Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Tabelul 10.1
Clasificarea principalelor antibiotice in functie de structura chimica
Element structural Denumiri substante active Denumiri produse comerciale
caracteristic
1 2 3
1. Peniciline naturale
1
a) Benzilpenicilina Penicilina G Potasica, Penicilina G Sodica
b) Fenoximetilpenicilina Penicilina V, Cliacil, Megacillin, Ospen
2. Peniciline retard
a) Benzatin benzilpenicilina Moldamin, Retarpen
b) Procain penicilina G Efitard, Fortepen
3. Peniciline de semisinteza
a) Amoxicilina Amopen, Amox, Amoxicilina, Amoxifarm, Amoxil,
Dispamox, Duomox, E-Mox, Ephamox, Farconcil, Izoltil,
Julphamox, Moxilen, Ospamox, etc.
b) Ampicilina Ampen, Ampicilina, Ampidar, Ephicilin, Epicocilin,
Pamecil, Pentrexil, Standacillin,
c) Carbenicilina Carbenicilina
d) Oxacilina Oxacilina, Oxalin, Prostaphlin
4. Cefalosporine
a) Cefaclor CEC, Ceclodyne, Ceclor, Cefaclor, Cloracef, Medoclor,
A. Nucleu β-lactamic Sinclor, Vercef, etc.
b) Cefadroxil Biodroxil, Cedrox, Cefadroxil, Cexyl, Droxyl, Duracef,
Odoxil
c) Cefalexin Cefalexin, Cefalin, Farmalexin, Keflex, Keforal, Oracef,
Ospexin
d) Cefalotina Cefalotina
e) Cefamandol Cefamandol, Mandol
f) Cefapirin Cefatrexyl
g) Cefatrizin Gertemycin, Specicef-N
3. Alte antibiotice β-lactamice Meronem, Tienam
a) Carbapeneme Nocardicina
b) Nocardicine Aztreonam, Azactam
c) Monobactame
1. Amikacina Amikin, Amikozit, Orlobin
2. Gentamicina Gentamicin, Genticol, Lyramicin, Ophtagram
3. Kanamicina Kanamicina, Kanamicina sulfat
B. Aminoglicozide 4. Neomicina Sulfat de neomicina
5. Paromomicina Paromomicina, Aminodisidina, Catenulina, Monomicina,
Zigomicina
6. Spectinomicina Spectinomicina, Kirin
7. Streptomicina Streptomicina sulfat
8. Tobramicina Brulamycin, Ikobel, Nebcin, Tobrex
C. Polipeptide ciclice 1. Colistina (Polimixina E) Colistin, Colimycine
2. Polimixina B Sulfat de polimixina B
D. Lactone macrociclice 1. Macrolide Eritro, Eritromagis, Eritromicina, Eriyfluid, Eryhexal,
Erytro-Teva, Ilosone, Lactobionat de eritromicina.
2. Poliene ciclice Nistatina, Nystatin
H. Chinone 1. Tetracicline de biosinteza
a) Oxitetraciclina Oxitetraciclina
b) Tetraciclina Tetraciclina,
2. Tetracicline de semisinteza
a) Doxiciclina Doxiciclina, Doxydar, Remicyn, Unidox Solutab,
b) Rolitetraciclina Vibramycin
Solvocilin, Rolitetraciclin
3. Rifampicine Eremfat, R-Cin, Rifampicina, Sinerdol
I. Nucleu aromatic 1. Cloramfenicol Cloramfenicol, Sificetina
2. Griseofulvina Griseofulvin,
Tabelul 10.2
2
Principalele microorganisme utilizate pentru producerea antibioticelor la nivel
industrial
Tip de microorganism Tulpina producatoare Denumire antibiotic
1 2 3
1. Fungi Penicillium crysogenum Peniciline
Penicillium griseofulvum Griseofulvina
Cefalosporium acremonium Cefalosporina C
3
Elementele constructive si modalitatile de exploatare a fermentatoarelor, etapele
tehnologice preliminare fazei de fermentatie (pregatirea si sterilizarea mediilor de cultura si a
instalatiei), precum si procedeele de monitorizare si reglare a parametrilor bioprocesului sunt
comune tuturor proceselor industriale de biosinteza microbiana care folosesc acelasi tip de
bioreactoare.
In zona de prelucrare post-biosinteza se afla utilajele necesare pentru separarea si
purificarea produsului principal de biosinteza: filtre, centrifugi, concentratoare, extractoare,
coloane cromatografice, vase de cristalizare, pompe de vid, etc.
Eficienta tehnologiilor de obtinere a antibioticelor este in mare masura determinata de
utilizarea unor procedee adecvate de izolare a acestora din mediile de fermentatie, medii in
care exista alti numerosi produsi de biosinteza (intre care unii cu structura foarte asematoare)
sau de degradare a masei celulare. Prelucrarea post-biosinteza a mediilor de fermentatie
(figura 10.3) cuprinde o serie de etape de purificare in trepte si de izolare finala a
antibioticului in stare solida, etape care se realizeaza pe baza unor procedee care difera de la
un antibiotic la altul si/sau de la o tehnologie la alta [Weinstein M.J., 1978]
Antibioticele β-lactamice formeaza una din cele mai importante familii de antibiotice,
atat din punct de vedere al importantei terapeutice, cat si din punct de vedere al pietei
4
produselor farmaceutice, reprezentand, la nivel mondial, mai mult de 60% din valoarea totala
a antibioticelor comercializate. Cele mai cunoscute si utilizate antibiotice din aceasta familie
sunt penicilinele si cefalosporinele.
Denumirea de antibiotice β-lactamice se datoreaza elementului structural comun
reprezentat de un heterociclu β-lactamic, format din 4 atomi.
2.
clavam inhibitori de ß-lactamaze
3.
carbapenem imipenem si derivati
4.
cefem cefalosporine
5.
cefalosporine de generatia
oxacefem
a III-a
6.
monobactame
monobactam
(Aztreonam)
Tabelul 10.5.
Antibiotice β-lactamice
Microorganism Antibiotic natural Intermediar cheie Antibiotic
producator semisintetic
5
1 2 3 4
Peniciline G si V Acid 6-
Penicillium aminopenicilanic Peniciline
chrysogenum (6-AP)
R = C6H5CH2CO- (Pen. G)
C6H5OCH2CO- (Pen.V)
Acid 7- Cefalosporine
aminodesacetoxicefalo- cu administrare
sporanic (7-ADC) orala
-
Nocardicine
-
10.2.1. Peniciline
6
Pornind de la aceasta structura, se poate constata ca penicilinele sunt derivati acilati ai
acidului 6-aminopenicilanic.
Penicilinele de biosinteza sunt substante chimice produse de diferite specii de
microorganisme din genul Penicillium si Aspergillus printre care: P. chrysogenum, P.
notatum, A. niger, etc.
Microorganismele sus-mentionate au proprietatea de a produce in mod natural mai
multe tipuri de peniciline, care difera intre ele prin natura radicalului acil (tabelul 10.6).
Procesul de biosinteza a acestor antibiotice poate fi dirijat catre obtinerea unei anumite
peniciline prin adaugarea unui precursor al catenei laterale in mediul de cultura. Din peste 100
de peniciline de biosinteza izolate si caracterizate pana in prezent, doar penicilinele G, V se
produc la nivel industrial, fiind utilizate pe scara larga in practica terapeutica. Penicilina V are
acelasi spectru farmacologic ca si penicilina G, dar este mai activa in infectiile stafilococice.
O alta diferenta intre cele doua peniciline naturale consta in faptul ca in mediu bazic, la pH-
uri cuprinse in intervalul 9-10, viteza de inactivare a penicilinei V este de 2,2 ori mai mare
decat viteza de inactivare a penicilinei G.
Tabelul 10.6.
Structura unor peniciline naturale
Denumirea R (catena laterala)
penicilinei Structura Denumire
Penicilina F CH3 – CH2 – CH = CH – CH2 – 2-pentenil
Penicilina dihidro F CH3 – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – 2-pentil
Penicilina G C6H5 – CH2 – benzil
Penicilina K CH3 – (CH2)5 – CH2 – n-heptil
+
Penicilina N NH3 – CH – (CH2)3 – D(-)4-amino-4-carboxibutil
│
COO-
Penicilina O CH2 = CH – CH2 – S – CH2 – alilmercaptometil
7
Astfel, s-a pus problema obtinerii unor peniciline cu proprietati superioare celor de biosinteza,
prin introducerea unor noi catene laterale in structura acidul 6-AP.
Tabelul 10.7.
