UNIVERSITATEA ALEXANDRU IOAN CUZA IAI FACULTATEA DE BIOLOGIE

DIANA CAMELIA BATR - RUSU

CERCETRI PRIVIND INFLUENA MICROMICETELOR PARAZITE I SAPROFITE ASUPRA SEMINELOR I FRUCTELOR UNOR SPECII DE CEREALE I LEGUMINOASE DIN COLECIA BNCII DE GENE SUCEAVA

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific, Prof. univ. dr. Mihai MITITIUC 2010

UNIVERSITATEA "ALEXANDRU IOAN CUZA" IAI RECTORATUL Nr. ......... din .........................
Doamnei / Domnului......................................................................... V facem cunoscut c n data de., ora ........, sala ........, Facultatea de Biologie, va avea loc susinerea public a tezei de doctorat intitulat "Cercetri privind influena micromicetelor parazite i saprofite asupra seminelor i fructelor unor specii de cereale i leguminoase din colecia Bncii de Gene Suceava, elaborat de Diana Camelia BATR - RUSU, n vederea obinerii titlului tiinific de doctor n tiine ale Naturii, domeniul de doctorat Biologie. Comisia de doctorat are urmtoarea componen: PREEDINTE: Prof. univ. dr. Maria Magdalena ZAMFIRACHE Director al Departamentului de Biologie Facultatea de Biologie, Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iai CONDUCTOR TIINIFIC: Prof. univ. dr. Mihai MITITIUC Facultatea de Biologie, Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iai REFERENI TIINIFICI: Prof. univ. dr. Toader CHIFU Facultatea de Biologie a Universitii "Alexandru Ioan Cuza" Iai Prof. univ. dr. Eugen ULEA Facultatea de Agricultur a Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar Ion Ionescu de la Brad Iai Conf. univ. dr. Marcel PRVU Facultatea de Biologie a Universitii Babe-Bolyai Cluj-Napoca V transmitem rezumatul tezei de doctorat i v invitm s participai la edina de susinere public a tezei.

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

MULUMIRI INTRODUCERE CAPITOLUL I SMNA - ORGANISM VIU I FRAGIL 1.1. Importana seminei 1.2. Monitorizarea strii fitosanitare a cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase destinate conservrii genetice 1.3. Mecanismul producerii infeciei la cariopsele de cereale i seminele de leguminoase CAPITOLUL II ISTORICUL CERCETRILOR PRIVIND PATOLOGIA SEMINEI PE PLAN NAIONAL CAPITOLUL III FACTORII CARE CONDIIONEAZ APARIIA I DEZVOLTAREA MICROMICETELOR PE CARIOPSELE DE CEREALE I SEMINELE DE LEGUMINOASE CAPITOLUL IV MICOTOXINELE - O PROBLEM DE SIGURAN ALIMENTAR 4.1. Caracteristici generale ale micotoxinelor i biosinteza lor 4.2. Caracterizarea chimico-toxicologic a micotoxinelor produse de micromicetele toxinogene ntlnite n loturile de semine la cereale CAPITOLUL V SISTEMUL DE EXPERIMENTARE 5.1. Obiective 5.2. Condiiile de experimentare 5.3. Materialul biologic de experimentare 5.4. Metodele i tehnicile de cercetare aplicate 5.4.1. Protocolul de lucru n analiza fitopatologic 65 66 66 85 85 59 65 45 45 35 31 17 6 5 1 2 4

5.4.1.1. Tehnica de lucru experimental n analiza fitopatologic prin metoda CGA (cartof - dextroz - agar) 5.4.1.2. Tehnica de lucru experimental n analiza fitopatologic prin metoda Sabouraud (extract de drojdie - dextroz - cloramfenicol - agar) 5.4.2. Protocolul de lucru pentru determinarea cantitativ a micotoxinelor din cereale 5.4.2.1. Determinarea aflatoxinei B1 din cereale prin metoda cromatografiei n strat subire (C.S.S.) 5.4.2.2. Determinarea cantitativ a aflatoxinelor totale (B1+B2+G1+G2) din cereale prin metoda ELISA 5.4.2.3. Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din cereale prin metoda ELISA cu purificare pe coloana de imunoafinitate 5.4.2.4. Determinarea cantitativ a zearalenonei din cereale prin metoda ELISA 5.4.3. Protocolul de lucru n analiza citogenetic a probelor luate n studiu 5.5. Metode de calcul statistic utilizate CAPITOLUL VI REZULTATE EXPERIMENTALE PRIVIND CARACTERIZAREA FITOPATOLOGIC, TOXICOLOGIC I CITOGENETIC A PROBELOR DE CEREALE I LEGUMINOASE LUATE N STUDIU 6.1. Evaluarea fitopatologic la speciile de cereale i leguminoase luate n studiu 6.1.1. Micromicetele saprofite i parazite ntlnite la cerealele i leguminoasele luate n studiu (Analiza calitativ macroscopic i microscopic) 6.1.2. Evaluarea aciunii micoflorei epifite i endofite de depozit (Analiza cantitativ prin cuantificarea datelor i interpretarea rezultatelor) 6.1.2.1. Evaluarea aciunii micoflorei epifite i endofite de depozit ntlnit la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) luate n studiu 6.1.2.2. Evaluarea aciunii micoflorei epifite i endofite de depozit ntlnit la probele de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) 206 206 146 146 146 141 144 136 122 114 107 107 102 93

luate n studiu 6.1.2.3. Determinarea numrului total de colonii de microorganisme fungice identificate prin metoda Sabouraud la probele de cereale i leguminoase luate n studiu 6.2. Evaluarea aciunii micromicetelor identificate asupra germinaiei cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase luate n studiu, n funcie de umiditatea acestora 6.2.1. Evaluarea aciunii micromicetelor identificate asupra germinaiei cariopselor de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) luate n studiu, n funcie de umiditatea acestora 6.2.2. Evaluarea aciunii micromicetelor identificate asupra germinaiei seminelor de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate n studiu, n funcie de umiditatea acestora 6.3. Determinarea cantitativ toxicologic a micotoxinelor secretate de micromicetele ntlnite la probele de cereale luate n studiu (Zea mays, Triticum aestivum) 6.3.1. Determinarea aflatoxinei B1 din cereale prin metoda cromatografiei n strat subire (C.S.S.) 6.3.2. Determinarea cantitativ a aflatoxinelor totale (B1+B2+G1+G2) din cereale prin metoda ELISA 6.3.3. Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din cereale prin metoda ELISA cu purificare pe coloana de imunoafinitate 6.3.4. Determinarea cantitativ a zearalenonei din probele de Zea mays luate n studiu prin metoda ELISA 6.4. Modificrile citogenetice induse de agenii patogeni fungici la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) i leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate n studiu 6.4.1. Modificrile citogenetice induse de agenii patogeni fungici la probele de Zea mays luate n studiu 6.4.1.1. Indicele mitotic i frecvena fazelor diviziunii mitotice n apexul radicular la probele de Zea mays luate n studiu 6.4.1.2. Frecvena aberaiilor interfazice totale i a tipurilor de aberaii interfazice la probele de Zea mays luate n studiu 6.4.1.3. Frecvena aberaiilor cromozomiale totale i a tipurilor de aberaii cromozomiale n ana-telofaza (A-T) mitozei

229

257

260

262

267

274 274 274 290 299

305 305 306

307

la probele de Zea mays luate n studiu 6.4.2. Modificrile citogenetice induse de agenii patogeni fungici la probele de Phaseolus vulgaris luate n studiu 6.4.2.1. Indicele mitotic i frecvena fazelor diviziunii mitotice n apexul radicular la probele de Phaseolus vulgaris luate n studiu 6.4.2.2. Frecvena aberaiilor interfazice totale i a tipurilor de aberaii interfazice la probele de Phaseolus vulgaris luate n studiu 6.4.2.3. Frecvena aberaiilor cromozomiale totale i a tipurilor de aberaii cromozomiale n ana-telofaza (A-T) mitozei la probele de Phaseolus vulgaris luate n studiu 6.4.3. Modificrile citogenetice induse de agenii patogeni fungici la probele de Vicia faba luate n studiu 6.4.3.1. Indicele mitotic i frecvena fazelor diviziunii mitotice n apexul radicular la probele de Vicia faba luate n studiu 6.4.3.2. Frecvena aberaiilor interfazice totale i a tipurilor de aberaii interfazice la probele de Vicia faba luate n studiu 6.4.3.3. Frecvena aberaiilor cromozomiale totale i a tipurilor de aberaii cromozomiale n ana-telofaza (A-T) mitozei la probele de Vicia faba luate n studiu CONCLUZII BIBLIOGRAFIE LISTA LUCRRILOR TIINIFICE CU REFERIRE LA SUBIECTUL TEZEI DE DOCTORAT ANEXE

309 313 313

315

317 321 321

323

325 333 337 346 347

INTRODUCERE
Viaa fiecrui organism este permanent ameninat de ctre alte organisme, ceea ce constituie una din caracteristicile eseniale ale lumii vii. Pe parcursul perioadei de vegetaie sau pe parcursul valorificrii lor, plantele sunt atacate de microorganisme fungice, care determin apariia unor modificri citologice, fiziologice i biochimice la organele afectate. Aceste modificri apar dup o perioad variabil de timp, determinat de virulena atacului fitopatogen. Patologia seminei i rolul acesteia n transmiterea bolilor la plante este o parte integrant a patologiei plantei n ansamblul ei. n cadrul acestei lucrri am sintetizat cunotinele referitoare la importana seminei, importana analizei fitosanitare a seminelor destinate conservrii genetice, modul de contaminare a seminei, factorii care influeneaz pierderea viabilitii seminelor, precum i unele aspecte fitopatologice legate de aciunea micoflorei epifite i endofite prezent n condiii de depozitare pe cariopsele de cereale i seminele de leguminoase luate n studiu, aciunea agenilor patogeni fungici asupra facultii germinative i umiditii probelor analizate, precum i caracterizarea chimicotoxicologic a micotoxinelor secretate de micromicetele identificate, determinarea cantitativ a acestora i unele modificri citogenetice induse de agenii patogeni fungici. Am pus accent pe anumite aspecte fitopatologice i genetice privind evoluia micromicetelor saprofite i parazite pe cariopsele cerealelor i seminele leguminoaselor luate n studiu, care provin din zone pedoclimatice diverse i au fost conservate perioade diferite de timp, n depozite cu atmosfer controlat (T = + 4 C; umiditatea relativ a aerului (U%) = 30 - 40%; procentul de umiditate al seminelor (U = 5 - 8%). Cerealele i leguminoasele reprezint culturi de tradiie n agricultura rii noastre prin valoarea nutritiv ridicat a seminelor, care constituie sursa primar de hran n alimentaia oamenilor i animalelor, dispunnd n majoritatea zonelor de condiii favorabile de clim i sol. Porumbul este una din cele mai importante plante de cultur. Cariopsele sale se utilizeaz n alimentaia oamenilor, n industrie i furajarea animalelor (constituie nutreul concentrat cel mai important pentru toate speciile de animale). Bobul se cultiv pentru seminele sale, care se folosesc n alimentaia oamenilor i animalelor. Fa de celelalte leguminoase, bobul prezint avantajul c n anumite zone din ara noastr d o producie mai mare i relativ mai constant, asigurnd la

unitatea de suprafa o cantitate de proteine mai ridicat i la un cost mai redus. ns, n ara noastr, cultura acestei plante s-a redus mult, fiind nlocuit cu cea a fasolei i mazrii, n prezent suprafee mai mari cultivate cu bob gsindu-se n zonele umede i rcoroase (Bucovina, Oltenia, Maramure) i mult mai mici n alte regiuni, din sudul rii, unde apare sporadic (Ionescu, 1967). Cu toate acestea, produciile obinute pe suprafee mari ct i n gospodriile rurale referitoare la cereale i leguminoase nu s-au ridicat la nivelul potenialului biologic al soiurilor cultivate sau au prezentat fluctuaii de la un an la altul. Una din cauzele principale care genereaz aceste neajunsuri poate fi cunoaterea slab a problemelor legate de sntatea seminelor, ct i neglijarea msurilor de prevenire i combatere a principalilor ageni fitopatogeni care afecteaz culturile (Plcint, 2007). Prin problematica abordat, acest studiu aduce noi contribuii la cunoaterea principalilor patogeni seminali ai cerealelor i leguminoaselor, cu importan major n agricultur.
* **

Finalizarea tezei de doctorat mi d ocazia s prezint gnduri de mulumire i recunotin ndrumtorului meu de doctorat, Domnului Profesor Dr. Mihai MITITIUC, pentru ncrederea acordat, pentru sfaturile i sugestiile privind concepia lucrrii, pentru ndrumarea permanent, dar i pentru criticile competente de-a lungul anilor stagiului de pregtire. Cu respect, aduc cele mai frumoase gnduri de mulumire preedintei i referenilor oficiali ai acestei teze (Prof. univ. dr. Maria Magdalena Zamfirache, Director al Departamentului de Biologie - Universitatea Alexandru Ioan Cuza Iai, Prof. univ. dr. Toader Chifu - Universitatea Alexandru Ioan Cuza Iai, Prof. univ. dr. Eugen Ulea Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Ion Ionescu de la Brad Iai, Conf. univ. dr. Marcel Prvu - Universitatea Babe Bolyai Cluj Napoca) pentru amabilitatea cu care au acceptat s citeasc lucrarea i s vin cu sugestii competente.

