FERTILIZAREA IN VITRO

Curs MBR 2022 –

CONF. DR. Stefan CIORNEI

 BIOTEHNOLOGIILE DE REPRODUCŢIE

➢reprezintă ansamblul metodelor, procedeelor sau operaţiilor care se

folosesc pentru obţinerea în condiţii optime, a UNOR NOI GENERAŢII
DE ANIMALE
➢ameliorarea într-un ritm accelerat a efectivelor de animale şi a stării lor de
sănătate, în condiţiile reducerii preţului de cost/unitatea de produs
➢însămânţarea artificială;
➢transferul de embrioni;
➢fecundaţia in vitro
➢ clonarea
➢sexarea embrionilor
➢transgeneza- obținerea animalelor transgenice
Transferul de embrioni

❖se practică cu scopul multiplicării descendenţei femelelor cu înalt

potenţial genetic peste posibilităţile naturale ale speciei,
❖ introducererea de noi genotipuri prin importul de embrioni congelaţi
❖asigurarea unei bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de
cercetări fundamentale în reproducţia animalelor şi biologia celulară.
❖îmbunătățirea fondului genetic
❖obținerea unor modele animale (transgenie) pentru aplicații biomedicale
Clonarea

-reprezintă crearea unei copie

identică genetic a unui original
-presupune lipsa aportului
genetic masculin la conceptie
-orice celula adulta
-Enucleere
-Electroporare, micromanipulare
-Transfer la femele receptoare
-fenotipul precum si genotipul
celui care a donat celula adulta
 FERTILIZAREA IN VITRO –IN VITRO FERTILIZATION
IVF

➢este o tehnologie bine stabilită cu o multitudine de aplicaţii în practică

➢ se bazează pe producţia de embrioni utilizaţi pentru cercetare, pentru
tratarea infertilităţii la oameni şi animale, pentru creşterea productivităţii la
animalele de fermă şi pentru protejarea speciilor periclitate
➢ pentru majoritatea speciilor, protocoalele de IVF sunt disponibile şi oferă
cantităţi mari şi suficiente de ovule fertilizate, ducând la o producţie de
embrioni viabili care se pot dezvolta într-un produs de concepţie normal după
transferul la femelele receptoare
➢originile fertilizării in vitro se regăsesc încă din anul 1878
➢primele studii care atestă succesul fertilizării in vitro la om
s-au publicat în anul 1969 - IVF cu spermatozoizi capacitaţi
➢în prezent se încearcă punerea la punct a unui protocol
IVF a ovocitelor bovine și umane care să ducă la obţinerea
de embrioni viabili ce vor putea fi transferaţi la femelele
receptoare
 pregătirea corespunzătoare a
Succesul IVF
materialului seminal
ovocitei
respectarea condiţiilor de
cultivare (activitatea metabolică
a gameţilor )
Protocol IVF :

tehnica de recoltare a ovocitelor

aprecierea morfologică a ovocitelor recoltate (clase de
calitate)
metodele de cultivare pentru maturarea ovocitelor (medii
de cultura și condiții) + evaluare post cultivare
capacitarea spermatozoizilor (medii+tehnici)
fertilizarea ovocitelor (medii+ condiții)
cultivarea (medii de cultură+microclimat)
transferul (receptoare)
 Colectarea ovocitelor

Endoscopic -
Animale în viață Animale sacrificate

Ovum pick-up Aspirare

Mărunțire
Transvaginal oocyte retrieval – ecoghidat transvaginal
Recoltarea ovocitelor bovine de la animalele
sacrificate

sursă importantă de ovocite

rata de recoltare a ovocitelor ˃ovarele din abatoare

trebuie transportate în anumite condiţii la laboratoare

perioada de timp de la sacrificare

temperatura de păstrare

mediul de transport
factori cheie care influenţează atât
calitatea ovocitei cât şi capacitatea
de fertilizare şi dezvoltare in vitro
!!!!!!!!!!! Bovine
recoltare ovarelor la 10 min. după sacrificare

păstrare în containere sterile ce conţin soluție salină

(PBS) 35oC-36oC suplimentată cu 100μm/ml
streptomicină şi 100 UI penicilină

recoltarea ovocitelor maxim la 6 ore de la sacrificarea

animalelor (scăderea potenţialului de dezvoltare a
ovocitelor)
Metodele utilizate pentru recoltarea ovocitelor de vacă
din ovarele animalelor abatate sunt:

recoltarea ovocitelor bovine prin secţionarea foliculilor

recoltarea ovocitelor bovine prin mărunţirea ovarelor

recoltarea ovocitelor bovine prin felierea ovarelor

recoltarea ovocitelor bovine prin aspirarea foliculilor

recoltarea ovocitelor bovine prin transiluminarea

ovarului.
1. Recoltarea ovocitelor prin secţionarea
foliculilor

Secţionarea foliculilor vizibili

pe suprafaţa ovarului cu
ajutorul unei lame fine de
bisturiu.

Eliberarea complexelor
ovocită -cumulus (COCs)
Mediu de cultură
Rata de recoltare a
ovocitelor prin această
tehnică este destul de
scăzută (25 – 28%).
Recoltarea ovocitelor bovine prin mărunţirea ovarelor

La bovine, această metodă poate fi

folosită în combinaţie cu secţionarea
foliculilor.

