CRISPR–Cas9

O istorie a descoperirii sale și considerații etice

ale utilizării sale în editarea genomului

Dezvoltarea unei metode de editare a genomului bazată pe tehnologia CRISPR-Cas9 a fost

distinsă cu Premiul Nobel pentru Chimie în 2020, la mai puțin de un deceniu după descoperirea tuturor
componentelor moleculare principale ale sistemului. Pentru prima dată în istorie, un premiu Nobel a fost
acordat două femei, Emmanuelle Charpentier și Jennifer Doudna, care au făcut descoperiri cheie în
domeniul manipulării ADN-ului cu sistemul CRISPR–Cas9, așa-numitele „foarfece genetice”. Este
dificil de supraestimat importanța tehnicii, deoarece permite nu numai manipularea genomului
organismelor model în experimente științifice și modificarea caracteristicilor culturilor și animalelor
importante, dar are și potențialul de a introduce schimbări revoluționare în medicină, în special în
tratament. a bolilor genetice. Funcția biologică originală a sistemului CRISPR-Cas9 este protecția
procariotelor de elementele genetice mobile, în special de viruși. În prezent, CRISPR-Cas9 și
tehnologiile conexe au fost utilizate cu succes pentru a vindeca boli care pun viața în pericol, pentru a
face teste de detectare a coronavirusului și chiar pentru a modifica celulele embrionare umane, cu
nașterea ulterioară a copiilor care poartă modificările introduse. Această intervenție cu celulele
germinale umane a dus la o largă dezaprobare în comunitatea științifică din cauza preocupărilor etice și
solicită un moratoriu asupra manipulărilor genomice moștenite. Această revizuire se concentrează pe
istoria descoperirii sistemului CRISPR-Cas9 cu unele aspecte ale aplicațiilor sale actuale, inclusiv
preocupări etice cu privire la utilizarea acestuia la oameni.

O ISTORIE A DESCOPERITĂRII PRINCIPALELOR COMPONENTE ALE

SISTEMULUI CRISPR–Cas9

CRISPR – repetări palindromice scurte interspațiate în mod regulat – au fost descoperite pentru
prima dată în secvențele de ADN din bacteriile Escherichia coli și descrise în 1987 de Ishino și colab.
[1] de la Universitatea Osaka (Japonia). La acel moment, secvențierea acestor fragmente de ADN greu
de studiat a durat câteva luni, dar nici originea lor, nici semnificația lor în celula bacteriană nu au fost
înțelese de către descoperitorii lor. Deși în primele lucrări în acest domeniu, funcția biologică a
sistemului CRISPR nu fusese încă elucidată, oamenii de știință propuseseră deja o modalitate de a utiliza
informațiile codificate în loci CRISPR în cercetarea medicală, și anume, pentru genotiparea diferitelor
tulpini de bacterii: inițial. asupra Mycobacterium tuberculosis [2], iar mai târziu asupra Streptococcus
pyogenes [3]. După cum sa dovedit, loci CRISPR au avut un grad ridicat de polimorfism în diferite
tulpini ale aceleiași specii de bacterii patogene, ceea ce a permis identificarea tulpinilor bacteriene în
condiții clinice.

O descoperire semnificativă în înțelegerea funcției biologice a loci CRISPR a avut loc odată cu
descoperirea lui Francisco Mojica de la Universitatea din Alicante (Spania), care a întâlnit structuri
similare în genomul arheal al Haloferax mediterranei în 1995 [4]. Prezența lor în două domenii ale vieții
îndepărtate din punct de vedere evolutiv a sugerat marea semnificație funcțională a acestor elemente și a
servit ca un impuls pentru cercetări ulterioare. Mojica a observat asemănarea elementelor pe care le-a
descris în arhee cu repetările ADN-ului găsite anterior în genomurile bacteriene și a fost unul dintre
primii oameni de știință care a emis ipoteza că acești loci neobișnuiți includ fragmente de ADN străin și
sunt, de fapt, o parte a sistemului imunitar. de bacterii și arhee [5]. În același an cu Mojica, alte două
laboratoare au ajuns în mod independent la concluzii similare [6, 7], anunțând începutul unei ere a
cercetării active asupra acestui extraordinar fenomen natural. În conformitate cu teoria sistemului
imunitar procariot, fragmentele de ADN viral („spacers” lungi de 17-84 de baze), separate prin repetări
palindromice scurte (23-50 de baze [8]) și grupate în clustere în regiuni intergenice, reprezintă o
bibliotecă. a informațiilor genetice potențial periculoase (pentru o prezentare generală a arsenalului
antiviral microbian, a se vedea recenziile lui Isaev și colab. [9, 10]). Inițial, s-a presupus că un astfel de
sistem va funcționa prin mecanismul interferenței ARN. Cu toate acestea, în publicarea lui Marraffini și
Sontheimer, s-a demonstrat experimental pentru prima dată că ținta reală a sistemului imunitar al
procariotelor era ADN străin [11], și nu ARNm și, prin urmare, utilizarea unui astfel de sistem în
laboratorul ar putea reprezenta un potențial instrument de editare genomică. Interesant, studiile ulterioare
au demonstrat că unele dintre sistemele CRISPR descrise funcționează direct cu moleculele de ARN [12,
13] și, prin urmare, pot fi utilizate pentru a dezactiva transcriptele specifice din interiorul celulei într-un
mod selectiv [14, 15].

