oamenilor de ştiinţă să studieze structura şi funcţiile
genelor la nivel molecular. Pentru studierea genelor provenind din cromozomi ale speciilor în viaţă, cât şi
pentru identificarea produsului unei gene, cercetătorii au inceput să construiască banci de gene.
Bibliotecă/bancă de gene reprezintă o colecţie de fragmente de ADN clonate, reprezentând întregul
material genetic al unui organism, cu rolul de a localiza şi facilita izolarea genelor.Băncile de gene sunt
alcătuite prin fragmentarea ADN-ului genomic cu ajutorul enzimelor de restricţie şi metodelor fizice.
Endonucleazele de restricţie sunt enzime bacteriene care clivează molecula de ADNdc în fragmente mai mici
numite fragmente de restricţie. Fragmentele obţinute sunt clonate, iar celulele gazdă în care sunt introduse
fragmentele sunt centrifugate şi îngheţate (Mohan, 2005).
Într-un experiment de clonare care decurge ca în Fig.7, cercetătorul are la dispoziţie o colecţie de vectori
recombinanţi, adică o bibliotecă ADN. Atunci când ADN-ul clonat provine din cromozomi, colecţia obţinută
poartă numele de bibliotecă genomică. Atunci când colecţia este alcătuită din vectori recombinanţi conţinând
ADNc, poartă numele de bibliotecă de ADNc .
Un lucru important de luat în considerare atunci cand se
construieşte o bancă de gene îl reprezintă numărul de clone
necesar pentru a avea certitudinea de a regăsi gena de
interes. Calculul se face luând în calcul dimensiunea
genomului, numărul de fragmente, lungimea medie a unui
fragment (Lodge, 2007).
Unul din avantajele construirii unei bănci de gene il
reptezintă faptul că această colecţie poate fi conservată şi
utilizată de nenumărate ori pentru screening. Conservarea
acesteia se face prin obţinerea unei suspensii intr-un mediu
conţinând glicerol. Conservarea se face la -20ºC, pentru
multe luni.
III.1. Bibliotecile genomice
Pentru a crea o bibliotecă genomică, se urmează
următoarele etape:
a) probele de ADN vor fi extrase si purificate.
b) fragmentarea prin digestia sa incompletă cu ajutorul unei
Figura 11 Construirea unei biblioteci genomice
anumite enzime de restricţie, care produce fragmente de o anumită mărime.
c) inserarea fragmentelor ADN separat într-un vector tip bacteriofag lambda sau în plasmide .
Se obţine o bancă cu sute de mii de vectori recombinanţi ce conţin fragmente diferite de ADN uman.
O astfel de colecţie va cuprinde tot ADN din genomul uman.
Una din primele bănci genomice, folosită şi astăzi de sute de laboratoare, a fost creată în 1978 de
Maniatis. În teorie, aceste colecţii genomice conţin un număr foarte mare de clone pentru a aigura prezenţa
genei de interes printre acestea. O bancă genomică umană alcătuită din cosmide, fiecare purtând un fragment
ADN cu o lungime de 35000 – 44 000 pb, ar necesita aproximativ 350 000 de cosmide pentru a asigura un
procent de 99% siguranţă că avem toate secvenţele ADN incluse in bibliotecă. Pentru a uşura procesul de
identificare a unei anumite gene s-au construit recent colecţii de clone ce corespund numai unui anumit
cromozom uman sau chiar a unei regiuni sau benzi cromozomice.
Evaluarea unei biblioteci genomice
În multe cazuri, scopul clonării genelor este cel de a obţine copii multiple ale unei gene specifice sau ale
unei anumte regiuni din genă. După fragmentarea ADN-ului genomic, inserarea segmentelor de acid nucleic
obţinute în vectorii alesi, încorporarea vectorilor în celule bacterie, obţinerea coloniei bacteriene se va constitui
biblioteca genomică. Conservarea materialului genetic obţinute se face sub formă de suspesie din coloniile
bacteriene sau din fagii prelevaţi de pe medii (Figura 13).
Pentru a determina complexitatea băncii de gene obţinte, se face numărarea coloniilor (utilizându-se o
diluţie adecvată). Dacă evaluarea bibliotecii se face prin titrul suspensiei obţinite, se va obţine un indicator fals
asupra complexităţii băncii.
Pentru evaluarea calitativă a bibliotecii, adică pentru a verifica prezenţa fragmentului ADN de interes în
banca de gene, se slectează un număr de clone, se extrage ADN din plasmidele/fagii ce conţin clonele,
supunerea ADN la digestie paţială, urmată de electroforeza pe gel de agaroză. Detaliile acestei proceduri
variază în fucţie de tipul de vector şi de strategia de clonaj, dar la nivelul cel mai simplu (inserarea fragmentelor
de restricţie într-un plasmid), se poate observa că fiecare clonă prezintă o bandă de lungime constantă
aferentă vectorului şi alte benzi, de lungimi variabile, ce reprezintă segmentele de ADN inserate. Clonele care
nu prezintă benzi de diferite lungimi sunt rezultatul recircularizării ADN-ului propriu vectorului. În mod ideal,
fiecare clonă conţine câte un fragment inserat. Fragmentele multiple inserate pot induce apariţia de probleme
în ceea ce priveşte relaţia dintre diferite segmente ale genomului (Dale, 2002).