Dezavantajul metodei constă în

procentul destul de redus de ovocite cu
cumulus compact (14%) apte pentru
maturarea şi fertilizarea in vitro
 Recoltarea ovocitelor bovine prin felierea ovarelor

Ovarul este tăiat în felii cu ajutorul

unui bisturiu, recoltându-se conţinutul
fiecărui folicul descoperit în
profunzimea ovarului.

Rata de recoltare prin felierea ovarului

este destul de mică, doar 17% din
ovocite prezentând cumulus intact şi
fiind apte pentru maturarea
Recoltarea ovocitelor bovine prin aspirarea foliculilor

➢ace cu diametru de 18g, ataşate la o seringă sau la un

sistem de aspirare
➢PBS suplimentat cu 3% ser fetal
➢numărul ovocitelor este influenţat de mărimea
foliculilor.
➢rata cea mai mare de recoltare s-a obţinut la aspirarea
foliculilor cu diametru de 6 – 10 mm, rata de recoltare
fiind de 58,4% (Machatkova M. şi col., 2004)
➢ foliculii prea mici (2 – 3 mm) conţin cantităţi reduse de
lichid folicular, aspirarea ovocitelor realizându-se dificil,
cu rezultate slabe
 Recoltarea ovocitelor bovine prin transiluminarea ovarului

➢ cea mai nouă metodă de recoltare a

ovocitelor de vacă a fost pusă în practică de
Arav A. în 2001, care tinde să înlocuiască
metodele uzuale de recoltare (aspirarea şi
secţionarea foliculilor de suprafaţă).
➢ procentul ovocitelor recoltate prin metoda
aspiraţiei şi secţionării foliculilor variază între 5
– 10 ovocite/ovar depinzând de ciclul estral,
vârsta animalului, număr de lactaţii, starea de
sănătate a animalului şi îndemânarea
operatorului.
introducerea printr-o incizie la
nivelul hilului ovarian a unei
sonde prevăzută în vârf cu o
sursă de lumină rece.

ovarul este luminat uniform,

fiind vizibili atât foliculii din
profunzime cât şi cei de la
suprafaţă.

toţi foliculilor cu diametru mai

mare de 5 mm se aspiră.
 Recoltarea ovocitelor bovine de la animalele vii

Metoda de recoltare laparascopică a ovocitelor bovine

➢Prelevarea ovocitelor prin laparotomie pe linia albă

➢Recoltarea ovocitelor prin laparotomie în flanc

Dezavantaj - metodă afectează

starea de sănătate a animalului,
putând apărea complicaţii în
urma operaţiei de laparascopie
Tehnicii de aspirare transvaginală a foliculilor ecoghidată -
Ovum pick-up (OPU)

✓metodă este cel mai des utilizată pentru recoltarea ovocitelor de

la animalele vii
✓ poate fi repetată fără să aibă efecte negative asupra ovarelor şi
asupra ciclităţii normale a femelei .
➢ sistem de ghidare a acului cu care se face puncţia
➢ sonda sectorială/lineară
➢ ecograful.

Acul este ataşat la un tub de silicon care trece printr-un tub de

oţel inoxidabil lung de 60 cm ɸ 6 mm la care se ataşează tubul de
recoltare a lichidului folicular.
Sonda ecografului şi sistemul de ghidare sunt plasate într-un
tub de oţel inoxidabil, care este prevăzut cu un mâner pentru a
permite operatorului să fixeze dispozitivul OPU
 Tehnica recoltării:
❖ tranchilizarea animalelor
❖ anestezia epidurală
❖ introducerea sondei ecografice în vagin pentru vizualizarea ovarului, a
foliculilor, stabilirea stadiului lor de dezvoltare şi ghidarea acului de
puncţie care esteataşat sondei ecografului şi cuplat la o pompă aspirantă cu
vacuum
❖cu sonda ecografului care este introdusă împreună cu
sistemul de ghidare a acului transvaginal se vizualizează
pe ecograf ovarul cu foliculii în diferite stadii de
dezvoltare
❖acul de puncţie poate fi ghidat şi introdus în folicul de
unde se aspiră conţinutul folicular împreună cu ovocitele
 Colectarea ovocitelor
La rumegatoaqrele mici

Animale în viață Animale sacrificate

Ovum pick-up Aspirare

Mărunțire
Recoltarea ovocitelor ovine de la animalele sacrificate

Recoltarea ovocitelor prin secţionarea foliculilor

Recoltarea ovocitelor prin aspirarea foliculilor
Recoltarea ovocitelor prin felierea ovarelor

Animale în viață

➢Metoda de recoltare prin laparatomie a

ovocitelor ovine
➢Metoda de aspirare a foliculilor prin
laparascopie (laparoscopic ovum pick up -
OPU).
Recoltarea ovocitelor prin metoda de
laparatomie
 Colectarea ovocitelor
la iepuri

Animale în viață Animale sacrificate

Ovum pick-up Aspirare

Mărunțire
Recoltarea ovocitelor de iepuroaică – animale în viață
Recoltarea ovocitelor de iepuroaică – animale sacrificate
 Criterii de recoltare si apreciere a ovocitelor

