BIOTEHNOLOGIA

ÎNSĂMÂNŢĂRILOR ARTIFICIALE
Însămânţările artificiale (ÎA) = biotehnologie de reproducţie
de generaţia I ce permite multiplicarea descendenţei unui
mascul valoros dincolo de limitele biologice ale acestuia.

Oferă avantaje de ordin :

Economic
Zootehnic –ameliorarea raselor
Medical

2
 Aspecte zootehnice ale ÎA
• utilizarea reproducătorilor cu o producţie spermatică cu indici cantitativi şi calitativi
superiori creşte ritmul şi gradul de ameliorare al efectivului de animale

• se utilizează masculi testaţi în privinţa transmiterii ereditare a unor însuşiri

morfoproductive superioare testarea reală a valorii de ameliorare

• materialul seminal congelat permite reproducerea unui mascul de mare valoare o

lungă perioadă de timp după moartea sa

• posibilitatea schimbului internaţional de gene valoroase

• testarea după descendenţi a reproducătorilor se poate aplica profilaxia genetică

a sterilităţii

• creşterea numărului de femele montate per mascul şi ejaculat

 Aspecte medicale ale ÎA
• deficienţă anatomică la unul dintre parteneri ce nu permite monta naturală (angustia
vulvară, diferenţa mare de greutate sau talie etc.)
• masculul refuză monta deoarece actul montei îi provoacă durere (afecţiuni osteo-
articulare etc.)

• dispariţia stresului de transport pentru femelă

• profilaxia şi combaterea bolilor venerice

• posibilitatea continuării reproducţiei în unităţile aflate în carantină

• reducerea şanselor de rănire pentru oricare dintre parteneri

• Sunt cazuri în care masculul şi femela nu se acceptă reciproc din pură antipatie, în
timp ce cu alţi parteneri ar fi dispuşi să se monteze;

• Caracterul dominant puternic al femelei ce atrage după sine inhibarea masculului;

• Lipsa de experienţă a unuia dintre parteneri poate face imposibilă monta naturală.
 Avantajele economice ale ÎA
• Număr crescut de fertilizări per ejaculat creşterea eficienţei masculului

• Eliminã costurile, riscurile si timpul legate de transportul femelei.

• D.p.d.v. al proprietarului masculului, dacã acesta are un an expozitional

foarte bun, inseminarea artificialã permite recoltarea spermei si
însãmântarea femelelor fãrã întreruperea activitãtilor curente.

• Materialul seminal congelat permite reproducerea unui mascul de mare

valoare o lungã perioadã de timp dupã moartea sa

• Reducerea numărului de masculi per fermă (reducerea costurilor legate de

întreţinerea acestora) organizarea reţelei de ÎA pe baza unor centre de
reproducători (SEMTEST)
Cuprinde patru etape principale :
– Recoltarea spermei
– Examenul materialului seminal
Ex. Macroscopic
Ex. Microscopic
Ex. complementare
– Diluarea si conservarea materialului seminal
• Refrigerarea
• Congelarea
– In gheata carbonica
– In azot lichid
– Inocularea materialului seminal
Reuşita ÎA depinde de 3 elemente
esenţiale
 RECOLTAREA MATERIALULUI
SEMINAL
• RECOLTAREA SPERMEI = provocarea artificială a ejaculării,
fără a avea loc actul sexual între mascul şi femelă şi fără a
se prejudicia sănătatea masculului.

• Metode de recoltare:
• 1. Recoltarea cu vaginul artificial
• 2. Electroejacularea
• 3. Masajul ampulelor canalelor deferente şi al veziculelor
seminale
• 4. Metoda manuală (masturbarea)
• 5. Metoda prezervativului (condomului)
• Indiferent de metoda de recoltare utilizata, aceasta trebuie
sa fie precedata de examenul general al masculului, inclusiv
al aparatului genital, cu efectuarea de teste specifice (ex.:
examen serologic pentru bruceloza).

