Curs 14

Culturile de celule și țesuturi- domeniu aflat în avangarda cercetătii științifice

Culturile de celule și țesuturi sunt unul dintre domeniile aflate în avangarda cercetării științifice
datorită potențialului de aplicare în realizarea de: alimente, medicamente și biosecuritate.

Potențialul de aplicare al culturilor de celule și țesuturi în realizarea de alimente

 În cazul structurilor biologice animale, derivă din perpetuarea genotipurilor valoroase

prin clonare.

Metode de clonare aplicate la bovine:

Metoda 1: Secționarea în două a unui embrion aflat în stadiu de morulă sau blastocist și
implantarea fiecărei jumătăți embrionare în uterul unei bovine (1980)
Metoda 2: Racoltarea de ovocite de la animalele sacrificate, maturarea in vitro a ovocitelor până
când acestea ajung la stadiu de metafază II, enuclearea ovocitelor și fuzionarea ovocitelor
enucleate cu celule embrionare (prelevare de la un embrion aflat în stadiul de morulă)

Observații:
 Metoda 2 este mai eficienta decat Metoda 1
 Dezavantaje:
1. Numărul de embrioni este de 5-6 (în loc de 20 potențial)
2. Doar 30% din embrioni se dezvoltă până la stadiul de blastocist (chiar 7% atunci când
este utilizată congelarea)
3. Procentul de organisme clonate născute este foarte mic în raport cu procentul de embrioni
4. Din clonele obținute 5% sunt exagerat de mari la naștere și manifestă fragilitate
Metoda (tehnica) de clonare aplicată la ovine în cazul Dolly
Etape:
 Prelevarea prin biopsie a unor celule de glandă mamară de la o oaie din rasa Finn Dorset
(cu capul alb), aflată în ultimul trimestru de gestație
 Cultivarea in vitro timp de cinci zile pe mediu nutritiv complet a celulelor de glandă
mamară
 Transferul celulelor de glandă mamară in vitro pe mediu nutritiv cu nutrienți în cantități
reduse pentru a stopa ciclul celular în stadiul G 0  celulele aflate în stare de cvasi
hibernare
 Ovocitele au fost obținute prin perfuzarea oviductelor; în momentul prelevării ciclul lor
celular era stopat în metafaza II  celule care conțin un singur set de cromozomi (sunt
celule haploide)
 Enuclearea ovocitelor
 Aspirarea cromozomilor aflați în placa metafazică + o cantitate de citoplasmă + globulul
polar adiacent
 Ovocitele enucleate sunt incubate pe mediu nutritiv specific la 37 grade C
 Activarea ovocitelor enucleate utilizând impluls electric
 Fuzionarea celulelor hibernate, prin utilizarea de pulsuri electrice, cu câte un ovocit
nefecundat și enucleat prelevat de la o oaie din rasa Scottish Blackface (cu capul negru)

!Observații:
Metoda prin care a fost obținută Dolly (ovocite enucleate nefecundate în care se introduce
nucleul unei celule diploide) a fost elaborată în perioada 1938-1952 și a fost aplicată inițial la
amfibieni, pentru a demonstra că fiecare celulă a unui embrion conține toată informația genetică
a unui individ.

Rezultate:
 277 embrioni obținuți+ implantare în oviductele ligulate ale unor femele (6 zile)
 247 embrioni recuperați
 29 embrioni s-au dezvoltat până la stadiul de morulă sau blastocist
 Implantarea embrionilor în uter (13 oi purtătoare)
 Ovina Dolly (primul animal obținut- Scoția, institutul Roslin, 1996—cu nucleul unei
celule somatice diferențiate)
Potențialul de aplicare al cct în realizarea de medicamente:

În cazul structurilor biologice animale, derivă din producerea de substanțe cu efect terapeutic
prin:

 Cultivarea de celule canceroase (preluate din hipofiza – produc formoni ai creșterii și

hormoni adenocorticotropi; suprarenalele fabrică corticosteroizi; celule adipoase secretă
histamină)
 Cultivarea de celule normale (preluate din fibroblaste—produc colagen și
mucopolizaharide, cele din neuroblaste biosintetizează factori ai creșterii țesutului nervos
și acetil colin esterază)
 Transgeneză

Transgeneza la animale:

În prezent există numeroase tehnici de introducere a genelor (transgenelor) în celulele

mamiferelor. Dar, există deocamdată, multe probleme implicate în exprimarea și funcționarea
acestora la nivelul organismului transgenic.