➢ numărul ovocitelor este influenţat şi de mărimea foliculilor de

unde sunt aspirate
➢ 4 categorii de foliculii în funcţie de mărimea lor:
• < 5 mm;
• 6 – 10 mm;
• 11 – 15 mm;
• > 16 mm
➢ rata cea mai mare de recoltare s-a obţinut la aspirarea
foliculilor cu diametru de 6 – 10 mm
➢ foliculii prea mici (2 – 3 mm) conţin cantităţi reduse de lichid
folicular, aspirarea ovocitelor realizându-se dificil,
➢ în foliculii > 16 mm ovocitele au abilitate scăzută de dezvoltare
ulterioară şi fertilizare – atrezie foliculară
APRECIEREA OVOCITELOR RECOLTATE
 APRECIERII INTEGRITĂŢII ŞI VIABILITĂŢII
OVOCITELOR

✓aspectul zonei pelucida: sfericitatea, grosime, integritatea;

✓aspectul cumulusului ooforus: număr straturi de celule,
compactare, expansiune
✓aspectul citoplasmei: textura citoplasmei, prezenţa
vacuolelor, granulaţia, opacitatea, omogenitatea;
✓aspectul spaţiului perivitelin: prezenţa celulelor detaşate,
grosimea, uniformitatea
✓aspectul ovocitei : forma generală, regularitate, opacitate,
diametru
Categoria de Caractere morfologice Imagini ovocite
calitate

Calitate bună Cumulus compact cu multe

straturi de celule.
Citoplasmă fin granulată, deasă.
Diametrul ovocitei: >120µm
Cumulus compact cu multe
Calitate straturi de celule.
intermediară Citoplasmă granulată, cu
prezenţa de vacuole mici.
Diametrul ovocitei:100 - 115µm
Cumulus parţial sau total
Calitate slabă expandat, culoare închisă.
Citoplasmă cu pete negre şi
agranulată, neomogenă.
Diametrul ovocitei: <100µm

Calitate foarte Ovocită degenerată, cu zona

slabă pelucida spartă.
Diametrul ovocitei: 30-80µm
 Clasificare

Clasa A: cumulus-oocyte-complexes Compact (COCs)

with an unexpanded cumulus mass having ≥4
layers of cumulus cells, and with homogenous
evenly granular ooplasm

Clasa B: COCs with 2-3 layers of cumulus cells and a

homogenous evenly granular ooplasm

Clasa C: Oocytes partially or wholly denuded or with

expanded or scattered cumulus cells or with an
irregular and dark ooplasm
OVOCITE CULTIVABILE
•- prezentă cumulus compact în jurul ovocitei,
multistratificat (cel puţin două – trei straturi)
• citoplasmă omogenă, uşor granulată
• membrană pelucida intactă, fără distrucţii sau rupturi
•spaţiu perivitelin uniform

OVOCITE NECULTIVABILE
•denudări parţiale sau totale
• citoplasmă heterogenă, deformată, puternic granulată
•zona pelucida ruptă şi spaţiu perivitelin neuniform
MATURAREA OVOCITELOR
 La majoritatea mamiferelor, ovocita matură eliberată de la nivelul
folicului ovarian matur este înconjurată de două formaţiuni
reprezentate de cumulus ooforus şi de ZP pe care spermatozoidul
trebuie să le străpungă pentru a se fixa şi fuziona cu oolema
Celulele cumulus rol - maturarea ovocitelor, fertilizarea şi
reînceperea meiozei
-în perioada preovulatorie sintetizează cantităţi crescute de acid
hialuronic care se organizează între celule pentru a forma matricea
mucoelastică cu rol de a facilita extruzia ovocitei din folicul în
momentul ovulaţiei
 celulele cumulus au efecte benefice asupra fertilizării prin:
➢ atragerea şi selecţia spermatozoizilor;
➢ facilitatea capacitării, reacţiei acrosomică şi penetrarea
spermatozoizilor;
➢ prevenirea rigidizării (întăririi) precoce a zonei pelucida.
➢ selectează spermatozoizii normali din punct de vedere morfologic şi
îi reţine pe cei necapacitaţi şi fără reacţie acrozomială
 MATURAREA OVOCITEI

modificări nucleare --------------------------------citoplasmatice

Parametrii morfologici care se iau în considerare pentru
evaluarea maturării citoplasmatice sunt:
-expansiunea cumulusului
- creşterea spaţiului perivitelin,
- redistribuirea organitelor celulare (granulele corticale,
mitocondriile, aparatele Golgi şi reticulul endoplasmatic)

Modificările biochimice şi metabolice includ activarea

capacității de a decondensa cromatina spermatozoidului şi
capacitatea de a depozita ARNm
 Tehnica

Manipularea

- pipete sterile de sticlă ɸ 50-180 µm,

-evitarea distrucţiilor mecanice la

nivelul celulelor cumulus OC
- straturi compacte de celule cumulus,
citoplasmă granulată uniformă şi
membrană pelucida intactă
-ONC - denudări parţiale sau totale,
cele cu ovoplasma heterogenă,
deformată - incapacitate de proliferare
Ovocite cultivabile20x