• Recoltarea se poate face in prezenta unei femele aflate in

estru sau cu ajutorul feromonilor artificiali (vier, caine)

• masculii se vor folosi la recoltare după instalarea maturităţii

sexuale
• masculii trebuie dresaţi pentru recoltare
• furajare raţională
• asigurarea regimului de mişcare zilnică şi a igienei corporale
• stabilirea unui regim optim de recoltare care trebuie să ţină
seama de specie, vârsta reproducătorului şi necesităţi
 Examenul reproducătorului mascul
• Anamneza
– regimul de montă;
– comportamentul în timpul montei;
– rezultatele montelor anterioare;
– afecţiuni recente, îndeosebi ale sferei genitale;
– eventualele tratamente efectuate şi rezultatul lor;
– regimul de utilizare la muncă, sport sau
antrenament,
– performanţele individuale
 Examenul reproducătorului mascul
• Inspectia
– Generala
– Locala
– Reflexele sexuale
• Apropierea
• Erectia
• Saltul
• Intromisiunea
• Ejacularea
• Palpatia
• Ecografia testiculara si prostatica
• Examene serologice pt bolile veneriene (bruceloza,
herpesviroza etc.)
 1. Recoltarea spermei cu vaginul
artificial
 Vaginul artificial imită condiţiile de temperatură, presiune
şi lubrifiere din vaginul femelei în estru.

 Vaginul artificial este alcătuit din: carcasă cu robinet,

cămaşă din latex + inele de cauciuc, pahar colector +
protecţie.

 Metoda este folosită la taur, armăsar, berbec, vier.

• Pregătirea vaginului artificial (VA):

1. Fixarea cămăşii vaginale la corpul vaginului (având grijă să nu se

formeze cute diagonale)
2. Dezinfectarea VA
3. Introducerea apei calde la 45-50oC (temperatura locală în vaginul
femelei în călduri este mai ridicată decât cea corporală datorită
congestiei) temperatura finală a VA va fi de 40-42oC
4. Fixarea paharului colector
5. Lubrifierea cămăşii vaginale
6. Introducerea aerului
7. Verificarea temperaturii
• Recoltarea propriu-zisă cu vaginul artificial
- masculul este condus în sala de recoltare
- saltul se face pe o femelă (preferabil în călduri), manechin, sau pe un mascul
- tehnicianul recoltator dirijează penisul în VA
- după câteva mişcări de pistonare, are loc ejacularea
- masculul este scos din sala de recoltare
- tehnicianul detaşează paharul colector de VA şi îl transferă printr-o fereastră în
laborator pentru efectuarea spermogramei

• Recomandări:
- Pregătiţi 2 vagine artificiale pentru fiecare mascul
- folosiţi feromoni artificiali specifici speciei (ex.: de scroafă) în cazul în care nu
există o femelă în călduri
 2. Electroejacularea
• Principiul metodei = excitarea electrică a centrului ejaculator
situat în măduva spinării (L1-L3), urmată de contracţii ale
musculaturii netede din pereţii căilor spermatice care duc la
ejaculare.

• Se practică la: - taur (electrod endorectal bipolar),

- berbec (electrod endorectal monopolar şi
electrod lombar monopolar)
- câine (electrod endorectal bipolar)
- motan (electrod endorectal bipolar)
 Electroejacularea
• Avantaj:
• - poate fi folosită la masculii cu impotenţă de copulaţie (impotentia
coeundi)

• Dezavantaje:
- ejaculatul este inferior d.p.d.v. cantitativ şi calitativ celui obţinut cu
vaginul artificial
- deoarece ejacularea se produce în absenţa erecţiei, uneori se poate
produce ejacularea in furou sau retrogradă (în vezica urinară)
- nu poate fi utilizată la armăsar, deoarece acesta nu tolerează voltajul
- în funcţie de temperamentul masculului, poate necesita
anestezierea animalului
 3. Masajul transrectal al veziculelor
seminale şi al ampulelor canalelor
deferente
• Este o metodă practicată uneori la taur, în cazul impotenţei de
copulaţie.

• Principiul metodei = evacuarea spermatozoizilor şi a lichidelor

seminale depozitate la acest nivel, prin masajul ampulelor canalelor
deferente şi al veziculelor seminale.