Avantajele transgenezei la animale sunt date de specificitatea (caracterul de interes poate fi

obținut cu „acuratețe” – spre deosebire de metodele convenționale care nu asigură 100% din
transmiterea caracterului de interes), rapiditatea sau viteza (caracterul de interes poate fi stabilit
doar într-o generație – spre deosebire de metodele convenționale care necesită mai multe
generații pentru transmiterea caracterului dorit/ caracterelor dorite), flexibilitatea (caracterul de
interes poate fi transformat chiar dacă este prezent la o altă specie și în condiții naturale
transferul acestuia nu ar fi posibil).

Riscurile transgenezei la animale:

 Disfuncții (există posibilitatea de afectare a sănătății animalelor transgenice – leucemie,
cancer etc. – atunci când inserția unei transgene antrenează modificarea expresiei unei
gene/ unor gene
 Transferul viral – este posibil în cazul xenotransplantelor (de ex. Retrovirusurile
endogene ale porcinelor pot influența celulele umane, în cazurile de xenotransplante de
inimă sau pancreas)
 Răspândirea/ fluxul genic (există posibilitatea de transfe a transgenei la nivelul
populației nedomesticite)
 Evoluția transgenei pe direcții diferite (atunci când trasgena nu se integrează în
genomul gazdei/ transgena se integrează în genom dar nu se exprimă/ exprimarea
transgenei se realizează în mod similar genei endogene – de ex ARNm ce copiază gena
pentru insulina umană clonată în șoareci este înlocuit cu ARNm pentru insulina de
șoareci
Metoda de transgeneză pentru obținerea ovinei Polly
Echipa de cercetători scoțieni care a obtinut oaia clonată numită Dolly a realizat și mielul
transgenic numit Polly. Acesta continea transgena umană pentru factorul IX de coagulare al
sângelui. Ulterior, au fost obținuți încă 5 miei transgenici purtători ai acestei gene.

Etape:
 Celulele fetale (de fibroblast) cultivate in vitro + introducerea genei de interes (gena
umană ce codifică factorul IX de coagulare al sângelui)
 Selecția celulelor transformate
 Fuziuni cu ovule enucleate
 Polly

În cazul Polly, transgena s-a exprimat, dar integrarea acesteia a fost aleatorie. Prin urmare, în
anul 1999, tehnica a fost îmbunătățită prin realizarea inserției transgenei la situs specific (permite
integrarea genei de interes în genomul celulei gazdă prin recombinarea pe bază de omologie).
Această îmbunătățire a permis obținerea oilor transgenice numite Cupidon și Diana.
Cupidon conținea doar gena pentru rezistență la neomicină ca indicator genetic (marker) pentru
că avea rol de control. Diana conținea atât gena pentru rezistență la neomicină ca indicator
genetic (marker) cât și gena pentru alfa-1 antitripsină (proteină umană necesară în tratamentul
fibrozei chistice).

Scopurile transgenezei:
- Obtinerea unei substanțe

1. șoareci transgenici care conțineau gena codificatoare a sintezei hormonului de creștere de

la șobolan – anul 2000)
2. Bovine transgenice ce conțineau gena codificatoare a sintezei lizozimei umane (enzima
poate fi extrasă din laptele bovinelor transgenice)--- martie 2011
3. Porci transgenici care conțineau gena codificatoare a sintezei hormonului de creștere de
la om (dezavantaj: gena se exprimă pe toată durata de viată a animalului transgenic; pt a
rezolva aceasta problema se utilizeaza un promotor care sa aiba funcționarea activată sau
blocată de factori specifici
4. Iezi transgenici (1999, canda) --- Iezii transgenici Webster și Peter care contineau gena ce
determină sinteza proteinei din pânza de paianjen (utila pt obținerea de fibre rezistente pt
cusaturi, tesaturi, industria aerospațiala)
5. Iepuri transgenici (2000) – Iepurele Babe care conținea gena (izoalată de la pești),
codificatoare a sintezei a unei proteine asemănătoare calcitoninei (tratamentul
osteoporozei)
- Obținerea de xenogrefe pt om (inimă și pancres)
-------pg 22