Peniciline de semisinteza
Denumire Radical acilaminic Denumire Radical acilaminic
generica generica
Meticilina Indanilcarbenicilina
Ampicilina Epicilina
Amoxicilina Piperacilina
Cloxacilina
Carbenicilina
Dicloxacilina
Luind in considerare mai multe criterii si anume: natura catenei laterale a structurii de
baza, sensibilitatea fata de ß-lactamaze (penicilinaze), sensibilitatea fata de mediul acid si
spectrul activitatii antibacteriene, se disting mai multe tipuri de peniciline:
a) peniciline G si V (sensibile la penicilinaze) :
- penicilina G, acido-sensibila:
- penicilina V, acido-rezistenta si clometacilina.
b) peniciline rezistente la penicilinaze :
- meticilina, acido-sensibila;
- izooxazolilpeniciline, acido-rezistente (oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina,
flucloxacilina).
c) aminopeniciline A acido-rezistente cu spectru larg de activitate:
- ampicilina, amoxicilina;
- ciclacilina.
8
d) peniciline acidosensibile cu spectru foarte larg de activitate:
- carboxipeniciline (ticarcilina, carbenicilina, temocilina);
- acilureidopeniciline (piperacilina, azlocilina, mezlocilina).
e) amidinopeniciline :
- pivmecilinam.
a) Proprietati fizico-chimice
Penicilinele sunt substante albe, cristaline. In general, nu au puncte de topire nete,
descompunandu-se in timpul incalzirii.
Gruparea carboxil prezenta in structura penicilinelor confera acestora caracter de acizi,
a caror tarie variaza in functie de substituentii existenti pe nucleul penam, constantele de
disociere depinzand de solventul in care se efectueza determinarea.
In forma acida, sunt solubile in solventi organici, proprietate pe care se bazeaza
izolarea si purificarea penicilinelor prin extractie lichid-lichid; prezenta unei alte grupari
polare in molecula, in special a unei grupe amina, reduce sau anuleaza solubilitatea in solventi
organici nepolari.
Sarurile de sodiu si potasiu ale penicilinelor sunt usor solubile in apa, unele dintre ele
fiind solubile si in anumiti solventi polari.
Datorita celor trei atomi de carbon asimetrici (C3, C5, C6) din nucleul penam, la care se
pot adauga si alti atomi de carbon asimetrici din catena laterala, penicilinele sunt substante
optic active.
Intrucat nucleul penam nu prezinta absorbtie caracteristica in UV, spectrele de
absorbtie in UV a penicilinelor sunt utilizate pentru caracterizarea catenei laterale si mai ales
pentru elucidarea structurii unor compusi de degradare ai penicilinelor.
Penicilinele pot fi caracterizate prin spectrul IR deoarece prezinta un maxim de
absorbtie la frecvente cuprinse intre 1760-1800 cm -1, caracteristic nucleului β-lactamic, spre
deosebire de amidele substituite si esteri, care prezinta un maxim de absorbtie la frecventa de
1720-1780 cm-1, caracteristic grupei C=O.
Spectroscopia RMN reprezinta o metoda foarte importanta de caracterizare si
identificare a penicilinelor, intrucat semnalele care provin de la protonii atasati atomilor de
carbon din ciclul β-lactamic ofera informatii despre integritatea acestui nucleu, substituentii
existenti si pozitia lor sterica.
Din punct de vedere chimic, penicilinele se caracterizeaza prin faptul ca sunt forte
sensibile la atacul agentilor oxidanti, precum si al reactantilor nucleofili (ioni hidroxil,
alchilamine, hidroxilamina, alcooli etc.) si electrofili (compusi donori de protoni), ceea ce
explica instabilitatea lor in mediu alcalin sau acid.
b) Proprietati biologice
Penicilinele isi exercita actiunea asupra bacteriilor prin inhibarea sintezei
peptidoglicanilor specifici structurii peretelui celular bacterian. Este cunoscut faptul ca
peretele celular bacterian, care are rolul de a mentine integritatea celulei, aparand-o de
efectele presiunii osmotice din apa sau fluidele organismelor gazda, are o structura spatiala
rigida. Aceasta se datoreaza macromoleculelor complexe formate din fibre de glican (unitati
de N-acetil-glucozamina si acid N-acetil muramic), leagate intre ele prin punti peptidice.
Aceste punti se formeaza in urma unei reactii de transpeptidare, catalizata de enzime care sunt
inactivate ireversibil de antibioticele β-lactamice. Datorita faptului ca aceasta reactie este
caracteristica numai bacteriilor, antibioticele β-lactamice au o specificitate ridicata si o
toxicitate relativ scazuta.
9
10.2.1.2. Tehnologia de obtinere a penicilinelor de biosinteza
10
Pentru penicilina G se utilizeaza ca precursor acidul fenilacetic, iar pentru penicilina
V, acidul fenoxiacetic.
La nivel industrial, instalatiile destinate obtinerii penicilinelor sunt prevazute cu vase
speciale pentru pregatirea mediilor de cultura, utilate cu agitatoare, conducte pentru abur viu,
serpentine de incalzire-racire. In aceste vase se introduce mai intai apa, care se incalzeste la
60-700C si apoi se adauga extractul de porumb, amestecul rezultat mentinandu-se la fierbere
timp de aproximativ 1 ora. Restul componentilor de mediu se adauga dupa racirea solutiei de
extract de porumb la 50-600C, in urmatoarea ordine: CaCO3, saruri minerale, lactoza, glucoza.
Avand in vedere faptul ca sterilizarea mediului de cultura se face cu abur direct ce
condenseaza in timpul sterilizarii furnizand o cantitate suplimentara de apa, aceasta trebuie
luata in calcul pentru respectarea concentratiilor din reteta de mediu.
Mediile astfel preparate se pot steriliza direct in fermentator sau, in cazul volumelor
mari, in instalatia de sterilizare continua, la 124-1260C timp de 10-12 minute sau la 140-1450C
timp de cateva secunde, timpul de racire variind in functie de temperatura si tipul de
sterilizare. Dupa racire la 300C, mediile astfel sterilizate pot fi inoculate.
b) Fermentatia
Penicilinele, ca de altfel majoritatea antibioticelor, sunt produse ale metabolismului
secundar. In timpul fazei de crestere a biomasei se produce o cantitate foarte redusa de
penicilina, dar odata cu consumarea sursei de carbon incepe faza de biosinteza a
antibioticului. Prin suplimentarea cu nutrienti a mediului de cultura faza de productie poate fi
prelungita in timp.
La nivel industrial, penicilinele naturale se obtin printr-un proces aerob de fermentatie
submersa, cu ajutorul unor tulpini mutante de Penicillium chrysogenum, caracterizate printr-o
capacitate bioproductiva ridicata, obtinute prin modificari genetice.
Fermentatia se realizeaza in trei trepte –inoculator, intermediar si regim – care se
diferentiaza, din punct de vedere biologic, prin stadiul de dezvoltare al microorganismului si
din punct de vedere tehnologic prin volumul mediului de fermentatie, cu toate consecintele
care decurg din acestea (parametrii de bioproces diferiti de la o treapta la alta). In inoculator
se realizeaza aclimatizarea microorganismului la noile conditii de dezvoltare, in intermediar
are loc acumularea de masa celulara, iar in regim se desavarseste procesul de crestere a masei
celulare si de biosinteza a penicilinei.
In realitate, procesul evolueaza fara a exista o distinctie foarte neta intre treapta a doua
(intermediar) si a treia (regim), deoarece distributia neuniforma a varstei microorganismului
face ca elaborarea de penicilina sa poate incepe din intermediar.
Pe langa potentialul bioproductiv al microorganismului si echilibrarea judicioasa a
compozitiei mediului de cultura, eficacitatea procesului de biosinteza este determinata de
mentinerea sterilitatii in timpul procesului, de asigurarea necesarului de oxigen si de
mentinerea temperaturii si a pH-ului la valori optime, corespunzatoare fazei metabolice in
care se afla microorganismul.
Asigurarea sterilitatii se realizeaza prin aplicarea unei suprapresiuni de 1,2-1,3 ata,
creata prin barbotare de aer steril.
Cerintele de oxigen sunt maxime in faza de crestere, care se caracterizeaza prin
utilizarea intensiva a componentelor mediului de cultura pentru acumularea de masa
miceliana si prin activitate respiratorie intensa, concretizata prin degajare de CO2.
In faza de producere a penicilinei, caracterizata prin incetinirea cresterii miceliului ca
urmare a epuizarii constituentilor usor asimilabili din mediu, necesarul de oxigen scade.
In ceea ce priveste pH-ul, valorile optime ale acestuia difera in faza de crestere a
masei celulare (4,5-5) fata de cea de producere a antibioticului (7,0-7,5). Cresterea pH-ului
peste valoarea 7,5 catre 8 se datoreaza eliberarii de amoniac in mediu si constituie un semnal
11
al inceperii procesului de autoliza si un factor de degradare a penicilinelor, instabile in mediu
alcalin.
Valorile optime de temperatura variaza de asemenea, de la 300C in faza de crestere a
masei celulare, la 240C in faza de biosinteza a penicilinei. Intrucat cele doua faze sunt greu de
separat practic, procesul de fermentatie este condus la temperatura de 26±1 0C, care reprezinta
o valoare de compromis.