Ovocite necultivabile 20x

MATURAREA OVOCITELOR
 PROTOCOLUL DE MATURARE

Medii utilizate la maturarea

două categorii: medii simple şi medii complexe

Mediile simple
-bicarbonat
-PBS
-piruvat, lactat
-glucoză
-suplimentate cu ser sau albumină serică bovine (BSA)
-antibiotice (penicilină, gentamicină, streptomicină)
-antimicotice
Mediile complexe
▪componentele de bază
▪aminoacizi
▪ vitamine
▪Hormoni
▪Factori de creștere
▪Lichid folicular
 Lichidul folicular

➢ ser translucid, care conţine constituienţi specifici reprezentaţi în

special de steroizi şi glicoproteine sintetizate de celulele foliculare
➢ utilizarea lichidului folicular (FF) ca substituent al serului în mediul
de maturare in vitro asigură dezvoltarea embrionară indiferent de mărirea
foliculilor din care provine
➢ concentraţia FF utilizată în mediile de maturare poate influenţa
maturarea meiotică a ovocitei
➢ concentraţii de 60% sau mai mari au un efect inhibitor în special
asupra maturării nucleare, prin blocarea ovocitei în stadiul de veziculă
germinală şi a metafazei I, ceea ce determină degenerarea ovocitelor
➢ 10-15%
 Serul fetal (FBS)

➢ completează şi favorizează maturarea prin influenţa pe care o are atât

asupra maturării citoplasmatice cât şi asupra celei nucleare
➢ efecte stimulatoare - numeroşi factori pe care îi conţine, printre care:
factori de creştere, lipide, albumine, hormoni, steroizi, colesterol, peptide
➢ au încercat înlocuirea serului fetal bovin cu lichid oviductal sintetic
(SOF) care conţine şi aminoacizi şi care susţine maturarea şi dezvoltarea
embrionară iniţială
➢ în prezent se încearcă înlocuirea serului fetal bovin cu polivinilalcoolul
(PVA) sau polivinilpirolidona (PVP)
 CONDIȚIILE MEDIILOR DE CULTURA

➢ principalii ioni minerali: Na, K, Mg, Cl, PO4, SO4, HCO

➢ condiții optime: osmolaritatea: 280-310 miliOsm
➢ pH 7,2-7,4
Sursa energetică :
Glucoza 1 mg/ml şi de piruvat de sodiu, lactat sau acetat,
vitamine, acizi aminaţi.
Sursa proteică :
➢BSA și FCS
➢există tendinţa de a înlocui serul cu preparate sintetice cu
aceleaşi efecte - Ultroser G® şi CPSR-3®
Factori de protecţie :
➢ antibiotice (penicilină, streptomicină)
➢ antimicotice
•TCM 199 cu L-glutamină, 25mM HEPES, 10-20% FCS;
•Ham’s F-12, DMEM (Dulbecco’s modification of Eagle’s medium)
•MEM (minimum essential medium)
•SOFb (lichid oviductal bovin sintetic)
•TALP, Menezo’s B2, Waymounth 752/1
•KSOM
•DMEM/F12

5-10 ovocite sunt puse în picături de 100μl

în mediul de maturare sub ulei mineral
steril embriologic testat
EVALUARE MICROSCOPICĂ!!!!
Bovine

Compoziţia mediului de bază

COMPONENTE
Mediul TCM 199 45 ml
Ser fetal bovin (FCS) 10%
Piruvat de sodiu 500µl
Pen Strep pulbere 500 µl
+ LH, FSH, estradiol, vitamina A, NEA, AE, L-Cysteine
+ medii de condiționare – celule somatice, LF, explant
oviductal
+mediul SOF
Medii pe bază de HEPES – Sydney IVM medium
Ovine

TCM-199 – suplimentat cu 10% FCS, 1%AA

TCM-199 cu Earle’s salt, L-glutamine și 25 Mm Hepes;

suplimentat cu piruvat (0.2 mM), FSH (0.5 μg/mL), LH
(5 μg/mL), penicilin (100 IU/mL) streptomicin sulfate
(100 μg/mL) 26 h (ovocit cu primul globul polar)

TCM 199b, 10-20% FCS, 10µg/ml FSH, 10µg/ml LH,

1µg/ml 17β estradiol
Ovocite de scroafă

I - Mediul Tyrode suplimentat cu 1000 UI eCG (equine

chorionic gonadotrophin, 1000UI hCG – 22h
II - TCM 199 sau NCSU 23 (mediu fără BSA)
suplimentat cu 0,57mmol cisteină, 10% lichid folicular
(foliculi 3-5 mm) 22h - 39°C
 Ovocite umane

Mediul Ham´s F10 suplimentat cu 0,75 u.i. LH, 0,75 u.i.