De asemenea, adresez alese i speciale mulumiri profesorilor de la Catedra de Biologie Vegetal (Prof. univ. dr. Toader Chifu, Prof. univ. dr. Ctlin Tnase, Prof. univ. dr. Maria Magdalena Zamfirache, Prof. univ. dr. Constantin Toma, Conf. univ. dr. Lcrmioara Ivnescu, Prof. univ. dr. Alexandrina Murariu) care au fost prezeni de fiecare dat n consiliile de examen, mi-au dat sfaturile i ndrumrile necesare, precum i Lector dr. Cristian Tudose de la Catedra de Genetic, pentru sprijinul n realizarea analizelor citogenetice de laborator, respectiv Domnului fizician Dumitru Rileanu de la Laboratorul de Microscopie Electronic din cadrul Universitii Alexandru Ioan Cuza Iai pentru fotografiile realizate. Adresez calde mulumiri Doamnelor Mariana Preda, respectiv Elvira Tanasciuc din cadrul laboratoarelor Toxicologie i Control Reziduuri de la Direcia Sanitar Veterinar Suceava pentru colaborarea reuit n realizarea analizelor toxicologice i fitopatologice. Recunotina mea se ndreapt i ctre Doamna Prof. univ. dr. Viorica Iacob Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Ion Ionescu de la Brad Iai, pentru amabilitatea i ajutorul acordat n determinarea unor specii de micromicete identificate la microscopul electronic. Pentru tot sprijinul oferit, mulumirile mele se adreseaz i colegelor dr. ing. agronom Danela Murariu care mi-a fost alturi n momentele grele, mi-a ridicat moralul,, m-a ncurajat cu mult rbdare i profesionalism ori de cte ori simeam c nu reuesc s ajung la rezultatul pe care mi-l doream i mi-a acordat un real suport n interpretarea statistic a rezultatelor, respectiv dr. ing. agronom Domnica Plcint, pentru numeroasele surse bibliografice puse la dispoziie cu atta cldur, care au constituit un important rol n formarea mea ca cercettor. Sunt recunosctoare conducerii Bncii de Gene Suceava dr. biolog Silvia Strjeru pentru nelegerea acordat. Toat recunotina, dragostea i admiraia se ndreapt ctre FAMILIA MEA care mi-a fost alturi n tot acest timp; sunt profund recunosctoare pentru nelegerea, buntatea, rbdarea de care au dat dovad soul meu, prinii i fratele meu, precum i pentru sprijinul moral i financiar pe care mi l-au oferit n decursul anilor de studiu.
* **

CAPITOLUL I
SMNA - ORGANISM VIU I FRAGIL Smna nsumeaz, prin nsi componentele structurale i funciile ei, toate atributele eseniale ce definesc viaa: metabolismul, respiraia, capacitatea de reproducere a unui nou organism, reacia specific sub aciunea factorilor de mediu. Transmiterea agenilor patogeni fungici prin semine a constituit dintotdeauna mijlocul cel mai rapid de rspndire a bolilor de la o regiune la alta i din aceast cauz apare astfel necesitatea cunoaterii lor prin simptome, prin biologia i modul de transmitere a fitopatogenilor care le produc, pentru ca odat semnalate s poat fi asigurat n mod eficient prevenirea i combaterea lor (Baker, 1966). 1.1. Importana seminei

Smna reprezint una din prghiile utilizate pentru stimularea agriculturii i mrirea produciei, dar i un mijloc de contaminare cu micromicetele provenite din micoflora de cmp i de depozit, pe perioada pstrrii (Strjeru i colab., 2001, Plcint, 2007). Prin structura i funciile ce o definesc: metabolism, respiraie, capacitate de reproducie, smna poate fi definit ca un "organism viu i fragil". Smna trebuie considerat un mijloc important de producie, fr de care nu se poate asigura obinerea unor recolte mari i cu indici calitativi superiori (Raicu i colab., 1978). Ca mijloc de producie, smna reprezint un start bun pentru viitoarea cultur, atunci cnd prezint o germinaie rapid i are o valoare biologic ridicat, provenind din soiuri ameliorate cu indici calitativi superiori din punct de vedere genetic, fiziologic, morfologic, fitopatologic etc. (Strjeru i colab., 2001). Ca factor biologic i economic, smna constituie sursa major de hran pentru om i animale (Strjeru i colab., 2001).

Hrnirea populaiei pe viitor att n ara noastr ct i n lume se va asigura printr-o agricultur ce protejeaz resursele genetice vegetale, o agricultur intensiv ce pstreaz diversitatea soiurilor, care contribuie la protecia climatic i la reglarea echilibrului apei pe planet. Smna trebuie s ndeplineasc trei condiii eseniale pentru a asigura o agricultur performant: s fie un bun material genetic s prezinte puritate biologic i valoare cultural ridicat s fie liber de ageni patogeni fungici. n afar de agenii fitopatogeni care infecteaz sau contamineaz seminele, o importan deosebit au i microorganismele fungice saprofite, care n condiii favorabile de dezvoltare pot deveni parazite i pot produce pagube nsemnate n special pe perioada depozitrii (Raicu i colab., 1978). Pe lng neajunsurile pe care o smn infectat le aduce direct produciei, ea poate ridica probleme atunci cnd este folosit n hrana omului i animalelor. O serie de ageni patogeni fungici care colonizeaz smna au capacitatea de a produce micotoxine foarte periculoase vieii. 1.2. Monitorizarea strii fitosanitare a cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase destinate conservrii genetice Noiunea de smn cu valoare biologic ridicat include ca o condiie esenial o stare sanitar corespunztoare a acesteia. Alturi de nsuirile de productivitate, puritate, facultate germinativ, starea de sntate a seminei nu poate i nu trebuie s lipseasc din calificativul acordat unui lot anume. Aprecierea calitativ a seminelor i recomandarea folosirii lor pentru loturile semincere nu este complet dac nu se ine seama de infecia acestora cu ageni patogeni. Analiza sanitar permite alegerea loturilor de smn liber de infecie sau infectat ntr-un grad redus, care s garanteze reuita viitoarei culturi. De asemenea, ca urmare a analizei sanitare se poate preciza oportunitatea aplicrii

10

unui tratament al seminei, astfel ca gradul de infecie s fie redus la minimum sau chiar total (Raicu i colab.,1978). O calificare a loturilor de smn din punct de vedere sanitar hotrte valorificarea acestora ca material de nmulire sau de consum, sau scoaterea lor din circuitul agricol (Strjeru i colab., 2001). Analiza sanitar constituie un mijloc eficace pentru prevenirea rspndirii multor boli transmisibile prin smn. Ea permite aprecierea valorii culturale a seminei, contribuind astfel efectiv la reuita unei culturi, din punct de vedere al calitii i productivitii (Raicu i colab., 1978). Factorii implicai n analiza strii sanitare a seminei sunt: starea seminei n momentul analizei agentul patogen ca factor implicat n analiza seminei. Starea fitosanitar a seminelor are drept scop determinarea procentului de boabe contaminate de una sau mai multe ciuperci i este dependent de genotip, tehnologie i condiiile climatice din perioada formrii, maturizrii i recoltrii seminelor (Anghel i colab., 1959). n transmiterea bolilor plantelor de la an la an i n rspndirea lor de la un loc la altul, seminele au un rol deosebit de important ntruct prin intermediul lor se pstreaz i se vehiculeaz agenii fitopatogeni. Acest fapt face ca aprecierea calitativ a seminelor i recomandarea folosirii lor (pentru consum sau semnat) s nu fie complet, dac nu se ine seama i de infecia acestora cu agenii patogeni fungici (Iacob, 2002). Unii ageni patogeni au supravieuit n seminele depozitate chiar i timp de 23 ani. Comparativ cu seminele pstrate n condiii de mediu necontrolat, unde inoculul se gsete n proporii ridicate, conservarea genetic n bnci de gene asigur pe o perioada ndelungat de timp condiii improprii dezvoltrii inoculului prezent pe semine, meninndu-l n stare constant, diminundu-se astfel n timp, ceea ce determin pstrarea viabilitii seminelor pe durate mari de timp. O parte din agenii patogeni pot rmne viabili i n astfel de condiii de depozitare, datorit organelor de rezisten sau a miceliilor din interiorul seminei (Plcint, 2007).

11

Micromicetele existente pe seminele depozitate pot cauza n perioada stocrii o serie larg de modificri, cu consecine negative sub aspect tehnologic, nutritiv, igienic i comercial. Conservarea genetic a seminelor n bnci de germoplasm reprezint o strategie important n lume i n ara noastr, deteminnd reducerea deteriorrii genetice i garantarea amelioratorilor cu material genetic viabil ce are ca rezultat final crearea de noi soiuri i hibrizi, precum i creterea produciei de smn comercial (FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1994). Conservarea sub form de smn este cea mai practic i mai practicat metod de pstrare a resurselor genetice vegetale (Cristea, 1985). Pentru seminele destinate conservrii genetice, care sunt pstrate n depozite frigorifice, standardele de depozitare trebuie s fie urmtoarele: pentru conservare pe termen mediu: T = + 4,5 0C ( 1 0C), umiditatea relativ a aerului = 30 - 40 %, iar coninutul de umiditate al seminelor ntre 5 - 8 %. pentru conservare pe termen lung: T = - 15 0C; - 20 0C (1 0C), umiditatea relativ a aerului = 30 %, iar coninutul de umiditate al seminelor de 51 % (Strjeru i colab., 2001). Calitatea unei semine destinate conservrii este definit n principal prin viabilitate, cuantificat prin procentul de semine germinate n condiii de mediu controlate. n ceea ce privete comportamentul cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase din timpul depozitrii, putem preciza c acestea fac parte din grupa seminelor ortodoxe, n sensul c mbtrnirea i moartea acestora este nu numai n funcie de timp, ci i de nivelul de temperatur i coninutul de umiditate al seminelor. Astfel, n acest caz este posibil de influenat perioada de supravieuire a seminelor prin controlul mediului de depozitare. Cu ct temperatura i umiditatea au valori mai mici, cu att crete longevitatea seminelor (Strjeru i colab., 2001). n timpul depozitrii seminelor au loc anumite schimbri fiziologice,

12

biochimice i citogenetice, n ceea ce privete capacitatea germinativ, permeabilitatea membranelor celulare, activitatea enzimatic, procesul respirator. Viabilitatea seminelor este n funcie de nsuirile lor biologice i de condiiile de pstrare (Cristea, 1985). Cu ct perioada de pstrare devine mai lung, cu att seminele destinate nsmnrii pierd treptat facultatea germinativ, chiar dac au fost bine pstrate, astfel nct culturile rezultate din ele nu realizeaz desimea necesar i produciile obinute sunt slabe. Micromicetele aflate pe semine au i ele viabilitate variabil. Majoritatea pot tri n semine aproape tot att ct i smna, iar n afara acesteia pot rmne viabile mai mult timp. Seminele au vigoarea cea mai ridicat la maturitatea lor, iar apoi n cursul pstrrii ele se deterioreaz continuu din punct de vedere calitativ. Deteriorrile care au loc n seminele pstrate o perioad lung de timp sunt: - diminuarea activitii metabolice - creterea sensibilitii la condiiile nefavorabile de mediu - creterea numrului de germeni anormali (aberaii cromozomiale) - pierderea capacitii germinative (Plcint, 2007). Seminele viguroase se caracterizeaz prin faptul c: sunt mai puin afectate de factorii nefavorabili n cursul depozitrii; au o rezisten ridicat la agenii patogeni dup semnatul n cmp; au capacitatea de a dezvolta plante normale. Cauzele ce pot influena vigoarea cariopselor la cereale i a seminelor la leguminoase pot fi de mai multe feluri: genetice - unele cultivare au o smn mai rezistent la condiiile nefavorabile de mediu sau au nsuirea de a crete mai repede; fiziologice - aici pot fi incluse dou aspecte: maturitatea la recoltare i deteriorrile n timpul pstrrii; morfologice - n cadrul aceluiai soi, seminele mici produc adesea germeni mai puin viguroi; mecanice - prezena fisurilor sau necrozelor; activitatea microorganismelor (ciuperci i bacterii) n cmp sau n

13

timpul pstrrii. Ali factori care influeneaz viabilitatea materialului depozitat i conduc la nmulirea i rspndirea micromicetelor de pe semine sunt: factori externi (abiotici i biotici) factori interni (genetici). Factorii externi abiotici: - factorii climatici, pedologici, agrotehnici nainte de recoltare - temperatura de depozitare - deteriorrile mecanice. Factorii externi biotici: - bolile i duntorii seminelor depozitate Factorii interni: - coninutul n umiditate al seminelor - maturitatea seminelor i mrimea lor - vrsta seminelor - repausul seminal - structura i compoziia seminelor - variaiile ntre specii, precum i cele ntre soiuri. Cariopsele de cereale i seminele de leguminoase contaminate cu diferii ageni patogeni n proporii variabile, semnate n cmp, pot determina apariia patogenilor n cultur, n proporii diferite, n funcie de anumii factori exerni. Aceti factori au o influen puternic asupra plantei gazd, agentului patogen ct i asupra relaiei dintre planta gazd i agentul patogen, fiind reprezentai de: factorii climatici (temperatur, umiditate, precipitaii, vnt); factorii pedologici (reacia solului, textura, coninutul de umiditate al solului); factorii agrotehnici (perioada optim de semnat, adncimea de semnat, densitatea culturii).