• Tehnica de realizare:
- toaleta furoului, inclusiv a cavităţii prepuţiale (lavaj cu ser fiziologic)
- vidarea rectului
- se palpează şi se masează uşor veziculele seminale (situate de o parte
şi de alta a gâtului vezicii urinare)
- după apariţia unui lichid limpede, se masează progresiv ampulele
canalelor deferente (prin compresiune spre planşeul bazinului şi dirijate
cranio-caudal)
Masajul transrectal al veziculelor seminale şi al
ampulelor canalelor deferente
• Dezavantaje:
- ejacularea se produce fără erecţie, în furou posibilă
contaminare bacteriană
- în cazul masajului prea energic al gâtului vezici urinare există riscul
amestecului spermei cu urina
- necesită personal cu o înaltă calificare şi o îndemânare deosebită
- ejaculatul are un volum mare pe seama plasmei seminale
concentraţie redusă în spermatozoizi
- în momentul recoltării se produce aerarea spermei, care poate fi
dăunătoare pentru spermatozoizi

• Avantajul principal = simplitatea metodei - nu necesită nici un fel

de materiale suplimentare
- Se aplică în orice condiţii, fără amenajări deosebite
 4. Recoltarea prin metoda manuală
(masturbarea)
 se aplică la CÂINE, VIER, vulpoi

• Tehnica de realizare la VIER:

- se masează penisul prin traversul furoului
- în momentul în care începe erecţia, se prinde penisul la
nivelul glandului, cu mâna înmănuşată
- elementul esenţial este presiunea exercitată de operator cu
degetele la nivelul porţiunii spiralate a penisului, analog
papilelor cervicale ale scroafei
- sperma se colectează într-un recipient acoperit cu tifon
pentru a reţine fracţiunea gelatinoasă a spermei
 4. Recoltarea prin metoda manuală
(masturbarea)
• Tehnica de realizare la CÂINE:
Prezenţa unei femele în călduri în sala de recoltare NU este
obligatorie!

Avantajele folosirii căţelei în timpul recoltării sunt:

- răspunsul mai rapid al masculului la recoltare,
- volumul ejaculatului mai mare şi
- o concentraţie a spermei crescută.

Recoltarea se face într-o sală liniştită, în prezenţa unui număr

minim necesar de persoane pentru a evita stresarea
masculului.
 Tehnica de realizare la CÂINE:
 Iniţial se masează viguros penisul prin traversul furoului până la
obţinerea unei erecţii parţiale.
 Se retrage prepuţul în spatele bulbilor penieni şi se prinde penisul între
degetul mare şi arătător, exercitând o presiune fermă şi constantă.
 Se orientează penisul ventral la un unghi de 45o folosind celelalte trei
degete pentru a aplica presiune pulsatilă asupra bulbilor. Acest procedeu
mimează presiunea exercitată de vagin în cazul montei naturale şi
permite perceperea pulsaţiilor uretrei şi diferenţierea momentului
eliminării fracţiunilor ejaculatului. Se pot observa şi contracţii ritmice ale
anusului
 Odată recoltarea manuală încheiată, penisul câinelui trebuie protejat de
vătămări până la dispariţia erecţiei. Câinele nu trebuie niciodată trimis
acasă până când penisul nu este retras complet în prepuţ.
 5. Metoda prezervativului (condomului)
 Se practică uneori la ARMĂSAR, de regulă ca un expedient.
• Pe post de prezervativ, se poate utiliza o mănuşă obstetricală pentru ETR.

• Tehnica de realizare:
- prezervativul se glisează pe penisul armăsarului odată erecţia apărută
- armăsarul este lăsat să monteze femela
- la coborârea de pe femelă, prezervativul este recuperat şi trimis la laborator
pentru filtrarea şi evaluarea ejaculatului

• Avantaje:
- metodă ieftină, simplă şi care nu necesită o pregătire specială
- nu necesită dresarea/antrenarea armăsarului

• Dezavantaje:
- armăsarul excitat este periculos!
- necesită prezenţa unei iepe în estru
- sperma se poate contamina bacterian
 Specie Metodă de recoltare
Taur • cu vaginul artificial
• masajul transrectal al ampulelor canalelor deferente
• electroejacularea

Armăsar • cu vaginul artificial

• metoda condomului

Vier • metoda manuală

• cu vagin artificial

Berbec şi ţap • cu vaginul artificial

• electroejacularea
 EXAMENUL MATERIALULUI SEMINAL
Evaluarea materialului seminal = componentă importantă în
evaluarea fertilităţii masculilor

• Trebuie realizată :
- Ca element de rutină pentru evaluarea reproductivă a
masculilor
- Înainte de inseminarea artificială
- Înainte de conservarea materialului seminal

• !! Sperma trebuie evaluată cât mai repede după recoltare şi

manipulată corespunzător (atenţie la temperatura recipientelor
şi soluţiilor utilizate în timpul evaluării – trebuie menţinută la
37oC).
Evaluarea unui mascul de reproducţie NU trebuie să
se bazeze pe o singură evaluare/spermogramă
deoarece:

