TRANSGENEZA LA

ANIMALE
Obtinerea unui organism recombinant
 Celule ovariene de hamster chinezesc

Este cea mai populara cultura de celule eucariote,

destinata producerii de proteine a caror sinteza nu este
posibila in celule de E.coli
Este situatia multor proteine pe care bacteria nu le
poate modifica post-translational, glicoliza si care,
uneori, pot fi char toxice pentru bacterie
Bioreactor pentru celule de mamifere
Proteine medicament, produse in culturi de
CHO (chinese hamster ovary)

Avonex (Interferon Beta-1a) scleroza multipla - Biogen

Herceptin (Trastuzumab) cancer de san - Genentech
Humira (Adalimumab) artrita reumatoida - Abbott Labs
Remicade (Infliximab) boala Crohn - Centocor
Embrel (Etanercept) artrita reumatoida - Amgen
 Transgeneza

Au fost create numeroase animale modificate genetic

(transgenice)
soarece vite porci oi capre pesti broaste insecte
In prezent, nu exista animale transgenice sau produse
transgenice de origine animala aprobate pentru consum
uman, aprobate de forurile de decizie din SUA
Scopurile producerii de animale transgenice includ:
•studierea pe modele animale a unor maladii
umane
•imbunatatirea calitatilor animalelor de ferma
•utilizarea animalelor ca bioreactoare
Producerea animalelor
transgenice
 Microinjectarea

micropipeta cu
pipeta care se
suport injecteaza ADN

ou fertilizat
Retrovirusuri defective recombinante

Ovulele sunt infectate inainte de fertilizare

Genomul viral se integreaza in unul dintre
cromosomii ovulului
 Transfer spermatic de gene, linker-mediat
(linker based sperm-mediated gene transfer)

Spermatozoidul care fertilizeaza ovulul este

purtatorul unei gene straine, atasata la suprafata sa
prin intermediul unei molecule linker, gena care va
ajunge in citoplasma ovulului si va fi incorporata in
genomul acestuia
Cateva dezavantaje ale metodei:
•ADN-ul strain se insera aleator in genom
•Ovulele trebuie colectate si fertilizate in vitro
•Apar situatii cand mai multe gene straine ajung in acelasi
ovul
Exemple de animale transgenice
 Vite transgenice

Vacile de lapte purtatoare a doua copii ale genei pentru

caseina produc lapte cu 13% mai multa caseina
Acest lapte devine astfel de o calitate nutritiva mai mare si,
foarte important, este necesara o cantitate mai mica
pentru a produce mai multa branza
In prezent, brevetul este in analiza institutiilor competente
din SUA
Diferenta esentiala intre aceste vaci si alte animale
transgenice este ca ADN-ul suplimentar nu este strain !
 EnviroPig TM

Aceasta rasa de porci transgenici secreta in saliva fitaza

Acidul fitic din hrana porcilor este degradat cu eliberarea de
fosfor
Insa in cazul porcilor transgenici de acest tip, fosforul poate
fi absorbit de catre animal, desi in mod normal, complexul
acid fitic/fosfor este excretat in mediu, dejectiile porcine
fiind responsabile de eutrofizarea a numeroase lacuri si
cursuri de apa
 Pesti transgenici
Tilapia
Somon/pastrav
Pisica de mare
Pot creste de 6 x mai repede decat varianta salbatica
Contin multiple copii ale genei hormonului de crestere
(growth hormone (GH)

peste transgenic
tipul salbatic
Constructul genic continand transgena care sporeste
cresterea, utilizeaza promotorul unei gene anti-inghet,
conectat cu ADN-ul complementar al GH
regiunea codificatoare
a cADN al GH

promotorul anti- regiunea 3’ a genei

inghet de la mihalt anti-inghet de la
mihalt

Cand temperatura apei scade, gena GH este activata (se

transcrie)
Pestii transgenici trebuie crescuti in ferme perfect izolate,
pentru a nu evada in mediul natural
Cu toate acestea, in crescatoriile obisnuite, evadarile sunt
destul de frecvente (~14 milioane indivizi/an)
Ce se va intampla daca pestii transgenici evadeaza si se
imperecheaza cu cei salbatici?
In conditii experimentale, masculii transgenici se imperecheaza
de 3x mai frecvent decat cei salbatici
Descendentii acestor imperecheri traiesc cu 70% mai putin
decat descendentii perechilor salbatice
Declinul populatiei de pesti si chiar periclitarea speciei sunt
principalele pericole
 Proteinele anti-inghet (antifreeze
proteins – AFP)
Aceste proteine scad
temperatura la care sangele
si alte fluide ale corpului
ingheata
Patravii nu supravietuiesc in
mod normal la temperaturi
ale apei sub –0.6°C
Pastravii trasgenici care
poseda gena si promotorul
AFP pot supravietui in ape
salbatic
+Antifreeze
mai reci de –1.2°C
transgenic
Animale bioreactoare
“Pharming”
1997, oaia Tracy, primul animal trangenic care a
produs o proteina recombinanta in lapte
alfa-1-antitripsina (AAT) – molecula terapeutica in
emfizem si fibroza cistica
Tracy a fost creata de catre PPL Therapeutics &
Institutul Roslin
Nexia Biotechnologies a trasferat gena pentru matase de
la viermele de matase la capre
Tapii au fost folositi pentru imperechere cu capre, in
scopul obtinerii de descendenti femeli care sa secrete
proteina de matase in lapte
Fiecare capra poate secreta cateva grame de proteina de
matase in lapte
Matasea este extrasa, uscata si apoi convertita in fibre,
care sunt mai rezistente si mai flexibile decat otelul