Fermentatia dureaza 120-125 h si se considera terminata atunci cand continutul de
zahar scade la 0,2-0,6 %, concentratia de penicilina putand atinge un maxim de 3%.
Evolutia unui proces eficient de fermentatie a penicilinelor este prezentata in figura
10.
Tabelul 10.7
Parametrii procesului de fermentatie a penicilinei
Etapa de Temperatura Agitare Debit aer Presiune Durata proces
0
fermentati ( C) (rpm) (l/l mediu/min) (ata) (h)
e
Inoculator 26±10C 270 1,0 1,2-1,3 30-40
Intermediar 26±10C 170 1,0-1,2 1,2-1,3 20-40
Regim 26±10C 120 0,6-1,0 1,2-1,3 90-120
12
penicilinelor), precum si alte produse biologice (proteine, acizi nucleici, polizaharide,
vitamine etc.) si saruri minerale.
Pentru izolarea penicilinelor din mediul nativ complex se foloseste metoda extractei
lichid-lichid, care se bazeaza pe diferentele de solubilitate, caracteristici ionice si stabilitate
chimica, existente in anumite conditii intre substantele prezente in mediu, in finalul
biosintezei.
Deoarece penicilinele sunt produse extracelulare, prima treapta de prelucrare a
mediului de fermentatie, in scopul izolarii acestora, consta in separarea miceliului. Aceasta
operatie se realizeaza prin filtrare cu ajutorul unor utilaje adecvate (de obicei filtre tambur sau
filtre rotative).
Din filtratul rezultat, penicilina se separa prin extractie cu solventi organici. Eficienta
acestui procedeu depinde de natura solventului (respectiv de selectivitatea acestuia fata de
penicilina existenta in amestec cu alti produsi), precum si de asigurarea urmatoarelor conditii:
- mediu puternic acid in care penicilina se afla exclusiv in forma sa acida, forma in care este
solubila in solventi organici;
- eliminarea posibilitatii de asociere intermoleculara a penicilinei in forma acida;
- eliminarea posibilitatii de disociere a moleculei de penicilina.
Dintre solventii organici utilizabili pentru extractia penicilinelor (esteri, cetone,
cicloalcani substituiti), cel mai des se intrebuinteaza acetatul de butil, care corespunde
conditiilor de mai sus si in plus este si accesibil din punct de vedere economic.
Un exemplu de astfel de procedeu, aplicat la nivel industrial in cazul penicilinei G,
este cel in care se succed mai multe trepte de extractie, dupa cum urmeaza:
- in prima treapta are loc trecerea antibioticului din solutia apoasa (mediu de fermentatie
filtrat si acidulat cu acid sulfuric 4-5 % la pH 2-2,5) in solutia de acetat de butil, folosind un
raport volumetric intre solutia apoasa si acetat de butil de 3:1; datorita instabilitatii
penicilinelor in mediu acid, este necesar ca extractia sa se efectueze cat mai rapid, motiv
pentru care se folosesc extractoare centrifugale in contracurent, care realizeaza amestecarea si
separarea intr-o singura faza.
- in treapta a doua de extractie penicilina este trecuta din faza organica (acetat de butil) intr-o
solutie apoasa de fosfat monosodic (4 %) la pH 7-7,2 folosind un raport volumetric intre
acetatul de butil si solutia apoasa de 3:1.
- in treapta a treia penicilina se extrage din nou in acetat de butil, in conditiile aplicate in
treapta intai, obtinandu-se in final o solutie de penicilina in acetat de butil cu concentratie de
80-90.000 UI/ml.
In continuare, solutia finala de penicilina in acetat de butil se anhidrizeaza astfel: se
raceste la -10...-120C, temperatura la care ingheata apa dizolvata in acetatul de butil, iar
cristalele se filtreaza pe filtru de presiune. Solutia deshidratata de penicilina in acetat de butil,
rezultata dupa filtrare, se trateaza cu o solutie alcoolica de acetat de sodiu sau potasiu, cand
penicilina precipita sub forma de sare. Aceasta se filtreaza si apoi se spala prin amestecare cu
butanol, sub agitare. Dupa spalare, penicilina sare se filtreaza si se spala pe filtru cu
cloroform, pentru indepartarea butanolului. Penicilina G se usuca la 50-600C, in strat fluidizat.
Penicilina V se obtine printr-o tehnologie asemanatoare penicilinei G, cu deosebirea
ca extractia se realizeaza in doua trepte. Acest lucru este posibil deoarece penicilina V
prezinta in forma acida o solubilitate foarte scazuta in apa, astfel incat dupa treapta a doua de
extractie in apa, aceasta precipita prin acidulare cu acid sulfuric diluat. Penicilina V astfel
separata se filtreaza, se purifica din solventi si se usuca la 35-400C, sub vid.
Un alt procedeu de izolare a penicilinelor se bazeaza pe acelasi principiu al extractiei
lichid-lichid, care se realizeaza insa intr-o singura treapta, urmata de separarea si purificarea
penicilinei sub forma de sare.
13
Conform acestui procedeu, penicilina este extrasa in acetat de butil din solutia nativa,
dupa indepartarea miceliului, iar extractul organic se trateaza cu acetat de potasiu sau
carbonat de potasiu, cand precipita penicilina sare. Produsul obtinut se filtreaza si se spala cu
butanol si cloroform. Solventii se recircula, iar penicilina sare se dizolva in apa, se purifica cu
carbune activ, dupa care se izoleaza prin distilarea apei sub forma de azeotrop cu butanol, la
vid (4-6 mmHg). Astfel se obtine un produs solid cu activitate si puritate corespunzatoare
utilizarii farmaceutice.
Scaderea consumului specific de butanol, impusa din considerente economice, se
poate realiza prin recuperarea acestuia din amestecurile cu acetat de butil si/sau apa, prin
distilare fractionata pe coloane special destinate acestui scop.
Penicilinele retard sunt saruri insolubile in apa ale penicilinei G cu remanenta mare in
organism, care asigura, printr-o singura doza administrata, o concentratie terapeutica utila
pentru 7-14 zile.
Fiind insolubile in apa, penicilinele retard se administreaza injectabil, sub forma de
suspensii. Acest fapt impune ca procesul de cristalizare sa fie dirijat spre obtinerea unor
cristale foarte fine, cu o distributie uniforma a dimensiunilor intre 40-60 μ. Din punct de
vedere tehnologic, astfel de microcristale se pot obtine prin agitare energica cu jet de aer sub
presiune sau prin recristalizare din anumiti solventi, la anumite temperaturi.
Cele mai importante peniciline retard sunt: procainpenicilina G, benzatinpenicilina G
si clemizolpenicilina.
Procainpenicilina G (Efitard, Fortepen) se obtine din solutie apoasa, sub forma de
cristalohidrat cu o molecula de apa, prin tratarea penicilinei G, sub forma de sare de potasiu,
etil-piperidina, ciclohexilamina sau trietilamina, cu clorhidrat de procaina.
14
Clemizolpenicilina G este sarea penicilinei G cu clemizolul (1-p-clorbenzil-2-
pirolidino-metil-benzimidazol), avand structura:
In prezent se utilizeaza in mod curent doua tipuri de procedee pentru obtinerea acestui
aminoacid, ambele bazate pe hidroliza penicilinelor G sau V.
dimetildiclorsilan
PCl5
butanol
hidroliza
Acid 6-AP
Schema 10.2
16
Obtinerea acidului 6-AP prin metoda enzimatica
Penicilina G
Procedeul enzimatic este preferat celui chimic, datorita avantajelor care decurg din
reducerea consumurilor de reactivi chimici, solventi, energie si datorita puritatii avansate a
produsului de reactie.
Primele procedee industriale de hidroliza enzimatica a penicilinelor utilizau drept
biocatalizator biomasa de E. coli sau Nocardia, cu activitate peniclinacilazica.
Pentru biosinteza penicilinaciliacilazei cu ajutorul unor tulpini de E. coli cu capacitate
bioproductiva ridicata, obtinute prin mutageneza cu radiatii ionizante, se poate utiliza un
mediu de cultura foarte economic, continand extract de porumb, sulfat de amoniu si acid
fenilacetic ca inductor. Cultura se dezvolta in profunzime, sub agitare la 28-300C, in timpul
unei variatii de pH in domeniul 7-8,2, intr-un interval de 20 de ore. Biosinteza enzimei atinge
nivelul maxim in faza logaritmica tarzie de crestere a masei celulare. Pentru obtinerea unei
cantitati suficient de mari de biomasa activa, utilizabila ca biocatalizator, acest proces de
fermentatie se realizeaza in trepte: inoculator, intermediar, regim [Oniscu C., 1978].
Tabelul 10.8
Parametrii caracteristici procesului de biosinteza a penicilinacilazei cu tulpini de E. coli
inalt productive [Oniscu C., 1978].