• Montele/recoltările frecvente pot reduce temporar

calitatea ejaculatului
• După o perioadă de repaus sexual îndelungată
masculul poate ejacula numeroşi spermatozoizi
morţi, imobili sau cu anomalii morfologice
• La masculii neexperimentaţi, proba recoltată poate
conţine doar cea de a treia fracţiune a ejaculatului
 SPERMOGRAMA

Ex. macroscopic Ex. microscopic

- Desime
-Volum
- Mobilitate
-Culoare
-Concentraţie
-Miros
-Morfologie
- Consistenţa
-Viabilitate
- Mişcarea în val
 Examenul macroscopic
A. Volumul – se apreciază direct în tubul de recoltare sau se
măsoară imediat după colectare pentru fiecare fracţiune a
ejaculatului
Factori care influenţează negativ volumul ejaculatului:
- lipsa de îndemânare a recoltatorului
-epuizarea sexuală
- deficienţe alimentare
- intoxicaţii Specie Volum ejaculat Volum mediu
(ml) ejaculat (ml)
Taur 1-15 6-7
Berbec, ţap 0,5-3,8 1-1,5
Armăsar 30-150 50
Vier 50-500 250
Câine 1- 60
 B. Culoarea - se apreciază subiectiv imediat după
recoltare şi variază în funcţie de specie, concentraţia
în spermatozoizi sau prezenţa substanţelor străine în
ejaculat (sânge, puroi, urină, etc).

Specie Culoare normală

Taur şi berbec Alb-gălbuie
Ţap Alb-verzuie
Vier Alb-albăstruie
Armăsar Alb-cenuşie
Câine Fracţiunea prostatică – limpede,
transparentă
Fracţiunea spermatică - alb-
sidefiu spre cenuşiu-
translucid
c. Mirosul normal al spermei este caracteristic proteinei
proaspete sau de amidon.

În cazuri anormale poate căpăta miros de urină, când

aceasta a pătruns în spermă în momentul ejaculării sau
poate avea un miros putrid în cazul prezenţei
puroiului.

! Unele medicamente pot modifica mirosul ejaculatului

d. pH-ul – apreciat cu ajutorul pH-metrelor sau cu hârtie

indicatoare specială; există o corelaţie directă între
calitatea spermei şi pH-ul acesteia (cu cât proba de
spermă este mai bună cu atât este mai acidă)
E. Mişcarea în val a spermei

 se apreciază doar la speciile cu volum mic al ejaculatului

 se poate aprecia:
- cu ochiul liber: în recipientul colector se observă zone
întunecate care alternează cu zone luminoase ~ vas cu
apă curată în care se toarnă o substanţă colorată
- la microscop (berbec): examen în picătură suspendată
 Examenul microscopic
a. Desimea spermei

- Preparat simplu de spermă între lamă şi lamelă

- Examinare cu obiectivul cel mai mic
- Examen subiectiv
1. spermă deasă (D) = distanţa dintre 2 spermatozoizi (spz)
este mai mică decât mărimea capului unui spermatozoid ~ 1x109
spz/ml
2. spermă medie (M) = distanţa dintre 2 spermatozoizi este
egală cu un cap de spermatozoid ~ 0,5-1x109 spz/ml (taur)
3. spermă rară (R) = distanţa dintre 2 spermatozoizi este mai
mare, dar există suficiente celule spermatice în câmpul
microscopic ~ 0,1-0,5 x109 spz/ml (vier, armăsar)
b. Concentraţia spermei = parametru utilizat pentru calcularea
dozelor corecte necesare inseminării artificiale sau pentru
stabilirea gradului de diluţie în cazul conservării materialului
seminal

• Se determină prin:
 metoda hemocitometrică - adaptată după tehnica de
numărare a globulelor roşii.

 metoda electronică - (SQA): mult mai rapidă şi mai exactă.