Pagina 23 din 32
Figura 12 Amplificarea bibliotecii de gene (Dale, 2002)

Figura 13 Evaluarea calităţii bibliotecii de gene (Dale, 2002)


Conservarea unei biblioteci genomice
După constituire, biblioteca de gene reprezintă o rezervă utilă de resurse pentru experimente
ulterioare, nu numai pentru secvenţa ADN pentru care iniţial a fost realizată. O bancă de gene va conţine tuburi
cu suspensii de colonii bacteriene sau cu particule de bacteriofagi. Conservarea se face la -80ºC, celulele
bacteriene dintr-o bibliotecă de plasmide sunt protezate de efectele adverse ale congelării prin adaos de
glicerol. Bibliotecile cu fagi vor fi păstrate ca particule virale crioprotejate prin adaos de DMSO (sulfoxid de
metil). Atunci când se doreşte trierea bibliotecii, se utilizează un segment din materialul stocat, restul rămânând
congelat, de aceea este preferabil ca materialul stocat să fie esantionat înainte de congelare. După
decongelare, titrarea eşantionului este necesară. Proba este supusă unei diluţii seriate , apoi diluţia este
etalată pe o placă de agar şi incubată la 37ºC peste noapte. Acest proces permite examinatorului să facă
titrarea băncii şi să determine cât de mult din cantitatea de probă este necesară pentru screening.

III.2. Bibliotecile de ADNc

Dacă o bibliotecă genomică include toate segmentele ADn, indiferent dacă acestea sunt exprimate sau
nu, o bibliotecă de ADNc conţine doar segmentele ADN
care sunt exprimate. Astfel, în cazul mamiferelor, o astfel
de bibliotecă va fi de dimensiuni reduse.

Banca de ADNc cuprinde copiile de ADNc ce


corespund tuturor moleculelor de ARNm dintr-o anumită
celulă, într-un anumit moment.

De asemenea, având în vedere că intronii nu


sunt incluşi în molecula de ARNm, biblioteca va conţine
doar fragmentele codificatoare ale genelor. De
asemenea, ADN-ul necodificator, transpozonii,
pseudogenele nu sunt clonate şi nu se regăsesc într-o
bibliotecă ADNc

Construcţia unei bănci de ADNc se face în mai


multe etape:
1. obţinerea ARN total din celulă
2. separarea ARNm de celelalte tipuri de ARN
3. obţinerea de copii ADNc corespunzătoare fiecărui tip
de ARNm cu ajutorul revers-transcrpţiei
4. inserarea ADNc în vectori de tip bacteriofag lambda

Băncile de ADNc sunt folosite mai frecvent decât


cele de ADN genomice deoarece clonele obţinute
corespund numai secvenţelor codante ale genei (fără
introni), deci sunt mult mai scurte. În plus se pot Figura 14 Construirea unei biblioteci ADNc
identifica mai uşor genele care se exprimă preferenţial

Pagina 25 din 32
sau exclusiv în celule specializate (ficat, muşchi, reticulocite).

Spre deosebire de bibliotecile genomice, cele de ADNc pot fi conservate şi după o ordonare prealabilă
(Figura 15). Acest lucru se face folosind placi de microtitrare, uneori şi filtre, ce permit păstrarea separată a
eşantioanelor. Acest proces este automatizat, instrumentul utilizat având capacitatea de identifica coloniile, de
a le preleva individual şi ale transfera pe placa de microtitrare. Această librarie permitea evaluarea fiecarei
clone în parte dar şi replicarea pe agar sau pe membrane.

Figura 15 Obţinerea unei biblioteci ordonate ADNc (Dale, 2002)

Dezvoltarea tehnicii microarray a permis obţinerea de fragmente ADN fără construirea băncilor de
gene, folosind produşii PCR sau oligonucleotide sintetice. Aceste tehnici utilizează fie membrane de nylon
(macroarray), fie suport de sticlă şi sunt deosebit de utile în identificarea variaţiilor la nivelul genomului sau
analize ale transcripţiei. Arrays provenind de la un număr mare de specii şi organisme pot fi achiziţionate.
Cea mai mare colecţie de arrays este deţinută de German Human Genome Project (http://www.rzpd.de).

