Analiza RADIO-IMUNĂ(ARI)

IMPORTANȚA PRACTICĂ
Introducere
- Metoda radioimuna (RIA-radioimmunoassay) este o tehnica de mare sensibilitate folosita pentru a măsura
concentrația antigenelor utilizand anticorpii. Tehnica presupune separarea unei proteine dintr-un amestec
folosindu-se de specificitatea legaturii antigen-anticorp și măsurarea cantitatii complexelor prin radioactivitate.
Tehnica a revolutionat cercetarea si practicile medicale in domenii diverse: diagnosticul alergiilor (prin
metoda RAST-radioalergosorbent), endocrinologie, virusologie.

Un radioimunotest ( RIA ) este un imunotest care utilizează molecule radiomarcate într-o formare

treptată a complexelor imune . O RIA este o tehnică de testare in vitro foarte sensibilă , utilizată
pentru a măsura concentrațiile de substanțe, de obicei măsurând concentrațiile de antigen (de
exemplu, nivelurile de hormoni din sânge ) prin utilizarea anticorpilor .
 Istorie
RIA a fost introdusa in
1960 de Berson si Yalow ca
un test pentru
determinarea insulinei din
sange. Era prima data
cand se doza nivelul unui
hormon din sange printr-
un test in vitro. In 1977,
Rosalyn Yalow a primit
premiul Nobel in medicina
pentru dezvoltarea tehnicii
radioimune pentru
insulina.
 
 Tehnica de lucru
Se prepara un amestec format din antigene radioactive si
anticorpii corespunzatori lor. Izotopii sunt des utilizati datorita
usurintei cu care se leaga de tirozina din proteine. In
urmatoarea etapa se adauga in amestec cantitati cunoscute de
antigene nemarcate. Acestea intra in competitie cu situsurile de
legare ale anticorpilor. La cresterea cantitatii de antigene
nemarcate, un numar mai mare de antigene radioactive este
deplasat din legaturile cu anticorpii, iar apoi se masoara
radioactivitatea din sange.
Din datele obtinute rezulta un grafic cu o curba standard de
legare. Esantioanele care trebuie testate (antigenele
nemarcate), sunt desenate in paralel. Dupa stabilirea raportului
de legare a fiecarui antigen necunoscut, concentratia acestora
poate fi citita direct pe curba standard.
 Prin adaugarea unei a doua cantitati de anticorpi indreptate
impotriva primelor antigene, rezulta precipitarea complexelor
antigen-anticorp. De exemplu, se poate precipita prin
adaugarea unor antigene anti-IgG.
Metoda este vast folosita datorita marii specificitati pe care o
are. Daca afinitatea anticorpilor este foarte mare, este posibil
sa fie detectate cantitati de antigene de ordinul picogramelor
(10-12). Cu cat este mai mare specificitatea, cu atat testul este
mai exact.
Deși tehnica RIA este extrem de sensibilă și extrem de specifică ,
necesitând echipamente specializate, rămâne printre cele mai puțin
costisitoare metode de a efectua astfel de măsurători. Necesită precauții
speciale și autorizare, deoarece sunt utilizate substanțe radioactive.

În schimb, un test imunoradiometric (IRMA) este un imunotest care

utilizează molecule marcate radioactiv, dar într-un mod imediat, mai
degrabă decât în ​trepte.

Un test radioalergosorbent ( RAST ) este un exemplu de radioimunotest.

Este folosit pentru a detecta alergenul cauzator al unei alergii .
Această metodă poate fi utilizată pentru orice moleculă biologică în principiu și nu este limitată la antigenele
serice și nici nu este necesară utilizarea metodei indirecte de măsurare a antigenului liber în loc de
măsurarea directă a antigenului capturat. De exemplu, dacă nu este de dorit sau nu este posibilă
radiomarcarea antigenului sau a moleculei țintă de interes, se poate face o RIA dacă sunt disponibili doi
anticorpi diferiți care recunosc ținta și ținta este suficient de mare (de exemplu, o proteină) pentru a prezenta
mai multe epitopiila anticorpi. Un anticorp ar fi radiomarcat ca mai sus, în timp ce celălalt ar rămâne
nemodificat. RIA ar începe cu anticorpul „rece” nemarcat fiind lăsat să interacționeze și să se lege de
molecula țintă în soluție. De preferinţă, acest anticorp nemarcat este imobilizat într-un fel, cum ar fi cuplat la
o sferă de agaroză , acoperit pe o suprafaţă etc. Apoi, anticorpul marcat radioactiv „fierbinte” este lăsat să
interacţioneze cu primul complex anticorp-moleculă ţintă. După spălare extinsă, cantitatea directă de
anticorp radioactiv legat este măsurată și cantitatea de moleculă țintă cuantificată prin compararea acesteia
cu o cantitate de referință testată în același timp. Această metodă este similară, în principiu, cu metoda
ELISA sandwich neradioactivă
Există două metode diferite de RIA care sunt utilizate în mod obișnuit pentru detectarea drogurilor în matricele biologice,
RIA cu anticorpi dublu și RIA cu tub acoperit. Cu RIA cu anticorp dublu, se adaugă un al doilea anticorp pentru a facilita
precipitarea anticorpului primar legat. Odată ce complexul anticorp-antigen primar/secundar precipită, medicamentul marcat
nelegat poate fi îndepărtat cu ușurință. Cu tubul acoperit RIA, anticorpul primar este acoperit pe interiorul fiecărui tub.
Medicamentul marcat nelegat poate fi îndepărtat cu ușurință prin turnarea supernatantului. Probele din fiecare metodă RIA
sunt analizate într-un contor gamma pentru a determina numărările pe minut, care este invers proporțional cu cantitatea de
medicament prezentă în specimenul original. Testele radioimuno sunt atât sensibile, cât și specifice, dar necesită o
manipulare și eliminare specialădeseuri radioactive . În plus, termenul de valabilitate este limitat la aproximativ două luni din
cauza dezintegrarii radioactive .

Deși cândva populară, utilizarea RIA-urilor în laboratoarele clinice a scăzut în primul rând din cauza preocupărilor
legate de manipularea și eliminarea în siguranță a reactivilor radioactivi și a deșeurilor. RIA au fost în mare parte
înlocuite cu imunotestele nonizotopice . O excepție a fost dezvoltarea RIA-urilor de neseparare bazate pe modularea
unui tritiu sau aEtichet cu microparticule încărcate cu un scintilant. Aceste așa-numite teste de proximitate cu scintilație
au găsit aplicații de rutină în testele de screening cu randament ridicat utilizate pentru descoperirea medicamentelor.
 Dezavantaje
 
Cele mai mari dezavantaje ale folosirii acestei metode sunt costul ridicat si riscul important care presupune
prepararea si folosirea antigenelor radioactive. Ambii izotopi emit radiatii gamma care necesita un echipament
special de manipulare. Organismul uman concentreza iodul – radioactiv sau nu – in glanda tiroida unde sunt
incorporati in tiroxina (T4).
 
 Avantaje
In ciuda neajunsurilor, RIA a
devenit un test foarte des folosit
in laboratoare. Este utilizat
pentru a detecta nivelul
majoritatii hormonilor din sange,
digitoxina la pacientii care o au
in medicatie, droguri. De
asemenea, poate fi detectat
antigenul de suprafata al
virusului hepatitic B (HBsAg) in
sangele donat, anticorpii anti-
ADN in Lupus erythematosus.