FSH, 40% HFF
37°C, 5%CO2, 95% umiditate
 CONDIŢII DE CULTIVARE

➢concentraţia de 5% O2, 5% CO2, 90% N2;

➢umiditatea relativă de 95 – 100%;
➢osmolaritatea mediului 290 mOsm;
➢pH = 7,4;
➢temperatura = 37 - 38,5 – 39°C
 OVOCITE MATURE – SCHIMBĂRI MORFOLOGICE

➢expansiunea cumulusului
➢apariţia primului globul polar
➢mărimea spaţiului perivitelin
➢modificările citoplasmatice caracterizate prin
clarificarea periferică şi condensarea centrală
citoplasmatică

Ovocitele imature
➢un spaţiu perivitelin îngust între ooplasmă şi
zona pelucida
➢nucleu sferic cu o slabă condensare a
cromatinei
➢aglomerări periferice ale granulelor corticale
➢celulele cumulus sunt dispuse sub forma unor
straturi dense în jurul ovocitei
 FACTORI CARE INFLUENŢEAZĂ MATURAREA

• gonadotropinele (FSH, LH) - reglează maturarea nucleară

• hormonul luteinizant LH - îmbunătăţeşte calitatea ovocitelor
• FSH - influenţează pozitiv dezvoltarea embrionară
• estradiolul - ajută la finalizarea proceselor de maturare ce au loc în
ovocită
• serul fetal - îmbunătăţeşte competenţa meiotică prin favorizarea maturării
nucleare şi citoplasmatice
• factori de creştere -favorizează reluarea meiozei
 Factorii care influenţează calitatea succesul maturării

➢viteza de lucru

➢timpul scurs de la recoltare -----prelucrare (maxim 3-4 ore)

➢calitatea mediului de transport – temperatura!!!!!!!!!

➢condiții de tranport – evitarea contaminării, evitarea scimbărilor de

temperatura!

➢prelucrarea în condiții de sterilitate

➢calitatea apei utilizat la prepararea mediilor

➢--- microscop cu placuță încălzitoare

➢calitatea uleiului folosit - pentru evitarea evaporării mediului-

embriologic testat! - !!!! Filtrat steril

➢prevenirea şocurilor termice prin preîncălzirea instrumentarului,

plăcilor

➢preîncălzirea mediilor, soluției saline la 37°C;

➢Condiții de cultivare - embrionii cultivaţi în grupuri şi într-un volum

mic de mediu se dezvoltă mai bine decât cei cultivaţi individual şi în

volume mai mari – 10µl/ovocit

➢co – cultură cu celule cumulus care au un efect benefic asupra

morfologiei embrionului supus cultivării

 Clasificarea ovocitelor post maturare – 24 h

Ovocite mature excelente– OME

diametrul ˃120µm
citoplasma omogenă
cumulus expandat
grosimea cumulus peste 50µm
prezența primului globul polar
ZP intactă
ZP 13-14 µm
spațiu perivitelin uniform
Ovocite mature bune – OMB

diametrul 110 -120µm

citoplasma omogenă
cumulus expandat
grosimea cumulus 40- 50µm
prezența primului globul polar
ZP intactă
ZP 13-14 µm
spațiu perivitelin uniform
Ovocite imature– IMO
diametrul ˂100µm
citoplasma ușor granulată
cumulus neexpandat
grosimea cumulus sub 20µm
Inexistența globulului polar
ZP intactă
ZP 10-12 µm
spațiu perivitelin uniform
Ovocite degenerate– DO
diametrul ˂100µm
citoplasma granulată, retratctată
cumulus denudat parțial/total
ZP ruptă
ZP sub10 µm
spațiu perivitelin neuniform
Pregătirea materialului seminal

reprogramarea funcţională
completă - la nivelul tractusului
genital femel – in vivo
Capacitarea – înainte de penetrarea spermatozoizii trebuie să
prezinte motilitate crescută și capacitate de a secretare enzime
proteolitice la nivel acrozomial
- În mod fiziologic – oviduct și uter – vacă 6-7 h, iapă 6 h,
oaie 1-2h, scroafă 3-6h, iepuroaică 5h, șoareci, șobolani 3 h,
femeie 5-6h
lipoproteinele cu densitate crescută – accelerarea efluxului
colesterolului
creştere a metabolismului prin activarea glicolitică şi sporirea
consumului de oxigen
-modificărilor biochimice : modificări în compoziţia lipidică de
la nivelul membranelor - reorganizarea membranei spermatice,
rearanjarea proteinelor spermatice
- modificari metabolice - proacrozomul inactiv enzimatic din
acrozomul spermatozoidului este acoperit de un acrozin activat
enzimatic
activarea este realizată de glicosaminoglicanii fluidului uterin
care stimulează conversia proacrozinului în acrozin
- modificări de pH şi creşterea permeabilităţii membranare
pentru anumiţi ioni (Ca2+ ↑)↑cAMP ↑motilitatea
-tripeptide FPP (fertilization promoting peptide) – mascul↑
inhiba capacitarea - ↓ amestec secretii vaginale
-Locul - variază în funcţie de locul
depunerii materialului seminal în
momentul montei
- La speciile unde depunerea este
vaginală, capacitarea poate începe
în momentul în care spermatozoizii
trec prin cervix sau prin mucusul
cervical
- La speciile unde depunerea se
face direct în uter, locul capacitării
este oviductul.
 plasmă seminală,spermatozoizi
maturi și imaturi, celule non
In vitro reproductive, microorganisme,
detritusuri
Separarea spermatozoizilor de plasma seminală

➢metode prin care spermatozoizii sunt purificaţi şi pregătiţi

pentru protocolul de fertilizare-, spălare simplă, metoda
Swim-up şi metoda Percoll , incubare cu Pentoxifylline
➢Rata de recuperare, motilitatea, morfologia, gradul de
degraderae a ADN depinde de procedura utilizată

