Testarea citotoxicitatii nanoparticulelor in vitro

Metode de testare

Evaluarea viabilitatii celulelor prin metoda marcajului cu colorantul Albastru Tripan

Principiul metodei:

Albastru tripan (C34H24N6Na4O14S4) este un colorant vital utilizat pentru marcarea selectiva a
celulelor si tesuturilor moarte, care se vor colora in albastru. Celulele si tesuturile vii cu
membrane intacta nu se vor colora cu Albastru Tripan, ramanand necolorate.

Scopul experimentului este de a analiza efectul unor nanoparticule asupra viabilitatii unor cellule
eucariote umane in cultura, prin metoda colorarii cu Albastru Tripan.

Probe utilizate:

In experiment s-au utilizat 5 dispersii de nanoparticule de magnetite functionalizate cu extracte

natural vegetale, si anume:

1. Fe3O4@eugenol

2. Fe3O4@carvona

3. Fe3O4@limonen

4. Fe3O4@eucaliptol

5. Fe3O4 control

6. controlul negativ (celule netratate)

Celulele utilizate: linia celulara HeLa

Etape de lucru:

Cantarirea pulberilor nanostructurate (NPs) (se cantaresc in tuburi eppi cate 20mg din fiecare tip
de NPs)

Sterilizare pulberi dupa cantarire (expunere UV, 30 min)

Obtinerea dispersiilor in apa distilata sterila (ADS) - conc 10mg/mL.

Adaugarea dispersiilor peste monostratul de celule endoteliale (conc 0,1mg/mL)

Incubare 1 ora la 37oC, 5%CO2

Citirea rezultatelor: dupa incubare se indeparteaza supernatantul, iar celulele se desprind prin
tripsinizare (tratament cu tripsina 0,25% timp de 5min). Din celulele desprinse (in suspensie) se
preia un esantion de 1mL si peste acest volum se adauga 0,1mL solutie Albastru Tripan 0.4%.
Amestecul obtinut se omogenizeaza usor si se incarca intr-o camera de numarare pentru celule.
Se analizeaza imediat la microscopul optic, numarand celulele vii (necolorate) si moarte
(colorate in albastru), folosind obiectivul 20x.

Interpretarea rezultatelor:

Se vor Numara celulele aflate in patratele din colturi, precum si cele din patratul central (precum
puteti observa in imaginea de mai jos), inregistrand o medie a acestora.
Procentul de cellule viabile se calculeaza dupa formula:

% viable cells = [1.00 – (Number of blue cells ÷ Number of total cells)] × 100

Exemplu: in imaginea de mai jos am numarat 65 celule in total. Dintre acestea 32 au fost
inregistrate ca necolorate (viabile), 31 colorate in albastru intens (non-viabile cert), si 2 celule
sunt incerte (insa se trec si acestea la non-viabile. Asadar am obtinut 32 celule viabile si 33
celule non viabile.

Aplicand formula obtin:

% cel viabile = [1-(33/65)] x 100

[1-0,507] x 100

0,493x100 = 49,3

Rezultat: procentul de celule viabile in exemplul dat = 49,3%

Fisa de lucru

(maxim o pagina, in care vei raspunde la urmatoarele):

(1) Calculati volumul de ADS necesar pentru obtinerea unei cantitati de 1mL sol NPs de conc
10mg/mL, care se gasesc sub forma de pulbere, din care s-a cantarit 20mg.

(2) Calculati numarul de celule viabile in situatiile de mai jos, obtinute pentru NPs testate:

Legenda:
1. Fe3O4@eugenol
2. Fe3O4@carvona
3. Fe3O4@limonen
4. Fe3O4@eucaliptol
5. Fe3O4 control
6. controlul negativ (celule netratate)

(3) Formulati concluzii cu privire la efectul cytotoxic al NPs analizate, dupa analiza comparativa
a viabilitatii celulelor probelor calculate si a controlului netratat.