14

1.3. Mecanismul producerii infeciei la cariopsele de cereale i seminele de leguminoase Contaminarea seminei se realizeaz n majoritatea cazurilor prin simpla diseminare a agenilor patogeni. Aceast diseminare poate avea loc n cmp, dup maturarea seminei prin intermediul vntului, apei, insectelor, sau dup recoltare, n timpul treieratului i transportului (Raicu i colab., 1978). Utilizarea seminelor contaminate de ctre microorganismele fungice, n timpul vegetaiei, la recoltare i pe durata conservrii antreneaz n fiecare an pierderi nsemnate ce afecteaz att randamentul ct i calitatea produciei recoltate i stocate (Champion, 1997, citat de Plcint, 2007). Mecanismul contaminrii seminelor se produce adesea n funcie de condiiile agroclimatice, putnd s apar diferene de infestare de la o regiune la alta sau de la o parcel la alta, diferene care apar n funcie de cantitatea de inocul existent pe smn (Plcint, 2007). Conform afirmaiilor fcute de Champion (1997), inoculul prezent pe cariopsele de cereale i seminele de leguminoase are ca punct de plecare diverse origini, i ca urmare exist mai multe surse de contaminare: Smna mam - reprezint un mijloc de contaminare nainte de semnat; Resturile de plante bolnave - rmase dup recoltare constituie un mijloc de contaminare, afectnd germinaia seminei i apariia tinerelor plantule; Mediul abiotic - reprezint un mijloc de contaminare n timpul vegetaiei. Condiiile meteorologice (temperaturi ridicate, umiditate ridicat, variaii de temperatur) favorizeaz producia de inocul n timpul vegetaiei sau diseminarea acestuia (prin vnt, ploaie); Lucrrile agrotehnice - sunt mijloace de contaminare pe toat durata perioadei de vegetaie, recoltarea avnd un rol important n transportul de spori i infestarea seminei; Condiiile de depozitare - temperatura de depozitare i

15

umiditatea seminelor sunt principalii factori fizici care diminueaz sau sporesc contaminarea seminelor (Strjeru i colab., 2001, Plcint, 2007). n loturile cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase, sursele de contaminare a seminei sunt foarte variate, inoculul purtat de acestea fiind format din mai multe tipuri de micromicete ce influeneaz vigoarea. Ciupercile ce se transmit prin semine au o natur foarte variat. Dup modul de aciune asupra plantei gazd i asupra seminei pot exista mai multe grupe de micromicete cum ar fi: micromicete parazite; micromicete oportuniste; micromicete saprofite; micromicete productoare de micotoxine; micromicete antagoniste (Strjeru i colab., 2001). Micromicetele transmise prin cariopsele de cereale i seminele de leguminoase infesteaz, n funcie de biologia lor i de condiiile ntlnite nveliurile exterioare ale seminei sau produc infecii n interior la nivelul embrionului, influennd facultatea germinativ i vigoarea plantelor n cmp (Mititiuc, 1994). Micoflora asociat cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase, fie c provine dintr-o contaminare superficial sau o contaminare intern, aflat uneori n stare latent ct condiiile de dezvoltare nu sunt prielnice, este capabil s-i reia activitatea n condiii favorabile, la semnat sau n timpul depozitrii, diminund viabilitatea seminei, determinnd mai multe tipuri de contaminare i n final compromiterea viitoarelor culturi (Plcint, 2007). Tipurile de contaminare sunt: a. Contaminarea extern; b. Contaminarea intern; c. Contaminarea mixt - extern i intern; d. Contaminarea cu resturi de plante ce conin spori de ciuperci sau micelii; e. Contaminarea dup recoltare (Strjeru i colab., 2001).

16

Cile de transfer ale patogenilor n timpul contaminrii seminei sunt: - transferul de la smn la smn; - transferul de la smn la plant; - transferul de la sol - smn - plant; - transferul de la planta mam la smn (Strjeru i colab., 2001, Plcint, 2007). Cele mai importante msuri de prevenire a atacului patogenilor i saprofiilor sunt : 1. Certificarea calitii seminei; 2. Recoltarea i condiionarea seminei; 3. Msurile de prevenire a infeciei n timpul depozitrii; 4. Msurile privind tratarea seminelor (Plcint, 2007). Smna destinat semnatului, neutilizat n anul recoltrii acesteia, poate fi folosit cu succes n anii urmtori, cu condiia pstrrii n depozite cu atmosfer controlat, deoarece durata de pstrare influeneaz longevitatea unor ciuperci saprofite i parazite, n sensul c cu ct durata de pstrare este mai mare, cu att gradul de infecie este mai redus, ns smna trebuie s aib facultatea germinativ de peste 85% (Strjeru i colab., 2001). Este foarte important analiza probelor de semine atunci cnd acestea urmeaz a fi conservate n depozite cu atmosfer controlat (bnci de gene) n vederea identificrii probelor contaminate cu diverse micromicete saprofite i parazite mai mult sau mai puin periculoase, n aa fel nct n depozit s fie introdus doar smn sntoas. De asemenea, n timpul conservrii seminelor, periodic, odat cu determinarea germinaiei seminelor (la intervale de 5 ani) este indicat s se fac analize privind gradul de atac cu diferite micromicete, pentru a se evita riscurile de diseminare i pierderile de material genetic (Strjeru i colab., 2001).

17

CAPITOLUL II
ISTORICUL CERCETRILOR PRIVIND PATOLOGIA SEMINEI PE PLAN NAIONAL n Romnia, primele meniuni referitoare la ciupercile care produc boli plantelor dateaz din secolul al XVIII-lea. n secolul XX s-au elaborat diferite sisteme de clasificare a ciupercilor i sau aprofundat cunotine privind sexualitatea la ciuperci i genetica interaciunii gazd - parazit (Tnase, Mititiuc, 2001). Odat cu nfiinarea Institutului de Cercetri Agronomice din Romnia, studiul ciupercilor microscopice i al celor fitopatogene a progresat mult prin apariia unei lucrri de referin "Herbarium mycologicum romanicum" (1929), de o deosebit importan att pe plan naional ct i internaional, editat sub directa ndrumare a lui Traian Svulescu. n cadrul acestui institut au lucrat micologi cu o activitate remarcabil: Traian Svulescu care a editat 2 monografii de referin asupra uredinalelor (1953) i ustilaginalelor din Romnia (1957), Al. Alexandri, Ana Hulea, Vera Bontea, Olga Svulescu (Tnase, Mititiuc, 2001). Vera Bontea i Becerescu (1952) au publicat un manual de fitopatologie, iar mai trziu, Vera Bontea (1985, 1986) a publicat o lucrare de sintez asupra ciupercilor saprofite i parazite din Romnia. O contribuie deosebit a avut-o i E. Rdulescu care a dezvoltat cercetri de fitopatologie teoretic i practic (Tnase, Mititiuc, 2001). n anul 1967 n "ndrumtorul pentru determinarea bolilor i duntorilor la semine" - un compendiu metodologic, unde sunt prezentate procedee i metode tehnice de analiz, avnd ca autori pe Rdulescu i Negru apare prima cheie pentru determinarea bolilor cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase. n anul 1969, Rdulescu i Rfil descriu amnunit principalele boli ce se transmit prin smn la graminee i leguminoase cultivate, n Tratatul de fitopatologie agricol.

18

n 1973 Hulea, Negru i Severin public lucrarea "Principalele boli ale culturilor semincere", unde prezint detaliat o serie de patogeni pe cariopsele de cereale i seminele de leguminoase, respectiv micoflora asociat, epifit i endofit (Plcint, 2007). n 1978 n "Patologia seminei", Raicu i Baciu descriu amnunit principalii ageni patogeni purtai de smn la aceste dou familii botanice, ciupercile saprofite de depozit precum i metodele de analiz a acestora. Tatiana Sean a adus contribuii importante la studiul micoflorei seminelor de leguminoase cultivate n Romnia. A contribuit la studiul patologiei seminei i combaterii micozelor plantelor de cultur prin lucrarea "Ciuperci parazite pe smna de fasole i combaterea lor" (1982), n care a descris principalele ciuperci parazite care se transmit prin smna de fasole, metodele de analiz pentru determinarea acestora i msuri de prevenire i combatere a acestora. Activitatea de cercetare n domeniul fitopatologiei a fost susinut n centrele universitare de profesori care au format generaii de specialiti n domeniul biologic i agricol: Olga Svulescu, E. Docea, I. Come, Al. Lazr, M. Hatman, I. Bobe, M. Toma, Viorica Iacob, M. Mititiuc, T. Chifu, C. Tnase, Aurelia Crian (Tnase, Mititiuc, 2001).

CAPITOLUL III
FACTORII CARE CONDIIONEAZ APARIIA I DEZVOLTAREA MICROMICETELOR PE CARIOPSELE DE CEREALE I SEMINELE DE LEGUMINOASE Starea sanitar a culturilor de cereale i leguminoase, gradul de coacere i coninutul n umiditate al seminelor, condiiile climatice din perioada de maturare, din timpul i imediat dup recoltare, metoda de recoltare, condiionarea seminelor dup recoltare, tipul de depozit, rolul vrstei seminelor n timpul pstrrii, rolul duntorilor n nmulirea i rspndirea micromicetelor n

19

timpul depozitrii i condiiile de mediu specifice de depozit sunt principalii factori care condiioneaz apariia i dezvoltarea micromicetelor pe cariopsele de cereale i seminele de leguminoase (Plcint, 2007). nmulirea, creterea i activitatea de degradare a micromicetelor parazite i saprofite sunt favorizate de condiiile de depozitare n care triesc, cum ar fi: substratul nutritiv unde se dezvolt masa de semine; temperatura i lumina; umiditatea relativ din atmosfera depozitului i dintre spaiile intergranulare; ventilaia aerului i compoziia atmosferei din depozit (Strjeru i colab., 2001).