BSA
1. Cafeina
Heparina
 Incubare- 60 minute cu
Tyrode's medium
2.
3. Metoda Percoll 1000 x g pentru 10 minute
 Incubare cu Pentoxifylline

Material seminal+ Pentoxifilină 1:1

Centrifugare 200 g 5 minute
Resuspendarea peletului cu mediu
de cultura și utilizare
FERTILIZAREA
➢fertilizarea reprezintă procesul de fuziune a gametului ♀ cu
cel ♂ având ca rezultat un nou organism.
➢deşi pare a fi un proces unietapizat, cercetările în domeniu
au stabilit că procesul fertilizării este constituit din mai multe
etape care interacţionează şi se condiţionează unele pe
celelalte
 ETAPELE FERTILIZĂRII

•penetrarea complexului cumulus de către spermatozoizi;

•interacţiunea spermatozoidului cu zona pelucida;
•penetrarea zonei pelucida;
•fuziunea spermatozoidului cu oolema;
•reluarea meiozei de către ovocită;
•formarea pronucleilor.
 Perioada în care cei doi gameţi îşi menţin capacitatea fecundantă după
eliberarea lor din organele generatoare este destul de redusă, fapt ce impune
sincronizarea exactă între inseminare şi ovulaţie
Durata capacităţii de fertilizare a celor doi gameţi diferă în funcţie de
specie
• 28 – 50 ore pentru spermatozoizii de taur;
• 22 – 24 ore pentru ovulele de vacă;
• 144 ore pentru spermatozoizii de armăsar;
• 24 ore pentru ovulele de iapă;
• 30 – 48 ore pentru spermatozoizii de berbec;
• 15 – 24 ore pentru ovulele de ovine.
 Fertilizarea ovocitelor include o serie de evenimente
succesive în care spermatozoizii:
➢ trebuie sa fie mobilă pentru a ajunge la ovocită şi pentru a
penetra învelişul acesteia;
➢ să aibă abilitatea de a începe capacitarea şi de a manifesta
reacţie acrozomială;
➢ să aibă capacitatea de a se ataşa de zona pelucida (ZP) şi
de membrana vitelină a ovocitei prin dobândirea proteinelor
de legătură în timpul maturării;
➢ să aibă abilitatea de a fuziona cu oolema şi de a se
încorpora în ovocită;
Medii utilizate la fertilizarea

❖Fert Talp cu 20 μg/ml heparină (Sugiyama S. şi col., 2003);

❖Fert Talp cu 30 μg/ml heparină, 6 mg/ml BSA, 0,022 mg/ml
piruvat de Na (Brum D.S. şi col., 2005);
❖Tyrode’s balance salt solution cu 10 μg/ml heparină, 6
mg/ml BSA, 10 μg/ml gentamicină sulfat, 10 mM lactat de
Na, 0,2 mM piruvat de Na, 25 mM NaHCO3 (Tanghe Sofie,
2003);
❖Talp +PS+BSA
❖SOF cu 20 μg/ml heparină, 7 mg/ml BSA, 5 mM taurină, 1
mM glutamină, 0,5 mM acid piruvic (Iwata H. şi col., 2004);
METODE DE FERTILIZARE
 1. Cocultivarea
ovocite maturate in vitro Material seminal

Capacitarea

Incubarea cu 1-2 milioane/ml

Spermatozoizi pentru 18 h

Presupusul zigot spălat cu mediu de cultură

PROTOCOALE DE FERTILIZARE

COCULTIVAREA
COCs - în picăturile de mediu (10 – 15 ovocite/picătură)

Echilibrare - 3 h

+
7 μl (concentraţie de 2 x 106 spermatozoizi/ml)

38,5OC, 5% CO2, 6,7% O2, 100% umiditate, timp de 24 ore

Sau 15 – 20 ovocite/picătură şi 1 x 106 spermatozoizi/ml --24

ore
fixare prin intermediul receptorilor la o glicoproteină sulfatată de
la nivelul zonei pelucida numită ZP3 care - induce reacţia
acrozomială și asigură fixarea spermatozoidului
➢traversarea zonei pelucida se realizează oblic, într-un interval
ce variază între 5 – 20 minute
➢digestia din aproape în aproape a zonei pelucida cu ajutorul
acrozinei şi a mişcărilor exacerbate ale cozii spermatozoidului
➢Fuzionare oolema, pronucleul mascul, femel
2. INJECTAREA
INTRACITOPLASMATICĂ A
SPERMATOZOIDULUI ÎN OVOCITĂ -
ICSI

▪reprezintă una dintre metodele de fertilizare asistată,

constând în plasarea directă a spermatozoidului în
citoplasma ovocitei
▪această metodă, barierele normale de penetrare de către
spermatozoid, incluzând matricea de acid hialuronic a
celulelor cumulus, zona pelucida şi membrana plasmatică a
ovocitei sunt ocolite
▪ tehnica ICSI poate ajuta la depăşirea problemelor asociate cu
penetrarea ovocitei de către spermatozoid

Micromanipulator!!!!!!!!!!!!!
1. Pregătirea ovocitei – denudarea - 1mg/ml hialuronidază
2. Prepararea spermatozoizilor cuantificare, capacitare
3. Pregătirea fixării ovocitei şi a pipetelor de injectare
pipetele pentru fixarea ovocitei sunt tuburi capilare din sticlă
borosilicată cu diametrul intern şi extern de 40 μm şi
respectiv 180 μm.
Interiorul pipetei cu care se aspiră spermatozoidul se spală
de câteva ori cu soluţie 25% de acid hidrofluoric, apoi clătite
cu apă distilată şi uscate.

