Sunteți pe pagina 1din 15

Universitatea Aurel Vlaicu din Arad

Facultatea de Inginerie Alimentara, Turism si Protectia Mediului


Specializarea: Biotehnologii Industriale
Anul: IV

BIOSENZORI FOLOSITI PENTRU DETERMINAREA


GLUCOZEI DIN SANGE

2008

BIOSENZORI FOLOSITI PENTRU DETERMINAREA


GLUCOZEI DIN SANGE

Definitia biosenzorilor
Biosenzorii sunt detectori ce se bazeaza pe molecule selective ce intra in componenta plantelor si
animalelor. Biosenzorii moderni au evoluat din combinarea a doua discipline separate: tehnologia
informationala, (microcircuite si fibre optice, procesare numerica a datelor, teoria generala a sistemelor cu
comportare neliniara) si biologia moleculara. Prima furnizeaza electrozi miniaturali sau senzori optici,
tehnica de preluare si procesare a informatiei iar a doua, pune la dispozitie biomolecule care recunosc o
substanta tinta.

Istoria biosenzorilor
In 1950 Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod destinat a fi folosit pentru masurarea oxigenului
dizolvat in sangele bolnavilor operati. Acesta este format dintr-un electrod de platina si un electrod cu o
membrana de plastic permeabila la gaze. Polaritatea electrodului a fost astfel stabilita incat intensitatea
curentului prin circuit sa depinda de viteza de difuzie a oxigenului prin membrana, viteza ce este direct
proportionala cu concentratia externa a oxigenului.
In 1962 Clark extinde folosirea acestui "electrod de masurare a oxigenului" la determinarea
nivelului de glocoza in sange. El a imbracat senzorul pentru oxigen cu un strat subtire de gel ce contine un
biocatalizator, enzima numita gluco-oxidaza, urmat de o membrana semipermeabila de dializa ce permite
glucozei sa difuzeze in senzor, dar opreste enzima sa difuzeze afara. Cu cat intra mai multa glucoza, cu
atat mai mult oxigen este consumat de enzima. Deci, o cantitate mica de oxigen existenta se traduce prin
existenta unui nivel ridicat de glucoza.
In 1969, G.Guilbault a inventat un sistem de masura a ureei in fluidele corpului. Dispozitivul lui
foloseste o enzima, ureaza, ce converteste urea in bioxid de carbon si amoniac. Electrodul sesizeaza
schimbarile in concentratia ionilor de amoniu. Acest dispozitiv a constituit o imbunatatire pentru ca se
bazeaza pe o detectie potentiometrica (un fel de senzor potentiometric), o tehnica ce de atunci a fost
folosita foarte mult. In timp ce senzorii lui Clark masoara trecerea curentului prin electrod, senzorul
potentiometric masoara tensiunea ceruta pentru mentinerea curentului la zero. Electrodul nu consuma nici
un fel de reactanti de aceea este mai putin susceptibil la erori cauzate de schimbarile survenite in mediul
extern. In plus, sistemul potentiometric are o curba logaritmica de raspuns astfel incat poate urmari o
concentratie de peste 100 de ori.
In deceniile ce au urmat, peste 100 de enzime au fost folosite in biosenzori. Cercetatorii in
domeniu au realizat ca nu numai enzimele singulare se pot folosi, ci si tesuturi ce reactioneaza la
aminoacizi si la alte biomolecule importante. De ex, folosirea pulpei de banana pentru masurarea
dopaminei, miezul de porumb pentru piruvat, frunza de castravete pentru cisteina, sfecla de zahar pentru
tirozina, ficatul de iepure pentru guanina si pudra de muschi de iepure pentru monofosfat de adenozina.
Biosenzorii au inceput sa fie folositi cu succes si in alte domenii decat cele medicale. Astfel, Isao
Kurube si Shuichi Suzuki au masurat cerintele biochimie ale oxigenului, ce reprezinta un indiciu al
prezentei materiilor organice in apa uzata.
Biosenzorul, bazat pe drojdie, face o citire a rezultatelor in 30 minute fata de 5 zile in care se obtin
rezultatele prin metode conventionale.
2