CAPITOLUL IV
MICOTOXINELE - O PROBLEM DE SIGURAN ALIMENTAR Contaminarea cu micotoxine a produciei primare i a produselor rezultate prin prelucrarea industrial prezint un risc crescut pentru sntatea consumatorilor, datorit proprietilor lor citotoxice i imunodepresive pronunate. Dei contaminarea cu micotoxine survine n timpul vegetaiei, nivelul acestora poate crete substanial n timpul depozitrii i al prelucrrii produselor agricole. Supravegherea atent i depozitarea corect a alimentelor sunt importante n prevenirea dezvoltrii micotoxinelor. Micotoxinele sunt metabolii secundari cu o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut, simpl sau complex, produi de anumii fungi sau mucegaiuri care cresc pe alimente i pot contamina hrana animalelor i omului. Au capacitatea de a modifica structuri biologice normale, ele perturb procesele oxidative la nivel celular, producnd un efect negativ asupra sistemului imun, asupra integritii materialului genetic, avnd efect citotoxic i carcinogen, att la om, ct i la animale. Aceste toxine pot fi depozitate n sporii fungilor, n mucegai, n miceliul vegetativ, n organele de fructificare, sau de cele mai multe

20

ori eliminate n substratul de cretere (aliment), ca produi de secreie pe substratul pe care s-a dezvoltat mucegaiul. Toxinele pot lua natere n timpul creterii recoltei sau n urma unei depozitri incorecte (Savu i colab., 2004). Sunt produi secundari de metabolism, elaborai de miceii toxinogeni, printr-o serie de reacii catalizate de enzime, n condiii specifice de umiditate i temperatur. Micotoxinele cele mai importante, cu riscuri seminificative pentru sigurana alimentaiei umane sunt aflatoxinele, fumonisinele, ochratoxinele, patulina, trichotecina i ergotoxina (Savu i colab., 2004). Prezena miceilor nu este neaprat un indicator al prezenei micotoxinelor (Popa i colab., 1986). Caracteristicile generale ale micotoxinelor sunt: - au structur chimic complex; - au molecule nepolare; - prezint mas molecular mic; - sunt rezistente la aciunea agenilor fizici i chimici; - au toxicitate ridicat; - au efecte grave asupra sistemelor biologice; - pot fi secretate nainte de recoltare sau dup recoltare (Coman i colab., 1985). Pierderile economice cauzate de micotoxine se produc pe tot parcursul lanului alimentar. n plus, ca rezultat al consumului de ctre animale a furajelor contaminate, care conin de regul mai multe micotoxine, exist riscul major ca micotoxinele s ajung n produsele alimentare de origine animal - ou, lapte, carne. n acest context, se impune necesitatea dezvoltrii capacitii de determinare a coninutului de micotoxine pe ntreg lanul alimentar plant animal - produse alimentare de origine animal (Savu i colab., 2004). Contaminarea cu micotoxine a produselor alimentare este condiionat de temperatura i umiditatea aerului, dar mai ales de umiditatea produsului respectiv. Infectarea cu spori de mucegai poate avea loc n cmp, n timpul recoltrii, condiionrii, depozitrii sau distribuiei. Efectele nocive ale micotoxinelor se regsesc la nivelul a patru paliere medicale: simptomatologia clinic, modificrile fiziopatologice de natur

21

biochimic

hematologic,

modificrile

histopatologice

leziunile

ultrastructurale (Cotru i colab., 1991). Meninerea calitii produselor alimentare pentru a garanta sntatea consumatorilor reprezint un obiectiv foarte important n sectorul agro-alimentar. Alimentele trec printr-o succesiune de transformri tehnologice, iar produsul final trebuie s prezinte un risc microbiologic minim. Cercetrile efectuate au pus n eviden 240 de mucegaiuri toxicogene, indentificndu-se peste 2000 substane toxice, iar o anumit specie de mucegai poate elabora un complex de micotoxine cu structuri diferite i acceai toxin poate fi produs de mai multe mucegaiuri. Micotoxinele contamineaz produsele agricole nainte sau dup recoltare. Ele pot fi sintetizate cnd produsele alimentare sunt infectate cu mucegaiuri, n timpul perioadei de cretere a plantelor sau n timpul depozitrii. n general, umiditatea i temperaturile nalte favorizeaz nmulirea ciupercilor i producerea de micotoxine. Condiiile proaste din timpul recoltrii, depozitrii, transportului i comercializrii contribuie i ele la nmulirea mucegaiurilor i la creterea riscului de producere a micotoxinelor (Savu i colab., 2004) (fig. 1). Micotoxine Micotoxine

Cultura n cmp

Recoltare

Transport

Micotoxine
Consumator Depozitare

Micotoxine
Produsul finit ___________________ Prelucrare
Fig. 1 - Traseul micotoxinelor pe lanul alimentar (Savu i colab., 2004) 22

Micotoxinele pot ajunge n organismul uman nu numai prin consumul de cereale, produse alimentare preparate din cereale sau semine contaminate, ci i prin consumul de lapte, carne sau ou provenite de la animale hrnite cu furaje contaminate (Savu, 1999). Factorii care influeneaz dezvoltarea miceilor i producerea de micotoxine sunt: capacitatea genetic a mucegaiurilor, substratul nutritiv, umiditatea, pH-ul substratului, coeficientul de activitate al apei, temperatura, aeraia (compoziia atmosferei), luminozitatea, agenii biologici, microorganismele concurente, perioada de timp de la contaminare, precum i lucrrile agrotehnice, fitosanitare (Derache, 1988). Pentru simplificarea prezentrii acestui grup de produi toxici care pot influena calitatea alimentelor sau nutreului, cu efecte grave asupra consumatorului, micotoxinele elaborate de micromicetele ntlnite pe materialul biologic luat n studiu au fost grupate n 2 categorii: - micotoxine cu aciune cancerigen (aflatoxinele, ochratoxinele) - micotoxine cu efecte nocive la om i animale (zearalenona sau toxina F2). Limitele maxime admise i recomandate de UE pentru micotoxinele identificate la cereale i produse derivate din acestea prevzute n ordinul 145/2004 (tabel 1) Tabelul 1 Micotoxina Aflatoxine totale Aflatoxina B1 Ochratoxina A Zearalenona Unitatea de msur g/kg (ppb) g/kg (ppb) g/kg (ppb) g/kg (ppb) Limitele maxime admise 4 2 5 50

23

CAPITOLUL V
SISTEMUL DE EXPERIMENTARE Acest studiu reprezint, pe de o parte, o evaluare a florei micologice epifite i endofite care apare pe cariopsele de cereale i seminele de leguminoase dup depozitarea pe termen mediu, iar pe de alt parte, o caracterizare complex (morfologic, toxicologic, citogenetic) n vederea evitrii sau diminurii pagubelor produse de agenii patogeni fungici. Scopul prezentei cercetri const n: evaluarea fitopatologic a micoflorei epifite i endofite de pe seminele conservate la intervale diferite de timp, n depozite cu atmosfer controlat (T=+4 0C; umiditatea relativ a aerului = 30 - 40%); stabilirea influenei duratei de conservare asupra activitii micromicetelor aflate pe seminele depozitate; determinarea influenei micromicetelor asupra viabilitii seminelor depozitate pe perioade mari de timp; stabilirea unei corelaii cu privire la umiditatea seminelor conservate i evoluia activitii micoflorei de depozit; stabilirea influenei tipului de substrat mediu CGA (cartof - dextroz agar), mediu Sabouraud (extract de drojdie - dextroz - cloramfenicol agar), hrtie sugativ asupra evoluiei agenilor patogeni fungici; determinarea cantitativ a coninutului de micotoxine secretate de microorganismele fungice la cereale; analiza citogenetic la probele luate n studiu. Condiiile de experimentare pot fi grupate astfel: condiiile specifice de depozitare pentru conservare pe termen mediu: T = +4 0C (1 0C), umiditatea relativ a aerului = 30 - 40%, iar procentul de umiditate al seminelor ntre 5 - 8 % (Strjeru i colab., 2001); condiiile de laborator n care s-au realizat analize fitopatologice (prin

24

determinarea prezenei pe seminele analizate a micromicetelor specifice, dup perioade distincte de depozitare), toxicologice i citogenetice. Materialul biologic ales pentru studiu este reprezentat de populaii locale i soiuri ce aparin la 2 specii de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) i 2 specii de leguminoase (Vicia faba, Phaseolus vulgaris). n cadrul fiecrei specii s-au constituit 30 probe medii de 300 semine din colecia Bncii de Resurse Genetice Vegetale Suceava: semine conservate timp de 8 i 17 ani la T = +4 C (pentru Zea mays) semine conservate timp de 8, 15 i 18 ani la T = +4 C (pentru Triticum aestivum) semine conservate timp de 8, 18 i 23 ani la T = +4 C (pentru Vicia faba) semine conservate timp de 6 i 15 ani la T = +4 C (pentru Phaseolus vulgaris). Majoritatea probelor de semine provin din aceeai categorie biologic (populaii locale), dar s-au luat n studiu i unele soiuri (la Triticum aestivum) Probele luate n studiu au origini diferite (fig. 2, 3), provenind din expediiile de colectare realizate de Banca de Gene Suceava (cazul populaiilor locale) sau de la alte instituii de cercetare (cazul soiurilor). Pentru probele de semine studiate s-au folosit metodele clasice de analiz fitopatologic (metoda Ulster pe mediu CGA (cartof - dextroz - agar), metoda sugativei i metoda Sabouraud (extract de drojdie - dextroz cloramfenicol - agar), metoda cromatografiei n strat subire (CSS) - pentru aflatoxina B1, respectiv metoda imunoenzimatic ELISA pentru determinarea cantitativ a micotoxinelor (aflatoxinele totale B1+B2+G1+G2, ochratoxina A, zearalenona) i metoda preparatelor microscopice pentru analiza citogenetic.

25

Fig. 2, 3 - Reprezentarea pe hart a originii probelor luate n studiu

Metodele i tehnicile de cercetare aplicate Pentru a face posibil acest studiu fitopatologic de evaluare a micromicetelor prezente pe cariopsele de cereale i seminele de leguminoase, precum i pentru a evidenia implicaiilor acestora asupra scderii viabilitii probelor analizate s-au aplicat urmtoarele metode de cercetare:

26

Analiza macroscopic a seminei; Metoda Ulster (Malone i Muskett, 1941) pe mediu CGA (cartof dextroz - agar); Metoda Sabouraud (extract de drojdie - dextroz - cloramfenicol - agar); Metoda gravimetric de determinare a umiditii; Testul standard de germinaie (metoda sugativei).

CAPITOLUL VI
REZULTATE EXPERIMENTALE PRIVIND CARACTERIZAREA FITOPATOLOGIC, TOXICOLOGIC I CITOGENETIC A PROBELOR DE CEREALE I LEGUMINOASE LUATE N STUDIU 6.1. Evaluarea fitopatologic la speciile de cereale i leguminoase luate n studiu 6.1.1. Micromicetele saprofite i parazite izolate pe cariopsele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) i seminele de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate n studiu (Analiza calitativ macroscopic i microscopic) Micoflora de depozit identificat la probele de cereale luate n studiu este reprezentat de: - Torula herbarum - Oedocephalum sp. - Chaetomium sp. - Fusarium moniliforme - Tilletia tritici Aceste specii de ciuperci saprofite i parazite au aprut cu frecven ridicat la probele de Zea mays i Triticum aestivum analizate, pe aceeai smn fiind prezente mai multe microorganisme fungice care au atacat nveliurile exterioare ale seminei sau au produs infecii n interior la

27

nivelul embrionului, fr ca acestea s determine diminuarea accentuat a facultii germinative a seminelor.

Foto 1 - Conidii n lan de Torula herbarum pe mediu CGA la Triticum aestivum n cmpul microscopic (original)

Foto 2 - 4 Conidiofori cu conidii de Oedocephalum sp. pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 5 - 7 - Peritecie cu peri de Chaetomium sp. pe mediu CGA la Triticum aestivum n cmpul microscopic (original) 28

Foto 8 - 10 - Peritecie cu peri de Chaetomium sp. pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 11 - 12 - Hife i microconidii de Fusarium moniliforme pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original) 29

Foto 13 - 15 - Colonii de Fusarium moniliforme pe mediu Sabouraud la Zea mays (original)

Foto 16 - Teliospori de Tilletia tritici la Triticum aestivum n cmpul microscopic (original)

30

Foto 17 - 21 - Clamidospori de Tilletia tritici la Triticum aestivum la microscopul electronic (original)

Micoflora de depozit identificat la probele de leguminoase luate n studiu este reprezentat de: - Stachybotrys atra - Botrytis fabae - Uromyces viciae - fabae, ultimele 2 specii fiind componente ale micoflorei de cmp ce apar n timpul vegetaiei plantelor, producnd pierderi de

31

randament, scderea masei a 1000 de semine, reducerea vigorii i calitii acestora. De asemenea, aceste micromicete influeneaz facultatea germinativ, produc putrezirea seminei nainte de apariia radiculei cnd sunt incubate i determin apariia de plantule anormale la rsrit. Dup rsrit atac plantele mam, organele reproductoare i seminele. Aceste ciuperci contamineaz smna nainte de recoltare i n perioada de depozitare (Plcint, 2007).