Iezi masculi
transgenici, purtatori
ai genei pentru
matase
Webster si Peter
GTC Biotherapeutics va obtine in curand aprobarile pentru
comercializarea antitrombinei umane purificate din laptele
de capra transgenica, in Europa
Astfel de tehnologii nu sunt aplicate doar la vite, oi si capre
S-au obtinut deja rezultate interesante cu iepuri de casa,
care prezinta si avantajul de la fi usor de crescut si ajung
timpuriu la maturitate sexuala, cu costuri reduse
La Institutul Roslin au fost obtinute gaini care produc
molecule terapeutice in oua
Alte tipuri de animale transgenice
ANDi, este prima primata transgenica, nascuta in ianuarie 2000
224 ovule ovule nefertilizate de maimuta au fost infectate cu un virus
purtator al unei gene pentru o proteina fluorescenta de la meduze
~jumatate dintre ovulele fertilizate au suferit diviziuni
40 au fost implantate la 20 mame-surogat
s-au nascut 5 masculi
ANDi a fost unicul pui nascut viu si purtator al genei GFP (green
fluorescent protein)
Alba, iepurele EGFP (enhanced GFP)
2000 transgenic artwork
GloFish, initial a fost produs in Singapore, in scopul
monitorizarii poluarii
Tipul normal negru-argintiu, a fost convertit la varietati rosii
sau verzi prin insertia genei GFP in diferite versiuni
Glofish sunt disponibili comercial in SUA, cu exceptia
Californiei
Glofish $5 bucata. Zebrafish normal – $0,5
Tehnologia de obtinere a
soarecilor “knock-out”
Tehonologia knock-out permite eliminarea unei gene
specifice la soareci
In acest fel, poate fi dedusa functia unei gene, pe baza
defectului aparut ca urmare a eliminarii acesteia
Un individ knock-in are inlocuita o gena cu o alta
Insertia acesteia este directionata deci, la un situs extrem de
specific in genom
Producerea de soareci knock-out necesita celule stem
embrionare (embryonic stem (ES) cells)
Acestea sunt derivate din masa interna de celule a
blastocistului (inner cell mass ICM) (ICM este ceea ce va
deveni ulterior, fetus)
Aceste celule sunt pluripotente , adica pot deveni oricare
din tipurile celulare caracteristice organismului adult
Injectarea blastocistului

Blastocist celule ES
 Soarecii himera
Blana cafenie provine de la celulele ES
injectate in blastocistul unui soarece albinos
Exemple de soareci Knockout
 p27

Soarecii knockout p27 sunt mai mari decat varianta

normala
Acest lucru nu este datorat obezitatii, ci faptului ca
structura scheletului este mai mare si implicit, tot corpul
 normal knockout

Soarecele knockout GDF8 (Myostatin)

Masa musculara este de peste 2x mai mare decat
a unui soarece normal
Mutanti naturali in gena GDF8
Soarecele knockout FGF5 are parul lung, de tip
angora
Clonele si clonarea
Experimentele initiale
 Dolly, primul mamifer clonat dintr-o celula
adulta

Dolly, adulta
Dolly si mama sa
surogat
 Transferul
nuclear de la
celule somatice
 Ce animale au fost clonate?
- transfer nuclear
oi, capre, soarece, iepure, porci, cai, asini, caini,
pisici, caprioare
-diviziunea embrionilor
oi, vite, primate (Rhesus)
 Pisici clonate

Donor Mama surogat si clona (CC)

Din 87 de implanturi, doar CC a ajuns sa se nasca

Rainbow & CC
 Clone transgenice

O pisica transgenica clonata, exprimand o proteina

fluorescenta de culoare rosie
 Idaho Gem, primul asin clonat

mama
surogat
(cal)

prima incercare - 134 implantari - 2 sarcini, ambele

cu avort
a doua incercare - 113 implantari - 14 sarcini, o
nastere
PPL Therapeutics - 2000
Purcei purtatori ai unei copii represate a genei alfa 1,3
galactozil transferazei (GT), enzima implicata in rejectia de
organe
 Clonarea ca alternativa la conservare
valabila pentru specii aflate in pragul disparitiei (?) sau
disparute
Mamut (?)
Bucardo Gaur
Noah, o clona de Banteng creata de Advanced Cell
Technologies
Bantengul este o specie de bovide salbatice din SE Asiei
Clona a fost creata pornind de la tesut congelat provenit de la
un animal care a murit in 1980
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/cloning.success.jpg
-anomalii genetice
-unele clone prezinta malformatii cardiace
- numeroase clone sufera de sindromul puiului de mari
dimensiuni (large offspring syndrome (LOS)

pui normal de soarece pui clonat, suferind de LOS