Faza de Temperatura pH Presiune Aerare Agitare Activitate Timp
fermentatie (0C) (ata) (l/l/min.) (rpm) enzimatica (h)
(u/ml)
Inoculator 30 8 1,8 1 210 3,05 18-20
Intermediar 30 8 1,5 1 140 3,1 18-20
Regim 30 8 1,5 1-1,2 110 4,1 20
17
In vederea imobilizarii, penicilinacilaza (enzima intracelulara) se extrage din biomasa
nativa si se purifica in trepte, prin diverse procedee, astfel incat in final se obtine un preparat
enzimatic cu activitate specifica ridicata. Puritatea avansata a enzimei inainte de imobilizare
este o conditie obligatorie pentru obtinerea unui biocatalizator stabil si cu productivitate
adecvata unui procedeu enzimatic industrial eficient din punct de vedere economic.
Procedeele de hidroliza cu enzima imobilizata permit obtinerea unor conversii de 97-
98%, la pH 7,8-8,2, iar randamentul global in acid 6-AP de puritate 95-96% este de 80-82%.
Eficienta economica a procedeului de obtinere a acidului 6-AP prin hidroliza cu
penicilinacilaza imobilizata depinde in ultima instanta de costurile implicate de purificarea si
imobilizarea enzimei, de stabilitatea operationala a biocatalizatorului imobilizat, de
randamentul de scindare si de gradul de puritate al produsului final.
a) Metoda clorurii de acil. Cea mai des utilizata metoda de obtinere a penicilinelor de
semisinteza se bazeaza pe reactia de acilare a acidului 6-AP cu clorurile unor acizi organici,
continand radicalul care intereseaza.
b) Metoda anhidridelor mixte. Anhidridele mixte sunt anhidride care rezulta prin
tratarea acizilor carboxilici cu cu clorocarbonati (cloroformiati) de alchil (etil sau izobutil), in
prezenta aminelor tertiare. Ele se utilizeaza pentru obtinerea penicilinelor de semisinteza cu o
catena laterala provenind de la un acid organic a carui clorura de acil este greu de obtinut.
18
c) Metoda diciclohexil-carbodiimidei (DCC)
Acizii organici pot fi activati in vederea cuplarii cu acidul 6-AP prin intermediul unor
derivati de carbodiimide, cunoscuti din sinteza peptidica sub denumirea de “reactivi de
cuplare”. Cel mai des utilizat reactiv de acest gen este diciclohexilcarbodiimida
Activarea cu diciclohexilcarbodiimida (DCC) a acidului carboxilic continand catena
de interes se realizeaza prin formarea unui compus de aditie:
N – C6H11 NH – C6H11
║ │
R – COOH + C → R – COO – C
║ ║
N – C6H11 N – C6H11
NH – C6H11 NH – C6H11
│ │
R – CO – O – C + H2N – P R – CO – NH – P + C = O
║ │
N – C6H11 NH – C6H11
19
rolul de a salefia grupa carboxil a acidului 6-AP si bicarbonat de sodiu pentru neutralizarea
acidului clorhidric degajat din reactie.
Reactia de condensare se realizeaza de obicei in doua trepte: mai intai masa de reactie
se raceste si se mentine sub agitare la temperatura de -150C, timp de 90 minute, apoi se
incalzeste usor, pentru perfectarea reactiei, la 0-200C timp de 30-60 minute. In final,
amestecul se raceste din nou la 0-50C si se aciduleaza la pH 2-2,5 pentru eliberarea penicilinei
in forma acida, care se extrage in acetat de butil. Faza organica, ce contine penicilina, se
reintroduce in reactorul de condensare unde se spala cu apa si separa din nou. Extractul
organic astfel obtinut se deshidrateaza pe sulfat de sodiu anhidru si se trateaza cu acetat de
sodiu sau potasiu pentru precipitarea penicilinei sub forma de sare; aceasta se filtreaza si se
usuca in general la temperatura de 50-600C, sub vid usor.
Tabelul 10.9
Caracteristicile unor peniciline de semisinteza comparativ cu penicilinele naturale
Stabilitate Actiune
Antibiotic fata de in mediu antibacteriana
penicilinaza acid
- - - bactericida, cu spectru limitat la germenii G +, in
special coci (stafilococi neproducatori de penicilinaza);
Penicilina G - inactiva fata de bacilul Koch, Salmonella, Shigella,
Proteus
- - - in general asemanatoare penicilinei G;
Penicilina V - mai activa decat penicilina G pe cativa stafilococi;
- mai putin activa decat penicilina G fata de streptococi
- bactericida, cu spectru larg:
- germeni G+: stafilococi, streptococi, pneumococi,
Amoxicilina - + enterococi sensibili la penicilina;
- germeni G-: E. coli, Pr. mirabilis, Salmonella,
Shigella, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis
- bactericida, superioara penicilinei G prin spectrul
larg de actiune, dar inferioara acesteia ca intensitate a
- + actiunii fata de stafilococi si streptococi;
Ampicilina - germeni G-: E. coli, Pr. mirabilis, Salmonella,
Shigella, Haemophilus influenzae, Klebsiella
- spectru larg, incluzand unele specii de Serratia,
+ - Providencia, tulpini de Klebsiella si E. coli rezistente
(cu exceptia celei la ampicilina si multe tulpini de Pseudomonas
Carbenicilina produse de aeruginosa si Proteus indol pozitiv;
stafilococi) - inactiva fata de Streptococcus faecalis
- spectru antibacterian limitat la germenii G+;
- activa fata de stafilococii rezistenti la penicilina G
Oxacilina + + (penicilinazo-secretori);
- inactiva fata de Streptococcus faecalis
Ampicilina (acid 6-D(-)-α-amino-fenilacetamido-penicilanic sau D-α-
aminobenzilpenicilina)
20
Ampicilina este un antibiotic de semisinteza cu spectru larg de actiune, care, ca
substanta activa are aspectul unei pulberi microcristaline, de culoare alba, cu gust amar, fara
miros sau cu miros slab, cu p.t.=199-2020C. Cristalizeaza sub doua forme: anhidra si trihidrat.
In forma acida, ampicilina este greu solubila in apa si insolubila in alcool, cloroform, acetona,
eter.
Sarea de sodiu a ampicilinei se obtine sub forma unei pulberi cristaline, higroscopice,
fara miros sau cu miros slab, caracteristic,cu gust amar, foarte usor solubila in apa, solubila in
acetona, greu solubila in cloroform si insolubila in eter.
Cele doua forme cristaline ale ampicilinei acide se deosebesc in principal prin
solubilitate (forma anhidra este mai solubila in apa decat forma trihidrat). Datorita diferentei
de solubilitate, cele doua forme se absorb cu viteze diferite si in ultima instanta, ating valori
diferite ale concentratiei serice maxime (tabelul 10.10) [Oniscu C., 1978].
Tabelul 10.10
Absorbtia formelor polimorfe ale ampicilinei
Forma Concentratie maxima in ser
polimorfa (μmoli/ml) (minute)
Anhidra 2,2 60
Trihidrat 1,7 120
Schema 10.3
Obtinerea ampicilinei
21
Din punct de vedere farmacocinetic, amoxicilina este superioara ampicilinei, in sensul
ca are o absorbtie mai buna datorata prezentei grupei OH, ceea ce permite atingerea unor
concentratii sanguine ridicate in timp scurt, de unde si eficacitatea terapeutica rapida.
Carbenicilina (α-carboxibenzilpenicilina)
Carbenicilina este un antibiotic cu spectru larg de actiune, activ atat asupra germenilor
gram-pozitivi cat si celor gram-negativi, dar se degradeaza usor in mediu acid: timpul de
injumatatire a activitatii la pH 2 este de 140 de minute, la 25 0C si de 30 de minute, la 370C. Ca
urmare, acest antibiotic nu se administraza decat pe cale injectabila.
In forma acida are aspectul unei pulberi de culoare alba, gust amar si este insolubila in
apa si solubila in solventi organici. Se utilizeaza sub forma de sare disodica; aceasta este
foarte higroscopica, solubila in apa, alcool metilic si alcool etilic, insolubila in cloroform si
eter.
Carbenicilina se poate obtine prin acilarea acidului 6-AP cu doua tipuri de derivati ai
acidului fenilmalonic: clorura acida a unui monoester usor clivabil sau clorcetena acidului
fenilmalonic (ultima varianta este prezentata in schema 10.4).
Schema 10.4
Obtinerea carbenicilinei
10.2.2. Cefalosporine
10.2.2. Cefalosporine
22
Cefalosporinele sunt antibiotice β-lactamice caracterizate printr-o structura biciclica
comuna, denumita nucleu cefem, alcatuita dintr-un heterociclu β-lactamic condensat cu un
heterociclu dihidrotiazinic.