Foto 22, 23 - Conidiofori i conidii de Stachybotrys atra pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

Foto 24 - Colonie de Botrytis fabae pe mediu CGA la Vicia faba (original)

32

Foto 25 - Conidiofori cu conidii de Botrytis fabae pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

Foto 26 - Uredospori i teleutospori de Uromyces viciae - fabae la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

33

Foto 27 - 29 - Uredospori i teleutospori de Uromyces viciae - fabae la Vicia faba la microscopul electronic (original) Micoflora de depozit identificat att la cereale, ct i la leguminoase este reprezentat de microorganismele fungice saprofite: Alternaria alternata, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillium commune, Penicillium notatum (chrysogenum), variabile, Penicillium viridicatum, Rhizopus Penicillium nigricans, rugulosum, Epicoccum Penicillium Mucor mucedo,

purpurascens, Trichoderma viride, Trichothecium roseum, Cladosporium herbarum, Stemphylium botryosum. Dintre acestea, unele sunt productoare de micotoxine, cum sunt cele din grupul Aspergillus, Penicillium. Din grupul celor antagoniste fac parte Trichoderma viride i Epicoccum purpurascens, care afecteaz facultatea germinativ a seminelor depozitate. Au o mare capacitate de inhibare i distrugere a patogenilor, nainte ca acetia s produc pagube, au o capacitate de diseminare rapid, pot supravieui n condiii extreme i nu afecteaz plantele n cursul perioadei de vegetaie (Iacob i colab., 1998).

34

Agenii patogeni fungici sunt prezeni pe plante nainte de recoltare, n momentul recoltrii, n timpul depozitrii, n raport cu condiiile de depozitare (Bontea, 1953).

Foto 30 - 31 - Colonii de Alternaria alternata pe mediu CGA la Vicia faba (original)

Foto 32 - Conidii de Alternaria alternata pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original)

Foto 33 - Conidii de Alternaria alternata pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

35

Foto 34 - Colonie de Aspergillus flavus pe mediu CGA la Zea mays (original)

Foto 35 - Colonie de Aspergillus flavus pe mediu Sabouraud la Vicia faba i Phaseolus vulgaris (original)

Foto 36, 37 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus flavus pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

36

Foto 38 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus flavus pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 39, 40- Conidiofori cu conidii de Aspergillus flavus pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original)

Foto 41 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus ochraceus pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original)

37

Foto 42 - 44 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus ochraceus pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 45 - 46 - Conidiofori cu conidii de Aspergillus ochraceus pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

38

Foto 48 - Colonii de Penicillium chrysogenum (notatum) pe mediu CGA Foto 47 - Colonie de Penicillium rugulosum pe mediu CGA la Vicia faba (original) la Vicia faba (original)

Foto 49, 50 - Semine de Vicia faba infectate de Penicillium sp. pe hrtie sugativ (original) Foto 51 - Aversul i reversul coloniei de Penicillium variabile pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)

39

Foto 52 - 56 - Colonii de Penicillium commune pe mediu CGA i Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)

40

Foto 57 - 62 - Colonii de Penicillium rugulosum pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)

Foto 63 - 66 - Colonii de Penicillium viridicatum pe mediu Sabouraud la Vicia faba (original)

41

Foto 67 - Conidiofori cu conidii de Penicillium notatum (chrysogenum) pe mediu Sabouraud la Triticum aestivum n cmpul microscopic (original)

Foto 68 - Conidiofori cu conidii de Penicillium variabile pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

Foto 69 - Conidiofori cu conidii de Penicillium rugulosum pe mediu Sabouraud la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

42

Foto 70, 71 - Conidiofori cu conidii de Penicillium commune pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original)

Foto 72 - Conidiofori cu conidii de Penicillium rugulosum pe mediu Sabouraud la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 73 - 76 - Conidiofori cu conidii de Penicillium rugulosum pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original) 43

Foto 77 - 80 - Conidiofori cu conidii de Penicillium notatum (chrysogenum) pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

44

Foto 81 - 83 - Conidiofori cu conidii de Penicillium chrysogenum (notatum) pe mediu CGA la Triticum aestivum n cmpul microscopic (original)

Foto 84 - Colonie de Mucor mucedo pe mediu CGA la Vicia faba (original)

Foto 85 - Colonie de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Vicia faba (original) Foto 86 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Vicia faba (original)

Foto 87 - Colonie de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Zea mays (original)

45

Foto 88 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

Foto 89, 90 - Sporangiofor

de Mucor mucedo pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 91 - Sporangiofor de Mucor mucedo pe mediu Sabouraud la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 92 - Colonie de Rhizopus nigricans pe mediu CGA la Zea mays (original)

46

Foto 93 - Sporangiofori de Rhizopus nigricans pe mediu CGA la Zea mays n cmpul microscopic (original)

Foto 94, 95 - Sporange cu spori i rizoizi de Rhizopus nigricans pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original)

Foto 96 - Sporangiofori de Rhizopus nigricans pe mediu Sabouraud la Zea mays n cmpul microscopic (original)

47

Foto 97, 98 - Sporange cu spori i rizoizi de Rhizopus nigricans pe mediu Sabouraud la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

Foto 99, 100 - Colonii de Epicoccum purpurascens pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)

Foto 101 - Conidiofori cu conidii de Epicoccum purpurascens pe mediu CGA la Triticum aestivum n cmpul microscopic (original)

48

Foto 102, 103 - Conidiofori cu conidii de Epicoccum purpurascens la Vicia faba la microscopul electronic (original)

Foto 104 - Colonie de Trichoderma viride pe mediu CGA la Vicia faba (original)

Foto 105 - Colonie de Trichoderma viride pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)

49

Foto 106 - Conidiofori cu conidii de Trichoderma viride pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris n cmpul microscopic (original)

Foto 107 - Colonie de Trichothecium roseum pe mediu Sabouraud la Zea mays (original)

Foto 108 - Conidiofori cu conidii de Trichothecium roseum pe mediu Sabouraud la Zea mays (original)

Foto 109 - Colonii de Cladosporium herbarum pe mediu CGA la Vicia faba (original)

50

Foto 110 - Colonii de Cladosporium herbarum pe mediu Sabouraud la Phaseolus vulgaris (original)

Foto 111 - Conidiofori cu conidii de Cladosporium herbarum pe mediu CGA la Zea mays (original)

Foto 112 - Conidiofori i conidii de Cladosporium herbarum la Triticum aestivum la microscopul electronic (original)

51

Foto 113 - Colonie de Stemphylium botryosum pe mediu CGA la Phaseolus vulgaris (original)

Foto 114 - Conidie de Stemphylium botryosum pe mediu CGA la Vicia faba n cmpul microscopic (original)

6.1.2. Evaluarea aciunii micoflorei epifite i endofite de depozit (Analiza cantitativ prin cuantificarea datelor i interpretarea rezultatelor) Rezultatele experimentale obinute n cadrul acestui studiu au rspuns urmtoarelor obiective: utilizat; Evidenierea corelaiilor ntre evoluia micromicetelor identificate, perioadele de depozitare a seminelor i tipul de substrat folosit. Evaluarea aciunii micromicetelor pe cariopsele i seminele analizate Identificarea microorganismelor fungice n funcie de perioada de Identificarea genurilor de micromicete n funcie de tipul de substrat prin indicarea numrului de cariopse infectate i a genurilor de ciuperci izolate; depozitare a cariopselor analizate;

52

Cuantificarea elementelor analizate s-a realizat astfel: - Micromicetele s-au evaluat prin numrarea cariopselor i seminelor infectate, iar frecvena atacului s-a exprimat n procente, realizndu-se prin estimarea vizual a suprafeei cariopsei. Informaiile obinute n urma analizelor i determinrilor efectuate sunt prezentate n tabele i grafice, iar la o parte dintre acestea s-au folosit metode statistice de calcul, pentru evidenierea unor corelaii i regresii semnificative ntre diferite elemente (Ceapoiu, 1968). 6.1.2.1. Evaluarea aciunii micoflorei epifite i endofite de depozit ntlnit la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) luate n studiu

100%

80%

60%

40%

20%

0% SVGB-7249 SVGB-7902 SVGB-3714 SVGB-3773 SVGB-1667 SVGB-1685 SVGB-3553 SVGB-1660 SVGB-1629 SVGB-1789 SVGB-1695 SVGB-1658 SVGB-3681 SVGB-3611 SVGB-1600 SVGB-5191 SVGB-1226 SVGB-3829 SVGB-5397 SVGB-5465 SVGB-5220 SVGB-1627 SVGB-1594 SVGB-1654 SVGB-11265 SVGB-11267 SVGB-11255 SVGB-13769 SVGB-13797 SVGB-1784

+ 40C - 8 ani Penicillium sp. Alternaria alternata Aspergillus sp Trichothecium roseum Rhizopus sp. Chaetomium sp. Mucor sp.

+ 40C - 17 ani Cladosporium herbarum Oedocephalum sp.

Fusarium moniliforme

Fig.

4 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe mediu CGA la

probele de Zea mays depozitate n condiii de mediu controlate (+ 40 C, pe o perioad de depozitare de 8 i respectiv 17 ani)

53

100%

80%

60%

40%

20%

SVGB-7249

SVGB-7902

SVGB-3714

SVGB-3773

SVGB-1667

SVGB-1685

SVGB-3553

SVGB-1660

SVGB-1629

SVGB-1789

SVGB-1695

SVGB-1658

SVGB-3681

SVGB-3611

SVGB-1600

SVGB-5191

SVGB-1226

SVGB-3829

SVGB-5397

SVGB-5465

SVGB-5220

SVGB-1627

SVGB-1594

SVGB-1654

SVGB-11265

SVGB-11267

SVGB-11255

SVGB-13769

SVGB-13797

+ 40C - 8 ani Penicillium sp. Cladosporium herbarum Aspergillus sp. Alternaria alternata

+ 40C - 17 ani Rhizopus sp. Trichothecium roseum

Fig. 5 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe hrtie sugativ la probele de Zea mays depozitate n condiii de mediu controlate (+ 40 C, pe o perioad de depozitare de 8 i respectiv 17 ani)

Evidenierea corelaiilor ntre evoluia micromicetelor izolate pe probele de Zea mays luate n studiu i perioadele diferite de depozitare (8 i 17 ani) La nivelul probelor de Zea mays analizate, s- a evideniat un numr redus de corelaii asigurate statistic la ambele perioade de depozitare. Dup 17 ani de depozitare a cariopselor de Zea mays la temperatura de + 4 C, exist doar dou corelaii pozitive semnificative ntre aciunea agenilor patogeni fungici Mucor sp. x Aspergillus sp. i Cladosporium herbarum x Penicillium sp.

54

SVGB-1784

0%

100%

80%

60%

40%

20%

0% SVGB-7244 SVGB-7363 SVGB-7441 SVGB-8790 SVGB-8823 SVGB-8824 SVGB-8909 SVGB-9186 SVGB-9188 SVGB-9485 SVGB-9515 SVGB-9519 SVGB-9521 SVGB-2539 SVGB-2569 SVGB-5148
SVGB-2539

SVGB-14059

SVGB-14125

SVGB-15018

SVGB-15203

SVGB-15972

SVGB-10261

SVGB-12781

SVGB-12784

SVGB-12791

SVGB-12799

SVGB-12804

SVGB-12812

+ 40C - 8 ani

+ 40C - 15 ani

SVGB-12832

+ 40C - 18 ani

Penicillium sp. Trichoderma viride

Rhizopus sp. Torula herbarum

Epicoccum sp. Stemphylium botryosum

Cladosporium herbarum Chaetomium sp.

Alternaria alternata

Fig.

6 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe mediu CGA la

probele de Triticum aestivum depozitate n condiii de mediu controlate (+ 4 0C, pe o perioad de depozitare de 8, 15 i respectiv 18 ani)
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%
SVGB-7244 SVGB-7363 SVGB-7441 SVGB-8790 SVGB-8823 SVGB-8824 SVGB-8909 SVGB-9186 SVGB-9188 SVGB-9485 SVGB-9515 SVGB-9519 SVGB-9521 SVGB-2569 SVGB-5148 SVGB-14059 SVGB-14125 SVGB-15018 SVGB-15203 SVGB-15972 SVGB-10261 SVGB-12781 SVGB-12784 SVGB-12791 SVGB-12799 SVGB-12804 SVGB-12812 SVGB-12832 SVGB-5521

0%

+ 40C - 8 ani Penicillium sp. Alternaria alternata

+ 40C -15 ani Rhizopus sp. Trichoderma viride

+ 40C - 18 ani Cladosporium herbarum Torula herbarum

Fig. 7 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe hrtie sugativ la probele de Triticum aestivum depozitate n condiii de mediu controlate (+ 4 0C, pe o perioad de depozitare de 8, 15 i respectiv 18 ani)

55

SVGB-5521

Evidenierea corelaiilor ntre evoluia micromicetelor izolate pe probele de Triticum aestivum luate n studiu i perioadele diferite de depozitare (8, 15 i 18 ani) La nivelul probelor de Triticum aestivum analizate, s-a evideniat un numr ridicat de corelaii asigurate statistic la probele depozitate 8 ani, dup cum urmeaz: Trichoderma viride x Alternaria alternata - corelaie negativ semnificativ; Torula herbarum x Epicoccum sp. - corelaie negativ semnificativ; Torula herbarum x Cladosporium herbarum - corelaie negativ foarte semnificativ; Stemphylium botryosum corelaz negativ semnificativ cu Cladosporium herbarum i Trichoderma viride i pozitiv semnificativ cu Torula herbarum i Alternaria alternata; Chaetomium sp. coreleaz negativ semnificativ cu Alternaria alternata, negativ foarte semnificativ cu Stemphylium botryosum i pozitiv semnificativ cu Trichoderma viride.