4. Injectarea spermatozoidului
Disecția zonală parțială (PZD)

-facilitarea
penetrării
spermatozoizilor
prin efectuarea
unei incizi la
nivelul ZP
-Oligospermie
-Acid Tyrode
Metoda de injectare subzonală a spermatozoizilor (SUZI)

Injecare in spațiul
previtelin
Aprecierea morfologică a ovocitelor după fertilizarea

Ovocită fertilizată Ovocită cu polispermie

(2 globuli polari şi (3 pronuclei) şi globuli
2 pronuclei) polari degeneraţi
Cultivarea embrionilor – in vitro

Spalarea ??? zigot

Plasare picături de 50-100 μl IVC /10-15

Cultivare 7-9 days in IVC medium

(5% CO2 in air,90-95% humidity) la 38.5°C
 Sisteme de cultivare in vitro

Mediu complex cu Mediu simplu

celule somatice adaugate
Stadii embrionare pe parcursul segmentării

Stadiul timpuriu al clivajului embrionar - cuprinde

procesele de segmentare de la 0 la 8 blastomere

examenul morfologic: numărul de celule prezente, forma,

simetria, mărimea acestora.
Stadiul de morulă tânără: încadrarea se face pe baza
aspectului blastomerelor şi a numărului lor

În acest stadiu, blastomerele se prezintă sub forma unor

aglomeraţii sferice ce păstrează conturul individual al fiecărei
celule, spaţiul perivitelin fiind bine evidenţiat
Stadiul de morulă compactă: încadrarea se face pe baza
aspectului compact al blastomerelor, fapt ce determină
imposibilitatea delimitării celulelor unele de celelalte. În acest
stadiu, embrionul ocupă 60 – 70% din spaţiul delimitat de
membrana pelucida.
Stadiul de blastocistul tânăr (timpuriu) se bazează pe
evidenţierea apariţiei cavităţii lecitocelice care ocupă 50 –
60% din spaţiul intern al zonei pelucida

Se poate observa o uşoară diferenţiere între trofoblast şi ICM

care apar mai compacte.
Stadiul de blastocist matur: se face pe baza observării
trofoblastului care devine mult mai vizibil, ICM devine mai
compactă, de culoare închisă
 ZP

CL

ICM
PEmoke
Stadiul de blastocist expandat: extensia blastocistului, cu
modificarea diametrului de la 150 – 190 microni la 1,2 mm

ZP se subţiază foarte mult ajungând la o treime din grosimea

anterioară de 1 – 15 microni, fapt datorat sporirii numărului
de celule (de la 70 la 180).
✓Blastocist eclozionat: zona rupta
partial sau total și ecloziunea
Embrionilor degeneraţi:

embrionii cu modificări morfologice clare, reprezentate de

apariţia în număr mare a blastomerelor izolate cât şi a
vacuolizărilor citoplasmatice însoţite uneori de apariţia unor
procese de degenerescenţă celulară şi modificări la nivelul
membranei pelucida (fisuri, fragmentări, deformaţii)
Criteriile de evaluare a embrionilor
 Clasificarea embrionilor
EMBRIONI EXCELENŢI (nota 5);

perfect sferici, simetrici;

cu blastomere poligonale uniforme;

vezicule citoplasmatice uniforme;

citoplasma agranulară;

spaţiul perivitelin liber, cu diametru regulat.

EMBRIONI BUNI (nota 4);

sunt asemănători cu cei din clasa 5, dar sunt asimetrici, cu

unele celule separate de masa compactă.
EMBRIONI MIJLOCII (mediu) (nota 3);
cuprinde embrioni retardaţi cu o zi, cu blastomere
sferice, de mărime variabilă, uneori putându-se
evidenţia vezicule intracelulare în număr redus.
EMBRIONI SLABI (nota 2);
cuprinde clasa embrionilor cu dezvoltare retardată cu
2 zile, cu limitele celulare nedistincte.
EMBRIONI NECORESPUNZĂTORI (nota 1);
embrioni degeneraţi, cu vacuole intercelulare, zona
pelucidă ruptă, uşor deformată.
 Stadiul embrionar Zile estimativ in vivo
Vacă Bivol
Morula 5 4
Morulă compactă 6 5
Blastocist tânăr 7 6
Blastocist 7 6
Blastocist expandat 8 7
Blastocist eclozionat 9 7.5 - 8
4d 72h
48h
5d

48h
7d 8-9d 10d

Identificarea embrionilor pe baza aspectelor morfologice

(după Groza I. şi col., 2005; Ciupe Simona, 2004)
 Poliovulare Principiile IVF
Ovare - abator
Female

Recoltare ovocite

Maturare Cocultivare
SUZI, ICSI,PZD Cultivare
embrioni
Capacitare

Colectare
Transfer

MS
Masculi
CRIOCONSERVAREA
EMBRIONILOR
Crioconservarea embrionilor

tehnicile de congelare au evoluat în direcţia simplificării

etapelor de lucru, reuşindu-se să se dezvolte metode
rapide, uşor utilizabile în producţie.