24
c) Proprietati biologice. Eficienta si viteza de actiune a antibioticelor β-lactamice sunt
dependente de absorbtia si transportul acestora in peretele celular, de legarea de receptorii
specifici si de inhibarea efectiva a actiunii enzimelor tinta. Aceste procese sunt influentate de
structura moleculara a antibioticului si determina spectrul si intensitatea actiunii
antibacteriene. In cazul cefalosporinelor, conditiile structurale fundamentale pentru activitatea
antibacteriana sunt:
- integritatea celor doua inele condensate in nucleul cefem, scindarea acestora in orice punct
ducand la pierderea completa a activitatii antibacteriene, indiferent de substituenti.
- reactivitatea legaturii β-lactamice este corelata cu capacitatea sa de a inactiva enzimele
implicate in sinteza peretelui celular; ca atare, modificarile ce maresc taria legaturii β-
lactamice, reduc in general activitatea antibacteriana.
- mentinerea unei anumite configuratii sterice: cele doua inele condensate in nucleul cefem
nu sunt coplanare, iar atomii si gruparile atasate lor pot ocupa pozitii diferite. Activitatea
antibacteriana este corelata cu urmatoarea configuratie: grupa 7-acilamina are orientarea „S”,
iar cei doi atomi de hidrogeni legati de C6 si C7 au orientarea „R” si pozitia reciproca „cis”.
- prezenta in nucleul dihidrotiazinic a dublei legaturi in pozitia C3-C4.
- prezenta in structura moleculei a grupei 4-carboxil.
In functie de proprietatile lor biologice, exprimate prin intensitatea si spectrul de
actiune antibacteriana si rezistenta la β-lactamaze, cefalosporinele se incadreaza pana in
prezent in patru generatii (tabelul 10.11.).
Tabel 10.11
Clasificarea cefalosporinelor in functie de proprietatile biologice
Generatia Proprietati biologice Exemple
reprezentative
I - active fata de bacterii Gram-pozitive si unele Gram- Cefalexin,
negative Cefalotin,
- instabile la actiunea β-lactamazelor Cefapirin,
Cefadroxil,
Cefazolin
II - spectru antibacterian mai larg, incluzand mai multe Cefaclor,
specii de germeni Gram-negativi, dar excluzand Cefamandol,
Pseudomonas sp. si Serratia sp. Cefatrizin,
- relativ stabile la actiunea unor β-lactamaze Cefuroxim,
III - active pe un spectru antibacterian foarte larg, (aproape Cefoperazon,
toate speciile de enterobacteriacee) - Ceftriaxon,
- moderat active fata de Pseudomonas si unele bacterii Cefotaxim
Gram-pozitive
- rezistente la actiunea β-lactamazelor produse de bacterii
Gram-negative
IV - spectru antibacterian foarte larg, incluzand Cefepima
enterobacteriacee, bacterii Gram-pozitive, Pseudomonas Cefpiroma
si tulpini rezistente la cefalosporinele de generatia a III-a
- active fata de germenii producatori de β-lactamaze
inductibile
10.2.2.2. Obtinerea cefalosporinei C
25
Desi aceasta substanta are o activitate bactericida foarte scazuta, ea se obtine la nivel
industrial pentru a fi folosita ca materie prima in tehnologia cefalosporinelor de semisinteza.
Biosinteza cefalosporinei C se realizeaza cu ajutorul unor tulpini de Cephalosporium
acremonium cu potential bioproductiv ridicat, obtinute de regula prin modificari genetice .
Compozitia mediilor de cultura si conditiile de fermentatie sunt asemanatoare celor
utilizate in tehnologia de obtinere a penicilinelor naturale.
Datorita naturii sale hidrofile si prezentei in mediul de cultura a altor substante cu
structura apropiata, avand aceeasi catena laterala de acid α-aminoadipic, izolarea
cefalosporinei C este foarte dificila.
Prima etapa de prelucrare post-biosinteza se deosebeste de tehnologia penicilinelor
prin faptul ca filtrarea lichidului de fermentatie se realizeaza dupa acidularea acestuia la pH =
2,5-3, in scopul degradarii si precipitarii unora din substantele cu structura asemanatoare si al
coagularii proteinelor de balast.
Din filtratul rezultat dupa separarea miceliului, cefalosporina C se poate izola prin
doua procedee, respectiv un procedeu de extractie lichid-lichid si un procedeu cromatografic
pe coloane.
a) Extractia lichid-lichid. Aplicarea acestui procedeu impune modificarea catenei
laterale D-α-aminoadipil, in sensul eliminarii caracterului hidrofil al acesteia, in vederea
obtinerii unui derivat extractibil in solventi organici nemiscibili cu apa.
Pentru modificarea catenei laterale se foloseste metoda acilarii grupei α-amino cu
cloruri acide (clorura de benzoil sau cloracetil) sau cloroformiati (cloroformiat de izobutil). In
ambele cazuri este necesara prezenta in mediul de reactie a unui acceptor de acid clorhidric,
care asigura mentinerea pH-ului in domeniul neutru sau slab alcalin
In functie de concentratia de cefalosporina C din mediul de fermentatie (care depinde
de productivitatea tulpinii), acilarea se poate efectua direct in lichidul de fermentatie filtrat
(cand exista o cantitate suficient de mare de cefalosporina C) sau in solutii partial purificate si
concentrate. In ambele situatii agentul de acilare se utilizeaza in exces, tinand seama de
prezenta altor aminoacizi in mediu si de reactia competitiva cu apa. Intrucat reactivii de
acilare nu sunt miscibili cu apa, asigurarea omogenitatii mediului si respectiv a conditiilor
optime de reactie, impune adaugarea de acetona (de obicei 1 volum la 1-4 volume de mediu
apos continand cefalosporina C).
In finalul rectiei, derivatul acilat se obtine sub forma de sare solubila. Dupa acidulare
la pH 2-2,5 (cu acizi minerali), acesta se extrage in solventi organici (metilizobutilcetona,
acetat de butil) si ulterior se separa din faza organica prin precipitare sub forma de sare de
sodiu sau de chinolina. Astfel se pot obtine, cu randamente variind intre 50-70%, saruri de
cefalosporina C N-acilata care necesita purificari suplimentare in vedera utilizarii ulterioare la
prepararea acidului 7-aminocefalosporanic.
Aplicarea acestui procedeu la nivel industrial prezinta urmatoarele dezavantaje:
excesul mare de agent de acilare, utilizarea acetonei care se recupereaza greu din solutii
apoase, randamentele relativ mici si puritatea uneori necorespunzatoare a preparatelor brute
obtinute.
b) Procedeul cromatografic. Acest procedeu se bazeaza pe utilizarea cromatografiei
de adsorbtie combinata cu cromatografia de schimb ionic.
26
In faza de cromatografie de adsorbtie se utilizeaza coloane umplute cu rasini
macroporoase neutre (de tip Amberlite XAD-2 sau XAD-4) care sunt traversate de filtratul
acidulat dupa indepartarea miceliului, realizandu-se adsorbtia selectiva a cefalosorinei C, la
pH 2,5-3. Adsorbtia cefalosporinei este urmata de spalarea rasinii cu apa, pentru indepartarea
lichidului interstitial. Elutia antibioticului se realizeaza cu o solutie alcoolica sau acetonica
10-50%.
Cefalosporina C din eluatul de pe rasina adsorbanta se purifica in continuare prin
cromatografie de schimb ionic pe un anionit slab bazic. Dupa concentrarea eluatului de pe
anionit continand cefalosporina C purificata, aceasta poate fi precipitata prin adaugare de
alcool sau acetona, sub forma de complecsi cu ioni de Zn 2+, Cu2+ sau Cd2+, ioni ramasi din
filtratul initial (rasina adsorbanta folosita in prima treapta cromatografica nu retine ionii
anorganici).
Hidroliza grupei amida din pozitia C7 a nucleului cefem conduce la obtinerea aminei
corespunzatoare, prin acilarea careia se pot obtine cefalosporine de semisinteza cu valoare
terapeutica superioara.
Transformarea cefalosporinei C N-acilata in acid 7-aminocefalosporanic (7-AC) se
poate realiza atat pe cale chimica, prin metoda iminoeterilor, aplicata in conditii asemanatoare
penicilinelor, cat si prin conversie enzimatica (conform schemei 10.5.)
Acidul 7-aminodezaceoxicefalosporanic (7-ADC), se obtine in mod asemanator
acidului 6-AP, prin hidroliza enzimatica a cefalosporinei G (benzil-dezacetoxicefalosporina)
cu ajutorul penicilin-G-acilazei, a carei specificitate de substrat este suficient de larga pentru a
include si legatura fenilacetilamida din structuri asemanatoare penicilinei (schema 10.6)
[Ellaiah P., 2000].
Schema 10.5
Conversia enzimatica a cefalosporinei C la acid 7-AC
27
Schema 10.6.