3,5 Cariopse infectate cu agentul patogen fungic 3

Cladosporium herbarum

y = -0,5x + 3,2 r = 0,977***

2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 1 2 3 4 5 6 7

Cariopse infectate cu agentul patogen fungic Torula herb arum

Fig. 8 - Dreapta de regresie pentru corelaia dintre numrul de cariopse infectate de Torula herbarum i numrul de cariopse infectate de Cladosporium herbarum pe probele de Triticum aestivum depozitate timp de 8 ani n condiii de mediu controlate (+ 4 0C)

56

n condiiile pstrrii cariopselor la temperatura de + 4 0C, dup o perioad de depozitare de 8 ani, Torula herbarum inhib aciunea agentului patogen fungic Cladosporium herbarum. 6.1.2.2. Evaluarea aciunii micoflorei epifite i endofite de depozit ntlnit la probele de leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate n studiu

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% SVGB-13906 SVGB-13936 SVGB-13941 SVGB-13944 SVGB-13946 SVGB-13972 SVGB-14001 SVGB-14006 SVGB-14022 SVGB-14046 SVGB-14057 SVGB-14060 SVGB-14061 SVGB-14065 SVGB-14080 SVGB-14105 SVGB-14106 SVGB-14175 SVGB-14180 SVGB-14185 SVGB-14204 SVGB-13626 SVGB-13628 SVGB-13639 SVGB-13749 SVGB-13750 SVGB-13751 SVGB-13775 SVGB-13776 SVGB-13777

+ 4 C - 6 ani
Penicillium sp. Alternaria alternata Aspergillus sp. Trichothecium roseum Rhizopus sp. Trichoderma viride

+ 4 C - 15 ani
Epicooccum sp. Stachybotrys atra Cladosporium herbarum Stemphylium botryosum

Fig. 9 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe mediu CGA la probele de Phaseolus vulgaris depozitate n condiii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioad de depozitare de 6 i 15 de ani)

57

100%

80%

60%

40%

20%

0%
SVGB-13906 SVGB-13936 SVGB-13941 SVGB-13944 SVGB-13946 SVGB-13972 SVGB-14001 SVGB-14006 SVGB-14022 SVGB-14046 SVGB-14057 SVGB-14060 SVGB-14061 SVGB-14065 SVGB-14080 SVGB-14105 SVGB-14106 SVGB-14175 SVGB-14180 SVGB-14185 SVGB-14204 SVGB-13626 SVGB-13628 SVGB-13639 SVGB-13749 SVGB-13750 SVGB-13751 SVGB-13775 SVGB-13776 SVGB-13777

+ 4 C - 6 ani
Penicillium sp. Alternaria alternata Aspergillus sp. Trichothecium roseum Rhizopus sp. Trichoderma viride

+ 4 C - 15 ani
Cladosporium herbarum

Fig. 10 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe hrtie sugativ la probele de Phaseolus vulgaris depozitate n condiii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioad de depozitare de 6 i 15 ani)

Evidenierea corelaiilor ntre evoluia micromicetelor izolate pe probele de Phaseolus vulgaris luate n studiu i perioadele diferite de depozitare (6 i 15 ani) La nivelul probelor de Phaseolus vulgaris analizate, s-a evideniat un numr redus de corelaii asigurate statistic la ambele perioade de depozitare. Dup 15 ani de depozitare a seminelor de Phaseolus vulgaris la temperatura de 4C, exist numai o singur corelaie pozitiv foarte semnificativ ntre aciunea agenilor patogeni fungici Rhizopus sp. x Aspergillus sp. n condiiile pstrrii seminelor la temperatura de + 4 0C, alturi de genul Aspergillus apare i Rhizopus sp.

58

12 Numr semine infectate de Rhizopus sp. 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 Numr semine infectate de Aspergillus sp .

y = 2,5625x + 0,75 r = 0,925 ***

Fig. 11 - Dreapta de regresie pentru corelaia dintre numrul de semine infectate vulgaris depozitate n condiii de mediu controlate (+ 4 0C) timp de 15 ani

de

Aspergillus sp. i numrul de semine infectate de Rhizopus sp. pe probele de Phaseolus

100%

80%

60%

40%

20%

0% SVGB-175 SVGB-176 SVGB-179 SVGB-196 SVGB-203 SVGB-212 SVGB-232 SVGB-268 SVGB-270 SVGB-272 SVGB-278 SVGB-285 SVGB-293 SVGB-280 SVGB-298 SVGB-300 SVGB-308 SVGB-333 SVGB-271 SVGB-273 SVGB-279 SVGB-282 SVGB-290 SVGB-3128 SVGB-4278 SVGB-4279 SVGB-4280 SVGB-4281 SVGB-4283 SVGB-303

+ 4 C - 8 ani

+ 4 C - 18 ani

+ 4 C - 23 ani

Penicillium sp. Mucor sp.

Aspergillus sp Trichothecium roseum

Rhizopus sp. Trichoderma viride

Epicoccum sp. Botrytis fabae

Cladosporium herbarum Stachybotrys atra

Alternaria alternata Stemphylium botryosum

Fig. 12 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe mediu CGA la probele de Vicia faba depozitate n condiii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioad de depozitare de 8, 18 i 23 de ani)

59

100%

80%

60%

40%

20%

0% SVGB-175 SVGB-176 SVGB-179 SVGB-196 SVGB-203 SVGB-212 SVGB-232 SVGB-268 SVGB-270 SVGB-272 SVGB-278 SVGB-285 SVGB-293 SVGB-280 SVGB-298 SVGB-300 SVGB-308 SVGB-333 SVGB-271 SVGB-273 SVGB-279 SVGB-282 SVGB-3128 SVGB-4278 SVGB-4279 SVGB-4280 SVGB-4281 SVGB-4283 SVGB-290

+ 4 C - 8 ani

+ 4 C - 18 ani

+ 4 C - 23 ani

Penicillium sp.

Aspergillus sp.

Rhizopus sp.

Cladosporium herbarum

Alternaria alternata

Trichothecium roseum

Botrytis fabae

Fig. 13 - Procentele de infecie ale agenilor patogeni fungici izolai pe hrtie sugativ la probele de Vicia faba depozitate n condiii de mediu controlate (+4 0C, pe o perioad de depozitare de 8, 18 i 23 de ani)

Evidenierea corelaiilor ntre evoluia micromicetelor izolate pe probele de Vicia faba luate n studiu i perioadele diferite de depozitare (8, 18 i respectiv 23 ani) La nivelul probelor de Vicia faba analizate, s-au evideniat corelaii asigurate statistic la toate cele trei perioade de depozitare. Dup 8 ani de conservare a seminelor de Vicia faba la temperatura de + 4 C se observ c exist 5 corelaii negative distinct semnificative ntre aciunea urmtorilor ageni patogeni fungici: Stachybotrys atra x Epicoccum sp., Trichothecium roseum x Rhizopus sp., Stemphylium botryosum x Epicoccum sp., Stachybotrys atra x Rhizopus sp., i Trichothecium roseum x Epicoccum sp., precum i o corelaie pozitiv distinct semnificativ ntre aciunea microorganismelor fungice Alternaria alternata x Rhizopus sp.

60

6.1.2.3. Determinarea numrului total de colonii de microorganisme fungice identificate prin metoda Sabouraud la probele de cereale i leguminoase luate n studiu Pe mediu Sabouraud numrul cel mai mare de uniti formatoare de colonii (UFC/ml) din numrul de colonii obinut n vasele Petri s-a nregistrat la probele de Zea mays i Vicia faba luate n studiu. 6.2. Evaluarea aciunii micromicetelor identificate asupra germinaiei cariopselor de cereale i seminelor de leguminoase luate n studiu, n funcie de umiditatea acestora

105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
SVGB-7249 SVGB-7902 SVGB-3714 SVGB-3773 SVGB-1667 SVGB-1685 SVGB-3553 SVGB-1660 SVGB-1629 SVGB-1789 SVGB-1695 SVGB-1658 SVGB-3681 SVGB-3611 SVGB-1600 SVGB-5191 SVGB-1226 SVGB-3829 SVGB-5397 SVGB-5465 SVGB-5220 SVGB-1627 SVGB-1594 SVGB-1654 SVGB-11265 SVGB-11267 SVGB-11255 SVGB-13769 SVGB-13797 SVGB-1784

30

25

20

15

10

+ 4 C - 8 ani

+ 4 C - 17 ani

Germinaia cariopselor

Umiditatea cariopselor

Cariopse infectate

Fig. 14 - Germinaia probelor de Zea mays luate n studiu i numrul de cariopse infectate n funcie de umiditatea acestora, n condiiile conservrii la temperatura de +4 0C timp de 8 i 17 ani

61

105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
SVGB-14059 SVGB-14215 SVGB-15018 SVGB-15203 SVGB-15972 SVGB-10261 SVGB-12781 SVGB-12784 SVGB-12791 SVGB-12799 SVGB-12804 SVGB-12812 SVGB-12832 SVGB-7244 SVGB-7363 SVGB-7441 SVGB-8790 SVGB-8823 SVGB-8824 SVGB-8909 SVGB-9186 SVGB-9188 SVGB-9485 SVGB-9515 SVGB-9519 SVGB-9521 SVGB-2539 SVGB-2569 SVGB-5148 SVGB-5521

35

30

25

20

15

10

+ 4 C - 8 ani

+ 4 C - 15 ani

+ 4 C - 18 ani

Germinaia cariopselor

Umiditatea cariopselor

Cariopse infectate

Fig. 15 - Germinaia probelor de Triticum aestivum luate n studiu i numrul de cariopse infectate n funcie de umiditatea acestora, n condiiile conservrii la temperatura de +4 0C timp de 8, 15 i 18 ani
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
SVGB-13906 SVGB-13936 SVGB-13941 SVGB-13944 SVGB-13946 SVGB-13972 SVGB-14001 SVGB-14006 SVGB-14022 SVGB-14046 SVGB-14057 SVGB-14060 SVGB-14061 SVGB-14065 SVGB-14080 SVGB-14105 SVGB-14106 SVGB-14175 SVGB-14180 SVGB-14185 SVGB-14204 SVGB-13626 SVGB-13628 SVGB-13639 SVGB-13749 SVGB-13750 SVGB-13751 SVGB-13775 SVGB-13776 SVGB-13777

35

30

25

20

15

10

+ 4 C - 6 ani

+ 4 C -15 ani

Germinaia seminelor

Umiditatea seminelor

Semine infectate

Fig. 16 - Germinaia probelor de Phaseolus vulgaris luate n studiu i numrul de semine infectate n funcie de umiditatea acestora, n condiiile conservrii la temperatura de +4 0C timp de 6 i 15 ani

62

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

35

30

25

20

15

10

5
10 0
SVGB-175 SVGB-176 SVGB-179 SVGB-196 SVGB-203 SVGB-212 SVGB-232 SVGB-268 SVGB-270 SVGB-272 SVGB-278 SVGB-285 SVGB-293 SVGB-280 SVGB-298 SVGB-300 SVGB-308 SVGB-333 SVGB-271 SVGB-273 SVGB-279 SVGB-282 SVGB-290 SVGB-3128 SVGB-4278 SVGB-4279 SVGB-4280 SVGB-4281 SVGB-4283 SVGB-303

+ 4 C - 8 ani

+ 4 C - 18 ani

+ 4 C - 23 ani

Germinaia seminelor

Umiditatea seminelor

Semine infectate

Fig. 17 - Germinaia probelor de Vicia faba luate n studiu i numrul de semine infectate n funcie de umiditatea acestora, n condiiile conservrii la temperatura de +4 0C timp de 8, 18 i 23 ani

6.3. Determinarea cantitativ toxicologic a micotoxinelor secretate de micromicetele ntlnite la probele de cereale luate n studiu (Zea mays, Triticum aestivum) 6.3.1. Determinarea aflatoxinei B1 din cereale prin metoda

cromatografiei n strat subire (C.S.S.) Prin interpretarea cromatogramei obinute dup developare, la camera U.V. nu s-a confirmat prezena aflatoxinei B1 pe probele de cereale luate n studiu (30 probe de Zea mays i 30 probe de Triticum aestivum), observndu-se doar prezena standardului, probele fiind negative.