avantajele crioconservării embrionilor au un impact

asupra selecției si ameliorării efectivelor de animale

transferul de embrioni – facilitarea transportului

Conservarea prin congelare - procese fizico-chimice de transport al apei şi

temperaturii între embrion şi mediul de conservare - supravieţuirea fiind

condiţionată de prezenţa substanţelor crioprotectoare, în concentraţii de 1-

2 M, adăugate în mediul de conservare.

Viteza de conservare trebuie să fie foarte rapidă pentru a se putea evita

formarea de noi cristale (recristalizarea), care prin acţiunea mecanică

produc şi întreţin leziuni ireversibile pentru celulă.

agentul crioprotector, concentraţiile crioprotectantului, viteza de răcire,

viteza de decongelare şi modul de eliminare a crioprotectorului

Agenţii crioprotectori
Intracelulari – reprezentaţi de substanţe cu greutate moleculară mică
(alcooli), care asociate cu moleculele de apă pătrund în interiorul celulei:
dimetilsulfoxidul (DMSO), glicerolul, metanolul şi etilenglicolul. Prin
dislocarea unei cantităţi determinate de apă şi asocierea cu aceasta,
crioprotectorul scade punctul de cristalizare, diminuă cantitatea şi natura
cristalelor de gheaţă formate în timpul congelării /decongelării şi previne
creşterea excesivă a concentraţiei sărurilor în celule;

Extracelulari – reprezentaţi de substanţe cu greutate moleculară mică sau

mare care nu pătrund în celulă şi care îşi exercită efectul crioprotector
prin: deschiderea celulei – reprezentantul de bază fiind sucroza,
colmatarea zonelor penetrabile ale membranei în timpul congelării,
asigurând revenirea funcţiei membranei după decongelare prin lipidele pe
care le conţin.
Conservarea embrionilor

Conservarea de scurtă durată

• La temperatura de 18-20 ºC - 5 ore
• În cultură, 4 zile pe mediu sintetic de oviduct
• Refrigerarea embrionilor 0-4 ºC, 24-48 ore
– Cu adaos de ser fetal, 1-3 zile
– Conservarea in vivo, în uter de iepuroaică, 2-4 zile
Temperatura de stocare
La majoritatea speciilor domestice,
după temperatura de - 330C, - 350C,
deshidratarea celulelor este optimă,
embrionii putând fi plonjaţi direct
în azot lichid la –1960C, stocarea
realizându-se în containere cu azot
lichid, prevăzute cu suporturi
pentru stocare (canistre) .
Personalizarea paietelor şi containerelor de stocare a embrionilor

Etichetarea containerelor şi paietelor

utilizate în scopul conservării pe timp îndelungat a
embrionilor se realizează după sistemul IETS
(International Embryo Transfer Society), astfel
încât oricine să poate identifica embrionii din
fiecare recipient de stocaj.
Inscriționarea -
➢codul companiei care a congelat embrionul;
➢rasa şi numărul de înregistrare a donatoarei notat sub
forma unor abrevieri bine stabilite de IETS şi cunoscute de
toată lumea;
➢rasa şi numărul de înregistrare al taurului;
➢numărul paietei;
➢ziua recoltării notată începând cu anul, luna şi ziua;
➢numărul embrionilor din paietă.
Tehnica de congelare a embrionilor
Aparatul de congelare care se pretează
cel mai bine condiţiilor existente la
nivel de fermă este produs în S.U.A. de
către firma Cryogenetic şi are ca
principiu de funcţionare plasarea
gradată a paietelor care conţin embrioni
şi mediul crioprotector în vapori de azot
lichid, efectuarea seedingului la –6oC,
apoi răcirea treptată până la atingerea
temperaturii ce permite plonjarea în azot
lichid
 Agenţii crioprotectori recomandaţi a fi
utilizaţi sunt :

glicerolul în concentraţie de 0,47 M ;

0,94 M ; 1,4 M în PBS Vigro ;

glicerol 1,5 M în PBS Vigro ;

etilen glicol 1,5 M şi sucroză 0,1 M

(Mediul Vigro produs al firmei Minitub
din Germania)
1. Congelarea în diluţii succesive de glicerol
2. Congelarea în glicerol într-un singur pas
3. Metoda de congelare în etilen glicol 1,5 M şi
sucroză 0,1 M
1. Decongelarea embrionilor de vacă în soluţii succesive de
glicerol
2. Decongelarea embrionilor de vacă într-un singur pas cu
glicerol 1,5M
Prin aplicarea biotehnologiilor de reproductie studiate
Puteti alege / decide
3. Decongelarea :
embrionilor de vacă în etilen glicol 1,5M şi
sucroză 0,1M
 Lista studentilor care nu indeplinesc
cerintele minimale de sustinere a colocviului
la MBR

?
De revazut condica.....
Studentii isi asuma orele de curs si lucrari abesntate !
 VA MULTUMESC
Dr. Stefan Gregore CIORNEI
Conf Dr
Managementul si biotehnica reproductiei animalelor de
renta
Curs An VI Medicina Veterinara

stefan_ciornei@yahoo.com
0745573673

Succes in cariera !!!