O bibliotecă ordonată conţine tot un set de clone “întâmplător”, pentru identificarea conţimutului
fiecărei clone trebuie realizat un screening. Pentru a realiza o ordonare a clonelor, se apelează la tehnicile
de hibridizare între clone (Figura 16). Tehnicile de secvenţializare a ADN oferă alternative construirii
bibliotecilor de gene (Dale, 2002).
Figura 16 Obţinerea unei biblioteci ordonate (Dale, 2002)

III.4. Identificarea unei gene

Identificarea clonei cu gena dorită, din ansamblul clonelor din biblioteca sau banca de gene, se face cu
ajutorul unor tehnici sensibile de identificare (screening sau criblaj).
Metode utilizate pentru identificarea unei gene din colecţia de gene sunt reprezentate de hibridizarea cu
conde marcate, screening cu anticorpi şi PCR.
Hibridizarea acizilor nucleici reprezintă procesul prin care 2 monocatene ADN sa ARN din surse bilogice
diferite formează configuraţia dublu catenară ( (http://www.slideshare.net, 2013)Figura 17).
Din puncte de vedere chimic, hibridizarea se bazează pe:
- principiul complementarităţii dintre cele două catene ADN sau ARN;
- omologia de secventă dintre cele doua surse ADN.
Molecula ţintă reprezintă fragmentul de ARN, ADN sau de proteină de identificat sau ce urmează a fi
localizat.
Molecula sondă reprezintă dragmentul de ADN, ARN sau proteină cu ajutorul căruia, prin hibridizare,
este identificată sau localizată ţinta.

Pagina 27 din 32
Tabel 2 Tipuri de hibridizare

Principalele etape ale unui proces de hibridizare moleculara pe suport solid sunt :
1. Sinteza sondei marcate Functie de molecula de ADN tinta, de lungimea sondei dorite, precum si de
tipul de marcare, se sintetizeaza (prin tehnicile prezentate mai sus) o specie moleculara de sonda ADN sau
ARN complementara cu molecula tinta.
2. Procesarea ADN tinta Moleculele de ADN sursa in care se gaseste si secventa de ADN tinta, trebuie
izolate si purificate. Ulterior, ADN sursa se digera cu o endonucleaza de restrictie, astfel incat secventa de
ADN tinta sa fie obtinuta ca molecula d.c. liniara. Amestecul de digestie se supune unei electroforeze in gel de
agaroza, in care se separa diversele fragmente obtinute in reactia de restrictie.
3. Denaturarea ADN tinta Gelul de agaroza in care se afla si moleculele de ADN se introduce in solutii
de NaOH, in care va avea loc denaturarea acestora, rezultand molecule monocatenare.
4. Transferul ADN tinta pe suport solid Fragmentele de ADN d.c. lineare separate in gelul de
electroforeza se transfera pe un suport solid (hartie de nitroceluloza sau membrana de nylon), dupa ce in
prealabil se realizeaza o denaturare a moleculelor de ADN prin imersarea gelului in NaOH 0.5N. Transferul
poate fi realizat prin 3 variante tehnice:
- transfer prin capilaritate, in sistem sandwich: fragmentele de ADN sunt transportate din gel de catre un
lichid (de obicei, tampon SSC) si depozitate pe suportul solid; miscarea lichidului se realizeaza prin capilaritate
si se datoreaza unui teanc de hartie prosop asezat in sistem sandwich; rata transferului depinde de
dimensiunea fragmentelor si de concentratia agarozei.
- transfer electroforetic: se foloseşte numai pe membrane de nylon încărcate electric şi reprezintă o
metodă eficientă chiar pentru transferul unor fragmente mici: 56 bp.
- transfer prin vacuum: este mult mai eficient şi mai rapid decît celelalte 2 variante tehnice; în acest caz,
gelul de agaroza se gaseste în contact direct cu suportul solid (nitroceluloza sau membrana de nylon),
amandouă aşezate pe un suport poros deasupra unei camere de vacuum; tamponul este aşezat în camera
superioară a dispozitivului şi este tras prin vacuum, eluând acizii nucleici din gel şi depozitându-i pe suportul
solid.
Suportul solid cu acizii nucleici depozitaţi pe el este apoi expus la radiaţii UV, ceea ce creează o serie de
legături de tip cross-links între moleculele de acizi nucleici şi structura suportului; astfel, fragmentele de acizi
nucleici (inclusiv ADN ţintă) sunt fixate de suportul solid.
5. Hibridizarea moleculară În aceasta etapă, suportul solid pe care se află fixată ţinta se imerseaza în
tampon 5xSSC care conţine şi sonda marcată şi se lasă în agitare uşoară 14-16h. După hibridizare, sonda
nehibridizata se îndepartează prin spălări succesive cu tampon SSC (Vassu, 2001).