Foto 115 - Interpretarea cromatogramei la camera U.V. (original)

63

6.3.2. Determinarea cantitativ a aflatoxinelor totale (B1+B2+G1+G2) din cereale prin metoda ELISA Prin determinarea concentraiei aflatoxinei totale la cele 30 de probe de Zea mays, doar 2 probe au avut o concentraie de aflatoxine totale peste limita maxim admis de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB - 13797 i SVGB 13769, cu concentraiile 5634,46 g/kg ppt (5,64 g/kg ppb), respectiv 4943,09 g/kg ppt (4,94 g/kg ppb). n acest caz, aflatoxinele au fost secretate de microorganismele fungice din genurile Penicillium, Aspergillus i Rhizopus. La Triticum aestivum, doar 3 probe au avut o concentraie de aflatoxine totale peste limita maxim admis de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB - 14215, SVGB - 15203 i SVGB - 15018, cu concentraiile 7124,10 g/kg ppt (7,12 g/kg ppb), 6867,61 g/kg ppt (6,87 g/kg ppb), respectiv 6962,28 g/kg ppt (6,96 g/kg ppb). Cele 3 probe au un numr ridicat de cariopse infectate cu Penicillium sp. i Rhizopus sp.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 SVGB-14215 Penicillium sp. SVGB-15018 Rhizopus sp. 4 6 6 7,1 7 7 6,8

8 6,9

SVGB-15203

Concentraia de aflatoxin

Fig. 18 - Agenii patogeni saprofii izolai pe probele de Triticum aestivum ce au prezentat concentraii ridicate de aflatoxine totale

64

6.3.3. Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din cereale prin metoda ELISA cu purificare pe coloana de imunoafinitate Prin determinarea concentraiei ochratoxinei A la cele 30 de probe de Zea mays, doar 4 probe au prezentat o concentraie de ochratoxin A peste limita maxim admis de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB - 13797, SVGB 11265, SVGB - 11255 i SVGB -11267 cu concentraiile 8,09 g/kg ppb (8090 g/kg ppt), 7,71 g/kg ppb (7710 g/kg ppt), 8, 51 g/kg ppb (8510 g/kg ppt) i 10,17 g/kg ppb (1017g/kg ppt). Toate cele 4 probe au un numr ridicat de cariopse infectate cu Penicillium sp. i Aspergillus sp.

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 SVGB-11255 2 8 8,09

17 14

10,17 7,71 8,61

5 3 1 0 SVGB-13797 Aspergillus sp. SVGB-11265 SVGB-11267

Penicillium sp.

Concentraia de ochratoxin

Fig. 19 - Agenii patogeni saprofii izolai pe probele de Zea mays ce au prezentat concentraii ridicate de ochratoxin A

La Triticum aestivum, doar 4 probe au avut o concentraie de ochratoxin A peste limita maxim admis de UE, fiind considerate astfel pozitive (SVGB 14215, SVGB - 15018, cu concentraiile 7,95 g/kg ppb (7950 g/kg ppt), 12,34 g/kg ppb (1234 g/kg ppt). n acest caz, ochratoxina A a fost secretat de speciile genului Penicillium.

65

6.3.4. Determinarea cantitativ a zearalenonei din probele de Zea mays luate n studiu prin metoda ELISA Prin determinarea concentraiei de zearalenon la cele 30 de probe de Zea mays s-a observat c toate probele au avut o concentraie de zearalenon sub limita maxim admis de UE, fiind considerate astfel negative. 6.4. Modificrile citogenetice induse de agenii patogeni fungici la probele de cereale (Zea mays, Triticum aestivum) i leguminoase (Phaseolus vulgaris, Vicia faba) luate n studiu Alterarea materialului genetic al seminelor sub aciunea infestrii cu ageni patogeni fungici a fost studiat, la nivel celular, pentru 3 specii: Zea mays, Phaseolus vulgaris i Vicia faba. Modificrile citogenetice induse de agenii patogeni fungici nu au fost cercetate i pentru specia Triticum aestivum 2n = 6x = 42 din cauza fenomenului de hexaploidie care mpiedic o comparaie corect cu celelalte 3 specii. n cazul probelor luate n studiu au fost analizate: indicele mitotic i frecvena fazelor diviziunii mitotice n apexul radicular, frecvena aberaiilor interfazice totale i a tipurilor de aberaii interfazice, frecvena aberaiilor cromozomiale totale i a tipurilor de aberaii cromozomiale n ana-telofaza (A-T) mitozei. La Vicia faba s-a observat i apariia de interfaze cu un micronucleu i, n procent foarte mic interfaze cu dou micronuclee (foto 116, 117).

Foto 116 - Interfaz cu micronucleu la proba SVGB - 300 (original) 66

Foto 117 - Continuitate cromatic ntre nucleu i micronucleu n interfaz la proba SVGB - 271 (original)

Tipurile de aberaii cromozomiale prezint o mare varietate, fiind distribuite aleatoriu. S-au nregistrat aberaii cromozomiale simple, de tipul: o punte, un micronucleu, dou micronuclee, A-T tripolare, cromozomi expulzai i cteva aberaii cromozomiale complexe, de tipul: o punte cu dou micronuclee i A-T tripolar cu cromozom expulzat (foto 118 - 124). Frecvena cea mai ridicat o nregistreaz micronucleele, ana-telofazele tripolare i cromozomii expulzai.

Foto 118 - Ana- telofaz cu 2 fragmente la proba SVGB - 272 (original)

Foto 119 - Anafaz multipolar la proba SVGB - 271 (original)

Foto 120 - Ana- telofaz cu fragmente la proba SVGB- 300 (original)

67

Foto 121 - Ana- telofaz cu o punte (SVGB - 272) - original Foto 122 - Ana - telofaz hexapolar (SVGB - 271) - original

Foto 123 - Telofaz cu micronuclee (SVGB - 272) - original

Foto 124 - Ana - telofaz pentapolar cu punte i cromozomi expulzai (SVGB - 271) - original

68

CONCLUZII
Micoflora de depozit dezvoltat pe seminele speciilor luate n studiu (Zea mays, Triticum aestivum, Vicia faba i Phaseolus vulgaris), care au fost depozitate n condiii controlate de mediu n Banca de Gene Suceava a fost analizat n funcie de genotip, de durata de conservare a seminelor, de tipul de substrat folosit i astfel s-au stabilit unele corelaii ntre evoluia micromicetelor izolate pe semine, precum i influena aciunii acestora asupra facultii germinative a seminelor. 1. Din cele 120 de probe supuse testrii viabilitii n condiii de laborator, dup perioade diferite de conservare, n condiii controlate de mediu, majoritatea au prezentat o germinaie de peste 85 %. 2. Cariopsele cerealelor i seminele leguminoaselor luate n studiu, plasate pe mediu CGA, mediu Sabouraud i hrtie sugativ, dup perioada de incubare, au prezentat un grad de infecie diferit cu microorganisme fungice n funcie de tipul de substrat i perioada de pstrare a probelor luate n studiu. 3. Toate genurile de micromicete au fost izolate pe un numr mult mai mic de semine atunci cnd probele analizate au fost incubate pe hrtie sugativ, n comparaie cu numrul de semine plasate pe mediu CGA (cartof - dextroz agar). 4. Durata de conservare a influenat longevitatea agenilor patogeni fungici, n sensul c cu ct aceasta este mai mare, cu att gradul de infecie este mai redus. 5. La fiecare specie analizat, pe probele luate n studiu, toi agenii patogeni fungici identificai au avut o comportare foarte diferit, n funcie de vechimea seminelor. 6. Pe mediu Sabouraud (extract de drojdie - dextroz - cloramfenicol agar), numrul cel mai mare de uniti formatoare de colonii (UFC/ml) s-a nregistrat la probele de Zea mays i Vicia faba luate n studiu. 7. Pe mediu CGA, comparativ cu mediul Sabouraud, dup incubarea seminelor s-a izolat o diversitate mai mare de ageni patogeni fungici. 69

8. Germinaia probelor luate n studiu nu a fost influenat foarte mult de gradul de infecie al seminelor cu ageni patogeni fungici, ceea ce demonstreaz c prin conservarea probelor n condiii de atmosfer controlat, pe perioade diferite de timp, scderea germinaiei nu este determinat numai de apariia micromicetelor. Creterea frecvenei apariiei micromicetelor pe semine este determinat de un complex de factori (genotip, compoziie chimic, rezisten genetic) care mpreun pot duce la scderea viabilitii seminelor. De asemenea, ntruct localitiile de provenien a probelor luate n studiu sunt diferite, putem concluziona c procentul de transmitere a infeciilor este n funcie de localitate, starea fitosanitar a seminelor depinznd de tehnologia i condiiile climatice din perioada formrii, maturizrii i recoltrii acestora. 9. n vederea stabilirii aciunii complementare a unor micromicete identificate pe seminele probelor luate n studiu n diferite perioade de conservare, s-au determinat coeficienii de corelaie ntre aciunea agenilor patogeni fungici identificai pe probele de cereale i leguminoase analizate. La nivelul probelor luate n studiu, s-au nregistrat 9 corelaii foarte semnificative asigurate statistic Torula herbarum x Cladosporium herbarum, Chaetomium sp. x Stemphylium botryosum (corelaii negative - la Triticum aestivum), Stachybotrys atra x Epicoccum sp., Trichothecium roseum x Rhizopus sp., Stemphylium botryosum x Epicoccum sp., Stachybotrys atra x Rhizopus sp., Trichothecium roseum x Epicoccum sp. (corelaii negative - la Vicia faba), Rhizopus sp. x Aspergillus sp. (corelaie pozitiv - la Phaseolus vulgaris) i Alternaria alternata x Rhizopus sp. (corelaie pozitiv - la Vicia faba). 10. Prin evaluarea aciunii micoflorei de depozit ntlnit la probele luate n studiu s-a observat c toate probele care au avut o concentraie ridicat de aflatoxine totale i ochratoxin A au fost pstrate 8 ani la temperatura de + 4 0C. 11. Toate probele cu un numr mare de cariopse infectate, pe lng coninutul ridicat de aflatoxin total au prezentat i o concentraie ridicat de ochratoxin A, ceea ce demonstreaz corelaia dintre micotoxinele secretate de microorganismele fungice toxinogene i numrul de cariopse infectate.

70

12.

Determinarea

micotoxinelor

secretate

de

microorganismele

toxinogene a avut un rol important n determinarea mai precis a unor specii de Aspergillus i Penicillium. 13. Determinarea micotoxinelor din cariopsele cerealelor destinate conservrii genetice reprezint o activitate primordial n bncile de gene, prevenindu-se astfel contaminarea acestora prin regenerarea sau multiplicarea germoplasmei n cmpurile experimentale sau prin folosirea de ctre diveri utilizatori externi. 14. Studiul modificrilor citogenetice induse de agenii patogeni fungici la probele luate n studiu a artat c, n general, valorile indicelui mitotic scad proporional cu creterea numrului de micromicete care infesteaz seminele i cu creterea perioadei de conservare a seminelor. Agenii patogeni fungici au dus la apariia unui numr relativ crescut, dar semnificativ din punct de vedere statistic, de aberaii interfazice i de aberaii cromozomiale n ana-telofaza mitozei la toate probele analizate i la toate speciile studiate prin comparaie cu probele martor. 15. Dup analiza minuioas a rezultatelor obinute i compararea lor cu datele din literatura de specialitate putem afirma c efectele citogenetice produse de infestarea cu ageni patogeni fungici sunt similare cu cele produse de aciunea unui agent mutagen slab.