28
10.2.2.4. Procedee de obtinere a cefalosporinelor de semisinteza
29
10.2.2.5. Exemple de cefalosporine utilizate in mod curent in practica terapeutica
Tabelul 10.12
30
R1 S
1 2
7 6
8 N5 3 R2
4
O
COOH
Exemple de cefalosporine de semisinteza
31
Tabelul 10.12 (continuare)
1 2 3 4
Spectru foarte larg, incluzand tulpini
Ceftriaxon rezistente la alte antibiotice (activ fata de
Pseudomonas aeruginosa)
10.3. GRISEOFULVINA
Griseofulvina este un alt antibiotic produs de fungi din genul Penicillium, avand
proprietati total diferite de cele caracteristice penicilinelor.
Molecula griseofulvinei are o structura spiranica, rezultata din existenta unui atom de
carbon comun unei structuri de tip cumaran si unui derivat de ciclohexena. Structura de tip
cumaran se caracterizeaza printr-un ciclu benzenic (A), pe care sunt grefate doua grupe
metoxi si un atom de clor si care este condensat cu un ciclu tetrahidrofuranic (B) ce poarta o
grupa cetonica. Al treilea ciclu (C) este o ciclohexenona disubstituita cu o grupa metoxi si o
grupa metil.
Desi aceasta structura contine doi atomi de carbon asimetrici, respectiv atomul de
carbon spiranic din pozitia 2 si cel din pozitia 6’, activitatea optica a moleculei de
griseofulvina este determinata de configuratia substituentilor din pozitia 6’. Singurul izomer
optic activ care prezinta si activitate biologica este cel in care grupa metil din pozitia 6’ este
orientata in pozitia cis fata de grupa cetona din pozitia 3. Aceasta configuratie este
caracteristica griseofulvinei obtinuta prin biosinteza.
33
Reactivitatea grupei metoxi din pozitia 2’ determina transformarea griseofulvinei intr-
un enol sau o dicetona, prin tratare cu acid clorhidric in metanol sau cu solutii diluate de
hidroxizi.
Hidroliza alcalina, in prezenta solutiilor concentrate de hidroxizi, conduce la
decarboxilarea moleculei si transformarea structurii spiranice intr-o structura triciclica
condensata.
Griseofulvina poate fi oxidata cu permanganat de potasiu, obtinandu-se acidul 3-clor-
4,6-dimetoxisalicilic, precum si cu acid cromic sau anhidrida cromica, formandu-se 2-metoxi-
6-metilchinona.
Prin reducere catalitica, griseofulvina se transforma intr-un derivat de benzofenona.
Clorurarea moleculei de griseofulvina in mediu organic poate conduce la produsi
mono- sau disubstituiti in nucleul C.
Dintre cele doua grupe carbonil, numai cea din pozitia 4’ este reactiva, dand reactii
specifice cetonelor.
Pe langa structura si proprietati fizico-chimice, griseofulvina se deosebeste de
antibioticele de origine fungica si prin proprietatile biologice, respectiv prin actiunea sa
antimicotica sistemica, in special asupra tulpinilor de Trycophyton, Microsporum si Achoron.
Ca urmare, griseofulvina este utilizata in tratamentul dermatofitiilor regiunilor paroase ale
pielii capului si fetei.
Desi grizeofulvina se poate obtine si prin metode chimice, acestea nu se aplica la nivel
industrial deoarece sunt costisitoare si complicate in plus si de faptul ca prin sinteza chimica
antibioticul se obtine sub forma de amestec racemic, ceea ce presupune etape suplimentare de
separare a izomerului optic biologic activ.
Procedeul de biosinteza a griseofulvinei este mult mai avantajos din punct de vedere
econonic, el realizandu-se pe baza unei tehnologii asemanatoare celei aplicate in cazul
penicilinelor, prin cultivarea unor tulpini de fungi ca: Penicillium griseofulvum, Penicillium
notatum, Penicillium urticae, Penicillium patulum, sau Penicillium sclerotigenum [Vencata
Dasu V., 1996].
Ca surse de carbon si energie pentru dezvoltarea biomasei si biosinteza antibioticului
se folosesc glucide ca: glucoza, fructoza, lactoza sau amidon.
In compozitia mediilor nutritive utilizate pentru producerea griseofulvinei se foloseste
de cele mai multe ori extractul de porumb ca sursa principala de azot, datorita faptului ca
acesta contine si vitamine care stimuleaza biosinteza antibioticului. Continutul in sursa de
azot se regleaza in functie de natura sursei de carbon.
Mediile de cultura specifice biosintezei grizeofulvinei contin de asemenea saruri de
calciu si fosfati, de obicei sub forma de carbonat de calciu si respectiv fosfat monopotasic,
care influenteaza dezvoltarea masei celulare si limiteaza variatia pH-ului in domeniul 6,5-7.5.
Fermentatia se realizeaza in conditii de agitare si aerare, la temperatura de 25 0C si se
desfasoara pe o durata mare (12 – 14 zile).
Deoarece, spre deosebire de peniciline, griseofulvina se gaseste in finalul fermentatiei
in miceliu, bioprocesul trebuie oprit inainte de atingerea stadiului de autoliza.
Procesarea post-biosinteza a mediului final de fermentatie incepe cu filtrarea
miceliului (operatie dificila datorita structurii si consistentei acestuia), care se efectueaza dupa
un tratament termic de 5-10 minute la 600C. Dupa filtrare, masa celulara se usuca la 70-800C
si se macina cu ajutorul unor utilaje adecvate (mori cu bila sau micropulverizatoare),
pregatindu-se astfel pentru etapa urmatoare, care consta in extractia griseofulvinei in solventi
organici. In acest scop se folosesc diclormetanul sau dicloretanul, care corespund criteriilor de
34
selectivitate si solubilitate si se utilizeaza de obicei in proportie de 25% fata de greutatea
biomasei umede. Extractia se realizeaza in general in coloane, in contracurent, pana la
epuizarea continutului de griseofulvina din miceliu.
Solutia organica de griseofulvina, rezultata in urma extractiei, se concentreaza, apoi se
raceste la 5-100C si se trateaza cu un “nesolvent” miscibil cu extractantul, de obicei benzina
de extractie, care are proprietatea de a precipita antibioticul, sub forma de produs brut, cu un
continut de 90 – 98%.
Purificarea griseofulvinei brute se efectueaza prin dizolvare in dicloretan, decolorare
cu carbune activ si reprecipitare cu benzina. Produsul final rezultat in urma acestui tratament
si dupa uscare la 50-600C atinge o puritate de peste 99,5%.
In aceste conditii se poate obtine un randament global de izolare – purificare a
griseofulvinei de 80 – 85%.
10.4.1. Streptomicina
Sulfat de streptomicina
10.4.1.2. Biosinteza
36
Pe langa glucoza, mediile de biosinteza a streptomicinei folosite la nivel industrial se
caracterizeaza prin prezenta unor ingrediente naturale, bogate in proteine, cum sunt: faina de
soia, extractul de porumb, faina de seminte de bumbac etc, cel mai des fiind utilizata faina de
soia. In general, sursele organice complexe de azot sunt preferabile celor anorganice, precum
sarurile de amoniu sau nitratii, deoarece permit un mai bun control de pH si in acelasi timp
furnizeaza in mod continuu o concentratie limitata de azot, prevenind sinteza excesiv de
rapida a proteinelor.
Ca surse de oligoelemente se folosesc fosfati alcalini, carbonat de calciu, clorura de
sodiu, etc. Concentratia de cationi anorganici trebuie astfel reglata incat acestia sa nu
interfere in faza de izolare a streptomicinei pe schimbatori de ioni.
Ca urmare a faptului ca biosinteza streptomicinei in celulele de Streptomyces griseus
este stimulata de metabolizarea glucidelor pe calea oxidativa a pentozo-fosfatilor,
productivitatea tehnologiei de biosinteza depinde in mare masura de respectarea urmatoarelor
conditii referitoare la compozitia mediului de cultura si parametrii de bioproces:
- prezenta glucozei in concentratie adecvata dar nu excesiva;
- asigurarea unei concentratii adecvate de fosfor anorganic, in functie de faza de
fermentatie: cresterea biomasei sau elaborarea antibioticului (40 – 120 μg/ml);
- asigurarea in mod continuu a unor concentratii limitate de azot disponibil, pentru
evitarea sintezei proteice cu viteza excesiva;
- aerare buna;
- mentinerea pH-ului in domeniul 7-8;
- mentinerea temperaturii in intervalul 27-290C.
In aceste conditii, evolutia fermentatiei se caracterizeaza prin parcurgerea a trei faze
care se pot distinge in functie de variatia pH-ului. In prima faza are loc cresterea masei
celulare concomitent cu utilizarea glucozei si a azotului din amoniacul eliberat din faina de
soia; aceasta faza este evidentiata prin cresterea lenta a pH-ului de la valoarea initiala de 6,7 la
7,6, pe parcursul a 20-50 de ore. Faza a doua, care poate dura 50-100 ore, corespunde
producerii antibioticului si se caracterizeaza prin epuizarea glucozei si scaderea lenta a pH-
ului pana in jurul valorii 6,7. In faza a treia, care de obicei dureaza 20 de ore, elaborarea
antibioticului inceteaza, acesta fiind eliberat in mediul extracelular.