Primele informații experimentale despre mecanismul de acțiune al sistemului CRISPR au fost

obținute în 2007 în studiile a doi oameni de știință francezi din domeniul alimentației, Rodolphe
Barrangou și Philippe Horvath, care au lucrat cu culturi de iaurt de bacterii Streptococcus thermophilus
pentru compania daneză Danisco [16]. Datorită colecției bogate de tulpini bacteriene a companiei,
colectate începând cu anii 1980, oamenii de știință au reușit să urmărească cursul istoric al achiziției
bacteriene a distanțierilor la locusul CRISPR ca răspuns la atacurile virale ale bacteriofagelor.
Adăugarea de noi distanțieri în această lucrare a determinat imunitate dobândită la noile tipuri
corespunzătoare de bacteriofagi la S. thermophilus: observație care a condus ulterior la obținerea unuia
dintre primele brevete în acest domeniu [17] și la începutul culturilor bacteriene” vaccinare” cu
utilizarea tehnologiei bazate pe CRISPR de către Danisco în 2005 [18].

În prezent, repetele CRISPR au fost găsite în majoritatea genomilor arheali și aproape jumătate
din cei bacterieni studiati, dar nu au fost găsite în secvențele de ADN eucariote sau virale. Existența
repetărilor CRISPR în mitocondrii a fost sugerată într-una dintre cele mai vechi publicații pe acest
subiect (același articol a descris CRISPR în cianobacterii pentru prima dată) [19]. Autorii au folosit un
set de date publicate anterior despre secvențierea plasmidelor mitocondriale din boabele Vicia faba L.
[20], iar concluziile lor au fost citate în continuare de Mojica și colab. [21], dar aceste observații nu au
fost confirmate în studiile ulterioare [8].

La momentul descoperirilor inițiale, grupurile științifice individuale au folosit o varietate de

acronime diferite pentru CRISPR, ceea ce în prezent complică căutarea articolelor timpurii pe această
temă. Numele actual pentru CRISPR a apărut pentru prima dată în Jansen et al. [22] în 2002 și a fost
sugerat de Mojica în corespondență dintre cele două grupuri științifice colaboratoare. Aceeași publicație
a fost prima care a descris prezența genelor asociate cu repetările CRISPR (numite de autori cas1-4,
gene asociate CRISPR). Aceste gene au fost găsite în imediata apropiere a loci CRISPR ale diferitelor
procariote, iar două dintre ele conțineau motive caracteristice helicazei și nucleazei, care susțineau
ipoteza autorilor despre asocierea non-aleatorie a genelor cas cu locusul CRISPR și a acestora.
implicarea în metabolismul ADN-ului. Tot în 2002, aceeași vecinătate de gene a fost descrisă de o
echipă de oameni de știință condusă de Eugene Koonin de la Institutul NCBI (Bethesda, SUA), dar
asocierea acestor gene cu matrice CRISPR nu a fost deslușită de aceștia la acea vreme [23] . Din
momentul primei descoperiri a genelor asociate cu sistemul CRISPR, până în prezent, abundența și
diversitatea lor cu adevărat extraordinară au fost găsite în celulele procariote, inclusiv reprezentanți ai
familiilor helicazelor, nucleazelor, polimerazelor și altele. Proteinele asociate acestui sistem pot fi
alocate fie modulului adaptiv (participant la dobândirea imunității, reprezentanți principali – Cas1 și
Cas2), fie modulului efector (implicat direct în distrugerea elementelor genetice mobile prin
recunoașterea și clivajul lor), cu unele proteine suplimentare și de reglare, de asemenea, s-au dovedit a fi
asociate cu sistemul [24]. În prezent, este recunoscută o modalitate de clasificare în care toate sistemele
CRISPR–Cas cunoscute în prezent sunt împărțite în 2 clase și 6 tipuri, care, la rândul lor, sunt, de
asemenea, împărțite în numeroase subtipuri: la momentul scrierii recenziei, Makarova și colab. . [25] a
descris >30 de subtipuri (Fig. 1). Principala diferență dintre clase este că modulul efector al sistemelor
din clasa 1 este reprezentat de un complex de mai multe proteine, în timp ce în clasa 2 este o singură
proteină multidomeniu (Cas9, Cas12 sau Cas13) [26-28].