Combină un sistem optic cu unul electronic pentru elaborarea
rezultatelor. Pe baza densităţii optice determină concentraţia,
mobilitatea şi procentul de spermatozoizi fără anomalii.

 sistemele computerizate de analiză a spermei (CASA):

reprezintă o combinaţie de sisteme optice, digitale şi
computerizate, iar softul este proiectat pentru a determina şi
analiza concentraţia, viabilitatea, morfologia şi mobilitatea
spermatozoizilor. Este foarte rapid şi precis.
• Azoospermia = absenţa spermatozoizilor în ejaculat

• Oligozoospermia = un număr scăzut de

spermatozoizi în ejaculat (raportat la specie)
c. Mobilitatea spermei
Mobilitatea generala a spermei se apreciaza cat mai repede dupa
recoltare prin examenul in picatura suspendata (o picatura de
sperma nediluata se depune pe o lama); miscarea in val (taur,
tap) se noteaza cu 5, iar lipsa de miscare cu 0
- Mobilitatea individuala se apreciaza prin examinarea unei
picaturi de sperma proaspata diluata depusa intre lama si
lamela; se vor aprecia miscarea de inaintare, traiectoria liniara
si viteza de inaintare (velocitatea). Mobilitatea individuala se
noteaza pe o scara de la 0-5, sperma normala regasindu-se in
intervalul 2,5-5.
Sistemele CASA permit obtinerea unor rezultate precise, rapide
si complexe privind mobilitatea spermatozoizilor.
o Astenozoospermia defineste o mobilitate foarte scazuta a
spermatozoizilor. Se întâlnește în:
- şoc termic
- contaminarea ejaculatului cu apă, urină, sânge sau
lubrifianţi
- abstinenţă sexuală
- boli sistemice sau infecţioase (bruceloza)
d. Morfologia spermatozoizilor – Se apreciază imediat după
recoltare prin examen microscopic (100x cu imersie) şi colorare
(albastru de metilen, violet de genţiana, tuş de China, opal-bleu,
albastru-tripan-Giemsa, eozină-negrozină, Spermac etc). Oferă
posibilitatea de a pune în evidenţă spermatozoizii imaturi, cu
anomalii (majore sau minore) sau morţi.
• Teratozoospermia = exces de forme teratologice ale
spermatozoizilor dintr-un ejaculat. Într-un ejaculat normal
procentul spermatozoizilor anormali, imaturi sau morţi = max
20%.
 ANOMALII CAP

ANOMALII PIESĂ
INTERMEDIARĂ

NORMAL

ANOMALII FLAGEL
e. Viabilitatea spermatozoizilor = este echivalentă cu
integritatea membranei plasmatice

• Tehnici de colorare intravitale (eozină-negrozină, albastru

tripan-Giemsa etc.) sau tehnici de colorare fluorescenta,
urmate de examinare microscopica simpla sau speciala
(microscop cu lumina polarizata, microscop cu contrast de
faza sau cu lumina fluorescenta)
 Testul hipoosmotic: Proprietatea cozii
spermatozoidului de a se balona în mediu
hipoosmotic este un semn al desfăşurării normale a
transportului transmembranar al apei
• => fenomenul de balonare poate fi considerat un
semn al integrităţii funcţionale a membranei
spermatice
 Sistemele de analiză computerizată a
spermei (CASA)
CASA sunt bazate pe captura succesivă de imagini care provin de la un microscop,
digitalizarea lor, identificarea celulelor spermatice pe care le conţin primele
imagini, urmărirea acestor celule în imagini succesive, stabilirea traiectoriilor şi
în final, expunerea rezultatelor. Aceste rezultate reflectă o serie de măsurători
derivate din analiza deplasării în două planuri ale capului spermatozoidului

Avantajele CASA:
• Evaluare obiectivă şi rapidă a ejaculatului
• Precizie mare a determinărilor (rezultatele se
bazează pe evaluarea unui număr mare de
celule spermatice)
• Permit detectarea unor schimbări subtile în
mişcarea spermatozoizilor care nu ar putea fi
identificate de analizele convenţionale
Dezavantajele CASA:
• Costul ridicat al echipamentelor şi
consumabilelor
• Nevoia de standardizare şi validare al sistemului
înainte de folosire
• Ex. bacteriologic
- presupune recoltarea separată a fracţiunilor ejaculatului şi
realizarea de însămânţări pe medii pentru germeni aerobi,
anaerobi, micoplasme şi fungi; în mod normal, în spermă
se găsesc aproximativ 10.000 celule bacteriene/ml.

• Ex. imunologic
- urmăreşte detectarea anticorpilor antispermatici care ar
altera capacitatea fecundantă a spermatozoizilor. Ruperea
barierei hemato-testiculare (în traumatisme, infecţii)
permite contactul spermatozoizilor cu sângele circulant
=> sinteza de către propriul sistem imun a anticorpilor
antispermatici