37
In toate procesele de biosinteza a streptomicinei, in fazele de inceput ale fermentatiei
are loc si formarea de manozidostreptomicina. Intrucat manozidostreptomicina are doar 20%
din activitatea antibacteriana a streptomicinei, se urmareste ca aceasta sa nu depasasca 10%
din cantitatea de streptomicina din finalul fermentatiei. Pentru transformarea prin scindare
hidrolitica a manozidostreptomicinei in streptomicina, este necesara asigurarea anumitor
parametrii de bioproces care corespund activitatii unei enzime specifice, manozidaza. Acesti
conditii, care nu pot fi indeplinite in totalitate decat in finalul fermentatiei, sunt urmatoarele:
- limitarea continutului in metale grele, care sunt inhibitori ai manozidazei;
- asigurarea unei aerari adecvate, aceasta enzima fiind inhibata de aerarea deficitara;
- evolutia pH-ului catre valoarea 8, in finalul biosintezei streptomicinei, valoare optima de pH
pentru activitatea manozidazei;
- scaderea concentratiei de glucoza sub 0,5-1%, intrucat aceasta inhiba biosinteza enzimei;
- cresterea temperaturii la 320C, valoare optima pentru activitatea manozidazei.
Intr-o prima etapa cationul streptomicinei este retinut pe un cationit slab acid,
continand grupe carboxilice.
Practic, aceasta operatie se efectueaza intr-o baterie de coloane incarcate cu cationit
activat partial in forma Na+. Prima coloana dintr-o astfel de baterie este considerata saturata
cand continutul de streptomicina din efluent ajunge la 80% din valoarea initiala, de la intrarea
in coloana. Efluentul de pe o coloana este trecut pe coloana urmatoare, pana cand se
realizeaza fixarea pe cationit a intregii cantitati de streptomicina din solutia nativa. Coloanele
se scot din circuit pe masura ce se satureaza si se pregatesc pentru elutia streptomicinei, prin
spalare cu apa dedurizata, inainte si dupa sterilizare cu formol.
In a doua etapa a cromatografiei de schimb ionic, se realizeaza elutia streptomicinei cu
solutie de acid sulfuric 4-5%. Astfel se obtine un eluat cu pH 4-4,5, continand sulfat de
streptomicina.
Pentru purificarea streptomicinei separata din solutia nativa se foloseste in continuare
cromatografia de schimb ionic.
In prima treapta de purificare, se retine excesul de ioni sulfat cu ajutorul unui anionit
slab bazic.
In treapta a doua de purificare, solutia de sulfat de streptomicina neutralizata, care
contine impuritati organice si saruri minerale, este trecuta peste o coloana continand un
cationit puternic acid, care are rolul de a retine bazele organice, compusii pirogeni si ionii
metalici.
38
Efluentul de pe aceasta ultima coloana se concentraza sub vid, la temperaturi mai mici
de aproximativ 350C. Solutia concentrata de sulfat de streptomicina se decoloreaza cu carbune
activ, apoi se filtreza steril, iar filtratul se atomizeaza pentru obtinerea sulfatului de
streptomicina sub forma de pulbere.
Dupa fiecare utilizare, schimbatorii de ioni se regenereaza. si se recircula.
Pentru conservarea puritatii produsului, inainte de atomizare se adauga in solutia
concentrata stabilizatori de pH si antioxidanti iar pentru asigurarea sterilitatii produsului finit
se utilizeaza agenti antibacterieni si se iradiaza in mod continuu, cu radiatii UV, spatiile in
care au loc operatiile de filtrare, atomizare si ambalare.
39
O
Denumirea X R2 R3
Neomicina B NH2 H CH2NH2
Neomicina C NH2 CH2NH2 H
Paromomicina I OH H CH2NH2
Paromomicina II OH CH2NH2 H
40
este inactiva fata de cocii Gram-negativi. Administrata pe cale bucala are actiune predominant
locala (la nivelul tubului digestiv). Rezistenta la neomicina se dezvolta lent. Neomicina este
sinergica cu streptomicina, bacitracina si eritromicina.
Conditionat sub forma de comprimate sau unguente, sulfatul de neomicina se
comercializeaza sub denumirea de Negamicina, de uz intern - pentru sterilizarea aparatului
digestiv in diarei infectioase si in faze preoperatorii - si extern, pentru aplicatii topice in plagi,
arsuri, furunculoze, infectii oculare. In asociere cu bacitracina, sulfatul de neomicina se
comercializeaza ca unguent, sub denumirea de Negamicin B, produs cu spectru larg de
actiune, utilizat in piodermite, impetigo, eczeme uscate infectate, etc
Neomicina este oto-si nefrotoxica si nu se asociaza sau se asociaza cu prudenta cu alte
antibiotice aminoglicozidice administrate sistemic.
Paromomicina se foloseste aproape exclusiv, pe cale orala, in tratamentul amoebiazei
intestinale.
10.4.3. Kanamicine
Kanozamina
2-Desoxi-
streptamina
41
nepolari. Poate fi degradata de catre unii germeni kanamicino-rezistenti, prin acetilarea grupei
amina a glucozaminei.
Actiunea farmaco-terapeutica a kanamicinei se caracterizeaza prin efectul bactericid in
special asupra bacililor Gram-negativi (E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella,
Shigella, Serratia tuberculosis) si prin sinergism cu peniciline si cefalosporine. Se
foloseste ca antibiotic de atac in majoritatea septicemiilor si ca antibiotic de substitutie in caz
de rezistenta la antibioticele uzuale. Este indicat in infectii renale, urinare, genitale,
endocardite, meningite, infectii respiratorii, stafilococii cutanate maligne ale fetii si in
tuberculoza cu bacili Koch rezistenti la tuberculostaticele uzuale.
Aplicarea kanamicinei este limitata, ca si in cazul streptomicinei, de oto-si nefro-
toxicitatea care o caracterizeaza, astfel incat doza maxima administrabila nu trebuie sa
depaseasca 15 mg/kg/zi si 15 g ca doza totala.
Se comercializeaza sub forma de flacoane continand 1 g sulfat de kanamicina pentru
solutii injectabile sau sub forma de unguent oftalmic 1%.
10.4.4. Gentamicina
Acest antibiotic se obtine ca metabolit secundar al unor bacterii sporogene, din genul
Micromonospora sau Mechinospora. In mediul de cultivare a microorganismelor
producatoare s-au evidentiat mai multe produse cu structura amino-glicozidica asemanatoare,
intre care gentamicina A se gaseste in cantitatile cele mai mari, fiind si cea mai activa.
In structura gentamicinei A se intalnesc urmatoarele componente unite prin legaturi
glicozidice: 2-D-glucozamina, 2-desoxi-streptamina si o osamina caracteristica, gentozamina.
Gentamicina A baza este o substanta care se prezinta sub forma de pulbere amorfa, cu
p.t. = 1080C.
Se obtine printr-o tehnologie asemanatoare celei aplicate in cazul streptomicinei, cu
deosebirea ca izolarea sulfatului de Gentamicina A nu se realizeaza prin atomizare, ci prin
precipitare cu acetona sau eter etilic, iar purificarea produsului brut se realizeaza prin
dizolvare in metanol, decolorare cu carbune activ si reprecipitare cu acetona sau eter etilic.
Gentamicina este un antibiotic cu spectru larg de actiune ce cuprinde coci si bacili
Gram-pozitivi si Gram-negativi, inclusiv Salmonella, Proteus, E coli, Enterobacter; mai
putini sensibili la Gentamicina sunt Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis si
Pseudomonas aeruginosa. Se utilizeaza in pielonefrita, pneumonii intraspitalicesti, meningite
cu bacili Gram-negativi, endocardita cu enterococi rezistenti la streptomicina, arsuri infectate,
blefaroconjunctivite, blefarita, ulcere corneene.
Se comercializeaza sub forma de sulfat sau clorhidrat de gentamicina, conditionate sub
forma de solutii injectabile, oftalmice, creme si unguente si se administreaza cu precautie
datorita oto- si nefrotoxicitatii.
42
10.5. TETRACICLINE
Tabel 10.13
Structura unor tetracicline naturale si de semisinteza
Denumire R''' R'' R' R
generica
Tetraciclina H Me OH H
Clortetraciclina H Me OH Cl
Oxitetraciclina OH Me OH H
Doxiciclina OH Me H H
Metaciclina OH =CH2 H
Meclociclina OH =CH2 Cl
Tetraciclinele sunt substante solide care se prezinta sub forma de pulberi cristaline, de
culoare galbena. Datorita structurii lor, prezinta benzi de absorbtie caracteristice in UV, IR si
spectre de fluorescenta.