Figura 17 Hibridizarea (http://www.slideshare.net, 2013)

Screening cu anticorpi
Unele biblioteci de gene permit criblajul cu anticorpi. Astfel, de exemplu, biblioteca obţinută utilizând ca
vector fagul lambda gt11, este cultivată în condiţii ce permit exprimarea proteinelor : temperatura de 42ºC,
inactivarea represorului sensibil la temperatură, prezenţa isopropil-galactozidei (IPTG)pentru a induce
exprimarea promotorului lac Z. Plăcile sunt apoi acoperite cu hartie de nitroceluloza sau membrana de nylon
dar fără tratment cu hidroxid de sodiu şi sunt incubate cu diluţii ale anticorpilor proteinei de interes. După
incubare, excesul de anticorpi este îndepărtat iar filtrul este incubat cu un anticorp secundat marcat ce se va

Pagina 29 din 32
lega la primul. Spre deosebire de screeningul cu sonde marcate, trierea cu anticorpi necesită exprimarea genei
(Dale, 2002).
(http://slideplayer.com, 2016)

Figure 18 Screening-ul cu anticorpi (http://slideplayer.com, 2016)

Reacţia PCR şi analiza secvenţei ADN


Tehnica PCR poate fi folosită ca alternativă clonării genelor şi alcătuirii bibliotecilor de gene dar poate fi
folosită şi pentru screening-ul unei bănci de gene obţinută prin clonare. În mod normal, secvenţa onţinută de
vector este cunoscută. Astfel, se va utiliza o pereche de primeri ce poate hibridiza la oricare din cele două
capete ale secvenţei de interes şi apoi se va amplifica secvenţa ADN ţintă. În cazul utilizării PCR ca tehnică de
triere, nu mai este necesară purificarea ADN-ului plasmidial din fiecare clonă. Odată reperat segmentul de
interes, acesta va fi multiplicat şi apoi analizat, nu este necesara trierea băncii de gene pentru identificarea
unui nou segment.
Concluzii

 Clonarea unei gene se referă la fenomenul de obţinere a numeroase copii ale unei gene.

 Clonarea ADN sau amplificarea selectivă se poate face in vivo, utilizând mecanismul natural de

replicare - prin utilizarea vectorilor sau in vitro prin Reacţia de Polimerizare în Lanţ.

 PCR este o metodă rapidă, sensibilă, eficace şi ieftină

 Clonarea ADN permite construirea unor biblioteci de gene, rezerve ce conţin întregul genom

(bibliotecile genomice) sau doar regiunile codificatoare (bibliotecile de ADNc).

 Detecţia specifică a secvenţei de ADN de interes din bibliotecile de gene se face utilizându-se

tehnici ca hibridizarea (blotting) sau screening-ul cu anticorpi.

 Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) poate fi utilizată atât pentru clonarea acelulară, cât şi ca

metodă de screening pentru bibliotecilor de gene.

 Tehnicile de ADN recombinant au inaugurat "era ingineriei moleculare" care schimbă statutul

geneticienilor, transformându-i din observatori în "manipulatori" de gene.

 Punerea la punct a clonării genelor a permis descifrarea structurii şi funcţiei genelor şi aplicarea

noilor cunoştinţe în medicină (pentru depistarea, diagnosticul şi tratamentul bolilor), industria

farmaceutică (obţinerea de proteine terapeutice şi vaccinuri), agricultură şi zootehnie.

Pagina 31 din 32
Bibliografie

(n.d.). Retrieved 12 28, 2016, from http://www.esanatos.com/ghid-medical/microbilologie/Genetica-


bacteriana-ereditatea21842.php

(2013, 10 18). Retrieved 01 28, 2017, from http://www.slideshare.net:


http://www.slideshare.net/caecayey/biotecnologa-27337167

(2016, 01 14). Retrieved 01 28, 2017, from http://slideplayer.com: http://slideplayer.com/slide/5120656

Brooker, R. J. (2012). Genetics: analysis &principles, 4th Edition. New York: MCGrow-Hill.

Brown, T. (2010). Gene Clonig and DNA Analysis. Mancester: Wilez-Blackwell.

Covic, M. S. (2004). Cap. 3- Structura, analiza şi localizarea genelor. In Genetică medicală. Iasi: Polirom.

Dale, J. W. (2002). From Genes to genomes. Conceps and Applications of ADN TEchnologz. London: JOhn
Wilez&Sons.

Di Berardino, m. (n.d.). Cloning: Past, Present and the excitig Future, Breakthroughts in bioscience,.
Federation of American Societies for Experimental Biology.

Lodge, J. L. (2007). Gene cloning: principles and applications. New York: Taylor&Francis Group.

Mohan, G. (2005). Dictionar Enciclopedic de Biologie. Bucuresti: All.

Vassu, T. S. (2001). Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană - Note de curs şi tehnici de
laborator. Bucureşti: Petrion.