71

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
Anghel Gh., Raianu M., Matei C., Bucurescu N., Rdulescu I., Anganu I., Velea C.,

1959, Determinarea calitii seminelor, Ed. Academiei Romne, Bucureti, 31 - 35, 199 - 204 , 208 - 211, 258 - 259, 278 - 279 Baicu T., Sean T., 1996, Fitopatologie agricol, Ed. Ceres, Bucureti, 67 - 80, 141 Baker K.F., 1966, Dynamics of seed transmission of plant pathogens, Ann. Rev. Bra C.I., 2008 - Radiaia ultraviolet - factor mutagen fizic. Efecte ale iradierii cu UV la Beratlief C., Oprea M., 1994, Caracteristici ale ecosistemului depozitelor de produse Berjak P., 1987, Stored seeds. The problems caused by microorganisms (with 143, 174 - 175 Phytopathol., 4, 311 fasole (Phaseolus vulgaris L.), Ed. Universitii Al.I.Cuza, Iai,103 -114, 272 - 286 agricole i implicaii sanitare, Probleme de protecia plantelor, Bucureti, 22: 13, 44 particulare reference to the fungi). Seed Pathology. International Advanced Course Abrates, Brasil, 2, 22 Blteanu Gh., 1998, Fitotehnie, Cereale i leguminoase pentru boabe, Ed. Ceres, Bontea V., 1985, 1986, Ciuperci parazite i saprofite din Romnia, Ed. Academiei Bontea V., Becerescu D., 1952, Manual de fitopatologie, Ed. de Stat pentru Booth C., 1971, Fusarium - Laboratory guide to the identification of the major Cahagnier B., 1995, Les mycotoxines, Paris Cpraru G., Bra I., 2008 - Cereale, pesticide, mutaii: Efecte citogenetice i Bucureti, 1 (2): 204 - 210, 490 Romne, Bucureti, 1, 2 Literatura tiinific, Bucureti, 44 - 57 species, Common Wealth Agricultural Institute, Surrey, England, 49 - 53

fiziologice induse de tratamentul cu pesticide la orz, orzoaic i secar, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai, 34 -74, 121-128 Ceapoiu N., 1968, Metode statistice aplicate n experienele agricole i biologice, Ed. Champion R., 1997, Identifier les champignons transmis par les semences, Ed. INRA Agro-Silvic, Bucureti (LInstitut National de la Recherche Agronomique), Paris, 2 - 15, 92 - 93, 96 - 97, 99 - 101, 119 121, 122 - 125,153 - 159, 164 - 165, 234 - 236, 241 - 243, 253 - 255, 309 - 313, 357 - 359 Christensen C.M., 1973, Loss of viability in storage micoflora. Seed Science and Cmpeanu M., Maniu M., Surugiu C.I., 2002 - Genetica - metode de studiu, Ed. Technology, Ed. C.M. Christensen, 1, 350 - 380 Corson, Iai, 26 - 44

72

 126 318 - 336 75 - 85

Coman I., Popescu. O, 1985, Micotoxine i micotoxicoze, Ed. Ceres, Bucureti, 88 Coman I., Mare M., 2000, Micologie medical aplicat, Ed. Junimea, Iai, 75 - 270, Cotru, M., Popa L., Stan T., Preda N., 1991, Toxicologie, Ed. Didactic i Cristea M., 1985, Conservarea genetic a plantelor i agricultura, Ed. Academiei Delouche J.K., 1976, Standardization of vigor tests, Journal of Seed Technology, 1, 2, Derache R., 1988, Micotoxine, Med. et Nut, 6 - 24, 351 Docea E., Severin V., Baicu T., Pop I., 1976, ndrumtor pentru recunoaterea i Ellis M. B., 1971, Dematiaceous Hyphomycetes, Commonwealth Mycological Institute, Faiad M.G.R., Wetzel M. M. V., 1996, Evaluation of fungi in seed germplasm before

Pedagogic, Bucureti Romne, Bucureti, 57

combaterea bolilor plantelor cultivate, Ed. Ceres, Bucureti, 12 - 70, 146 - 150, 157 - 158 Kew Surrey, England, 1 - 608 long term storage. Genetic Resources Biotechnology National Research Center, Brasil, Seed Science Technology, 24, 350 - 360 468 Hulea A., Negru Al., Severin V., 1973, Principalele boli ale culturilor semincere, Ed. Hulea A., Rdulescu E., Bontea V., 1983, Dicionar de termeni populari, tehnici i Hulea A., Iliescu P., 1986, Determinator pentru identificarea mucegaiurilor potenial Iacob V., Ulea E., Puiu I., 1998, Fitopatologie agricol, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iacob V., Hatman M., Ulea E., Puiu I., 1999, Fitopatologie general, Ed. Cantes, Iai, Ceres, Bucureti, 35 - 70 tiinifici n fitopatologie, Ed. Ceres, Bucureti, 143 toxigene, Societatea de Medicin Veterinar din Romnia, Bucureti Iai, 80, 211 Fowler J., Cohen L., 1990, Practical statistics for field biology, Open University Press, Guest E., 1979, Principles and practices of seed storage in Agriculture Handbook, Goran, G.V., 2005, Micotoxicoze, Tratat de Medicin Veterinar, Ed. Tehnic, 4 Harrington, 1972, Seed Biology, Ed. Tehnic Kozlovski, Acad. Press New York i Hatman M., Bobe I., Lazr Al., Gheorghie C., Glodeanu C., Severin V., Tusa C., New York, 45 - 79 Washington, 22 - 28

Londra, 145 - 185 Popescu I., Vonica I., 1989, Fitopatologie, Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, 280 - 285,

73

53 - 92 46, 211 Justice O.L., Bass L.N., 1980, Principles and practices of seed storage, Agriculture Kuckarek T. A., Kommedahl T., 1966, Kernel infection and corn stalk rot caused by Malone J.P., Muskett A.E., 1941, The Ulster method for the examination of flax seed Maniu M., Trua E., Tudose C., Maniu C., 2002, Efecte citogenetice induse de Handbook, Washington Fusarium moniliforme, Phytopathology, 56 for the presence of seed borne parasites, Annals Appl. Biol., 8 - 13, 28 tratamentul singular i combinat cu Oltisan extra i UV-B la linia DH74-2 de orzoaic de primavar, n Analele Societii Nationale de Biologie Celular - C. Crciun, A. Ardelean (editori), 6: 1, 112 - 114 170 - 184 New York Rdulescu E., Negru A., 1967, ndrumtor pentru determinarea bolilor i duntorilor Rdulescu E., Rfil C., 1969, Tratat de fitopatologie agricol, Ed. Academiei Samson R. A., Pitt J. I., 1990, Modern concepts in Penicillium and Aspergillus la semine, Ed. Agro-Silvic, Bucureti, 266 - 271, 277 - 280 Romne, Bucureti, 2: 68 - 74 Raper K. N., Thom C., 1968, A Manual of the Penicillia, Hafner Publishing Company, Maniu M., Tudose C., Tudose M., 2005, In vivo mutagenesis induced by sodium azide Mititiuc M., 1993, Bolile plantelor legumicole, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai Mititiuc M., 1994, Fitopatologie, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai, 387 - 389, 409 Mititiuc M., 1995, Micologie, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai, 111 - 112, 133 - 135, 227, Molard R., Cahagnier B., 1992, Microflore des cereales, croissance microbiene et Neergaard P., 1977, Seed pathology, Ed. Macmillan Press, Londra, 1: 550 - 556 Osweiler G.D., 2000, Mycotoxins - contemporary issues of food animal health and Prvu M., 1996, Fitopatologie, Ed. Sincron, Cluj Napoca, 99 - 277 Plcint D., 2007, Micromicete ce se transmit prin seminele de cereale pioase. Raicu C., Baciu D., 1978, Patologia seminei, Ed. Ceres, Bucureti, 1 - 50, 109 - 111, in DH10-9 double haploid line of barley, Romanian Biotechnological Letters, 10 (4): 2255 - 2261 Iacob V., 2002, Bolile plantelor cultivate - prevenire i combatere, Ed. Ion Ionescu de Ionescu D., 1967, Cultura leguminoaselor pentru boabe, Ed. Agro-Silvic, Bucureti, la Brad, Iai

234 - 235, 238 hydratation, consequence du developpment des moisissures, La Rochelle, Paris, 77

productivity. Veterinary Clinic of North American Food Animal, 16, 511 - 530

Prevenire i combatere, Ed. Univ. Suceava, 13 - 19, 20 - 29, 30 - 32, 46 - 48

74

classification, Plenum Press, New York, 1 - 478 47 - 60 Sean T., Baicu T., 1995, Biological control of fungus diseases of cropped plants in Romania. Plant pathology, Abstracts of the International Symposium of the Plant Protection, Holland, 2 - 7, 13 - 20 Iai Baltimore Tudose I., 1967, Genetica. Indrumtor de laborator, Ed. Univ. "Al . I. Cuza" Iai, 40 - 48 Zanoschi V., Toma C., 1985, Morfologia i anatomia plantelor cultivate, Ed. Ceres, Webster J., 1993, Introduction to fungi (2nd edition), Cambridge University Press, Scuteanu E., Danielescu N., Popescu O., Trif Al., 1995, Toxicologie i toxicoze, Ed. Strjeru S., Murariu D., Popa M., Plcint D., 2001, Conservarea i utilizarea Tnase C., 2002, Micologie, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai Tnase, C., Mititiuc, M., 2001, Micologie, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai, 12 - 13, 92 - 98, Tnase, C., Sean T., 2006, Concepte actuale n organizarea i clasificarea fungilor, Thom C., Raper K. N., 1945, A Manual of Aspergillia, Wilkiams Wilkins Company Didactic i Pedagogic, Bucureti resurselor genetice vegetale, Suceava, 5 - 7, 39 - 41, 75, 100 - 154 Sean T., Tnase C., 2006, Mycobiota - sisteme de clasificare, Ed. Univ. Al. I. Cuza, Savu C., Georgescu N., 2004, Sigurana alimentelor, riscuri i beneficii, Ed. Semne, Svulescu O., Eliade E., Mrgriteanu S., Popa E., 1965, Lucrri practice de Sean T., 1982, Ciuperci parazite pe smna de fasole i combaterea lor, Bucureti, Bucureti, 146 - 152 fitopatologie, Ed. Didactic i Pedagogic, Bucureti, ediia a 4- a, 25 - 43, 70 - 77

108, 119 - 124, 171 - 173, 236 - 237, 244 Ed. Univ. Al. I. Cuza, Iai

Bucureti, 73 - 75 Cambridge 1993, Handbook on seed health testing, International Seed Testing Association, Zurich FAO/IPGRI, Genebank Standards, 1994, Food and Agriculture Organization of the United Nations/International Plant Genetic Resources Institute, Roma Surse internet: http://mcavalla.free.fr/galerie/category.php?cat=16 http://schimmel-schimmelpilze.de http://www.indexfungorum.org http://www.mycotoxins.com

75

LISTA LUCRRILOR TIINIFICE CU REFERIRE LA SUBIECTUL TEZEI DE DOCTORAT

1. Diana Batr-Rusu, Danela Murariu - Assessment of deposit mycoflora action on Vicia faba beans from Suceava Genebank collection, Ed. Univ. tefan cel Mare Suceava, 2009 (sub tipar) 2. Diana Batr-Rusu, Danela Murariu - Assessment of deposit mycoflora action on Phaseolus vulgaris beans from Suceava Genebank collection, Ed. Univ. tefan cel Mare Suceava, 2009 (sub tipar) 3. Diana Batr-Rusu, Cristian Tudose - Cytogenetic effects induced by deposit mycoflora in Vicia faba L. beans from the collection of Suceava Genebank, Analele tiinifice ale Universitii Al. I. Cuza Iai, Seciunea Genetic i Biologie Molecular, TOM X, fasc. 3, 2009, 17 - 24 4. Diana Batr-Rusu, Cristian Tudose - Cytogenetic effects induced by deposit mycoflora in Zea mays L. seeds from the collection of Suceava Genebank, Analele tiinifice ale Universitii Al. I. Cuza Iai, Seciunea Genetic i Biologie Molecular, TOM X, fasc. 4, 2009 (sub tipar) 5. Cristian Tudose, Diana Batr-Rusu - Efecte citogenetice induse de micoflora de depozit la seminele de Phaseolus vulgaris L. din colecia Bncii de Resurse Genetice Vegetale Suceava, Analele SNBC, 2 (Rezumatele lucrrilor celei de-a XXVII-a Sesiuni tiinifice Anuale a Societii Romne de Biologie Celular), Bistria, 11 - 14 iunie 2009, 5 6. Cristian Tudose, Diana Batr-Rusu, Mihaela Ionela Tudose - Efecte citogenetice induse de micoflora de depozit la seminele de Zea mays ssp.mays din colecia Bncii de Resurse Genetice Vegetale Suceava, Supliment la Analele tiinifice ale Universitii Al. I. Cuza Iai (Rezumatele lucrrilor Sesiunii tiinifice Biologia n Anul Omagial Darwin, dedicat lui Charles Darwin: 200 de ani de la natere i 150 de ani de la publicarea Originii speciilor), 6 - 7 noiembrie 2009, 33 7. Cristian Tudose, Diana Batr-Rusu - Cytogenetic effects induced by deposit mycoflora in Phaseolus vulgaris L. beans from the collection of Suceava Genebank, Annals of the Romanian Society for Cellular Biology, A. Ardelean, C. Crciun (Editors), XIV, issue 2, 2009 (sub tipar)

76