Proprietatile tetraciclinelor de a forma saruri cu acizi si cu baze (ca urmare a
caracterului lor amfoter), precum si de a forma chelati cu ionii metalici sunt folosite pentru
separarea, purificarea, identificarea si dozarea lor cantitativa. Pe proprietatea de a lega foarte
usor si stabil oligoelementele esentiale dezvoltarii microorganismelor se bazeaza si
mecanismul de actiune impotriva agentilor patogeni: prin formarea unor punti de magneziu,
tetraciclinele impiedica atasarea moleculelor de ARN mesager pe suprafata fractiunii
ribozomale 30S si mascheaza situsul de pe fractiunea ribozomala 50S de fixare a complexului
aminoacil-ARN de transport.
Tetraciclinele sunt instabile in mediu bazic, acid sau oxidant, datorita reactiilor de
degradare care au loc la nivelul pozitiilor C 10-C12 si a reactiilor de epimerizare la C 4. Sub
forma de clorhidrati, tetraciclinele sunt mult mai solubile si mai stabile in timp, dar
administrarea parenterala in aceasta forma este dureroasa.
43
10.5.2. Obtinerea tetraciclinelor naturale
44
- cromatografie de adsorbtie, in care tetraciclinele sunt fixate pe suporturi anorganice, apoi
eluate cu solventi polari si separate prin retinerea fractiunilor fluorescente;
- precipitare sub forma de complecsi insolubili cu ioni de calciu, dupa neutralizarea filtratului
la pH=7,7 cu solutie amoniacala. Formarea acestor complecsi se datoreaza ionilor de calciu
din CaCO3, adaugat in mediile de cultura in proportie de 1%, pentru tamponarea aciditatii
rezultate din fermentatie. Complecsii insolubili ai tetraciclinei se separa prin filtrare de
celelalte componente ale lichidului de fermentatie, care, printre altele, contine si vitamina B 12;
apoi se suspenda in apa si se trateaza cu acid oxalic pana la pH 1,5-1,9, pentru precipitarea
oxalatului de calciu si eliberarea tetraciclinei baza. Oxalatul de calciu se indeparteaza prin
filtrare, iar separarea tetraciclinei baza din filtrat se realizeaza prin precipitare acesteia la
pH=4.
Tetraciclina baza se purifica prin extractie intr-un amestec de metanol:acetat de butil
(1:10). Extractul se concentraza si din solutia concentrata tetraciclina se poate separa sub
forma bazica, prin precipitare cu apa demineralizata, sau sub forma de clorhidrat, prin tratare
cu HCl concentrat.
Ca urmare, Rolitetraciclina baza este mult mai solubila decat tetraciclina, iar
clorhidratul sau, de asemenea mult mai solubil decat tetraciclina clorhidrat, se intrebuinteaza
45
la prepararea de solutii injectabile. Acestea se administreaza in tratamente de soc sau cand
administrarea orala este inoperanta (diaree si vome energice).
O alta tetraciclina de semisinteza este metaciclina (6-dezoxi-6-metilen-5-hidroxi-
tetraciclina), care este foarte eficienta in combaterea infectiilor respiratorii prin doza unica,
mai ales la copii, in cazuri de pneumonie. Este de asemenea eficienta in infectii gastro-
intestinale (febra tifoida, salmoneloza, dizenterie bacilara), septicemii, precum si in infectii
biliare si urinare.
Doxiciclina, care se poate obtine din oxitetraciclina sau din metaciclina, are un
spectru similar, dar este mai activa si ca atare actioneaza eficient in doze de aproximativ
jumatate din cele ale tetraciclinei, iar durata de actiune este cu mult mai mare decat a
celorlaltor tetracicline, depasind 24 ore..
46
Fig. 10. 6. Structura unor macrolide antibacteriene
10.6.1. Eritromicina
47
Izolarea eritromicinei se realizeaza printr-un procedeu asemanator celui aplicat in
cazul penicilinei, bazat pe extractie lichid-lichid in trepte.
Astfel, eritromicina baza se extrage din filtrat, la pH=9-10, prin tratarea acestuia cu
acetat de butil. In acest mod, in extractul organic se poate realiza o concentratie de
eritromicina cuprinsa intre 5.000-9.000 UI/ml.
In treapta a doua, eritromicina baza se transforma in sare, prin extractie din solutia
organica intr-o solutie apoasa de KH2PO4, la pH=4. Aceasta faza se realizeaza rapid, in
extractoare centrifugale, pentru evitarea inactivarii antibioticului.
Extractul apos, in care concentratia antibioticului poate atinge 14.000 UI/ml, se
neutralizeaza imediat la pH=10 si se raceste 0-100C, in vederea extractiei eritromicinei baza in
diclormetan.
Extractul final, continand eritromicina in concentratie de 30.000UI/ml, se supune
operatiei de evaporare peliculara, la 30-400C si 0,4 atm, in urma careia se obtine o solutie de
150-300.000 UI eritromicina/ml, din care antibioticul cristalizeaza lent, prin racire la
–100C si se separa prin filtrare.
Eritromicina are un spectru de actiune asemanator penicilinei G (streptococi,
pneumococi, Neisseria gonorrheae, H. influenzae), la care se adauga si stafilococii
producatori de penicilinaze si nu este activa fata de Pseudomonas, Proteus, Salmonella. Este
foarte utila in combaterea bolilor venerice la bolnavi penicilino-alergici.
Eritromicina baza este insolubila in apa si instabila in mediu acid. La pH≤6 este
inactivata in 1-3 ore, dar la pH fiziologic de 7,4 este stabila 24 ore la 37 0C. Ca urmare,
formularea farmaceutica pentru administrare parenterala este dificila, iar administrarea orala
este ineficienta. Din aceste motive s-a cercetat obtinerea unor derivati ai eritromicinei care sa
nu prezinte dezavantajele sus-mentionate, descoperindu-se un numar de esteri si saruri ale
eritromicinei care au proprietati farmacologice superioare.
Propionil-eritromicina s-a obtinut prin tratarea eritromicinei cu anhidrida propionica,
la 10-150C, in mediu de acetona anhidra, in urma unei reactii de acilare a grupei hidroxil a
desozaminei. Produsul acilat s-a separat prin precipitare cu apa desalinizata, obtinandu-se in
final un randament global (acilare + izolare) de 80-85%.
Propionil-eritromicina nu este inactivata de aciditatea gastrica, deci se poate
administra oral sub forma de comprimate si se resoarbe mai rapid ca eritromicina.
Acest produs nu provoaca decat rar rezistenta germenilor patogeni si actioneaza
sinergic cu penicilina.
Etilsuccinatul de eritromicina se prepara prin acilarea grupei hidroxil din pozitia 2’ a
eritromicinei sau propionil-eritromicinei cu hemiesterul succinic, in solvent organic. Pentru
siropurile de uz pediatric se folosesc esteri emulsionabili, ca lauril-sulfatul si strearatul de
dimetil-piranozil-amoniu. Pentru administrarea intravenoasa si intramusculara se folosesc
saruri ale eritromicinei. De exemplu, lactobionatul de eritromicina este foarte solubil in apa si
actioneaza foarte rapid dupa administrarea solutiei injectabile.
10.6.2. Cetolide
Ca substanta activa, nistatina se prezinta sub forma unei pulberi de culoare galben-
deschis, cu p.t =1600C (desc.). Este insolubila in apa si solubila in alcooli alifatici inferiori.
Reactivitatea chimica a nistatinei este marcata de caracterul sau puternic reducator.
Etapa de biosinteza din tehnologia de obtinere a nistatinei parcurge fazele intalnite in
cazul tuturor antibioticelor. Ca microorganisme producatoare la nivel industrial se utilizeaza
tulpini de Streptomyces noursei [Brautaset T., 2000]. In finalul fermentatiei, antibioticul se
gaseste in miceliu, din care se extrage cu metanol.
In prima treapta de separare, solutia metanolica concentrata de nistatina se trateaza
concomitent cu butanol, care are rolul de a extrage impuritatile si cu o solutie diluata de
49
elecrolit (NaCl 0,85%), care are rolul de a precipita nistatina, sub forma de produs brut.
Acesta se reia in metanol si se reprecipita cu solutii diluate de NaCl, operatia repetandu-se de
mai multe ori. In ultima treapta de purificare, solutia metanolica de nistatina se trateaza, sub
racire, cu acetat de etil, ceea ce are ca urmare precipitarea antibioticului purificat.
Nistatina este un antibiotic lipsit de toxicitate. Este foarte activa fata de Candida
albicans, dar actioneaza energic si asupra altor levuri (Blastomyces, Tricophyton,
Microsporon). Se comercializeaza si sub denumirea Stamicin. Este indicata in tratamentul
candidozelor bucofaringiene, intestinale si vaginale si se poate asocia antibioticelor cu spectru
larg, administrate timp indelungat. Ca uz veterinar, nistatina se foloseste in tratamentul
tricofitiilor.
50