Biosenzorii sunt folositi si pentru a determina calitatea hranei si prospetimea ei ( pentru peste,
carne, etc). Cu mare succes sunt folositi in industrie, in procesele industriale, pentru a determina
compozitia chimica a materialelor de-a lungul proceselor. Aceste masuratori sunt importante in special in
biotehnologie, unde in mod curent nu se pot monitoriza culturile de microorganisme procese de
fermentatie ce produc proteine active si alte produse ca interferon sau insulina. [1]

Aplicatii ale biosenzorilor


Principala cerinta pentru un biosenzor este aceea de a fi valoros in acord cu cercetarile si aplicatiile
comerciale: identificarea moleculelor tinta, disponibilitatea recunoasterii elementelor biologice
corespunzatoare si potentialul pentru detectarea posibilitatii sistemelor, sa fie sensibile tehnologiei de
laborator in cateva situatii. [2]
Aplicatiile acestor dispozitive sunt cu atat mai variate cu cat moleculele incorporate sunt mai
variate. Asistenta medicala este cea care beneficiaza imediat de biosenzori, nu numai in testele clinice, dar
si in fabricarea de medicamente si inlocuirea unor organe ca pancreasul artificial pentru diabetici.
Biosenzorii se folosesc de asemenea pentru stabilirea calitatii si sigurantei hranei si detectarea factorilor
de mediu poluanti. Alte cateva exemple se pot aminti: detectarea patogenilor, determinarea nivelelor de
toxicitate inainte si dupa bioremeditare, detectarea si determinarea organofosfatilor, determinarea
metabolitilor toxici cum ar fi micotoxine, etc.

Clasificarea biosenzorilor
Biosenzorii pot fi clasificati:
dupa tipul de agent biologic folosit: biocatalitic (enzime, celule, tesuturi), anticorp (imunosenzor)
sau antigen (fragment de ARN);
dupa tipul traductorului folosit: amperometrice, potentiometrice, conductometrice, calorimetrice,
optice, piezo-electrice, manometrice.;
printr-o combinatie a primelor doua criterii.
dupa analitii sau reactiile pe care le monitorizeaza:
- monitorizare directa a concentratiei analitilor sau a reactiilor care produc sau consuma
analitii;
- monitorizare indirecta care presupune monitorizarea unui inhibitor sau a unui activator al
bioreceptorului.
Un alt tip de clasificare imparte biosenzorii in urmatoarele categorii:
Biosenzori de afinitate. Analitul nu se modifica chimic in timpul masuratorii. El doar se leaga de
receptor. La sfarsit el poate fi indepartat chimic sau prin spalare.
Biosenzori de metabolism. Aici substratul biologic se consuma printr-o reactie chimica cu analitul,
formandu-se un nou produs. Starea initiala se poate reface dupa completa consumare a analitului.
(Exemplu: se doreaste detectarea microorganismului Helycobacter Pylor in substanta purtatoare: suc
gastric. In metabolismul sau, acest microb produce NH 3 (amoniac). Asadar, senzorul nu va detecta
microbul in sine, ci concentratia de amoniac.)
Imunosenzori. Detectarea substantelor de tip antigen (Ag) se face cu ajutorul anticorpilor (Ac), pe
principiul "lacat-cheie". Anticorpii sunt proteine cu molecule in forma de Y (numite imunoglobuline). In
varfurile Y-ului sunt doar doua locuri, unde se poate lega un singur tip de antigen. Aceasti anticorpi sunt
produsi de organism ca raspuns la o anumita substanta straina (antigen), pe care nu o poate elimina prin
fagocitoza si careia, in ultima instanta, ii "incurca planurile", legandu-se de ea: Ac+Ag
AcAg.
Senzori biomimetici. Cu ajutorul acestor senzori se detecteaza semnale fizice (sunet, stres mecanic,
lumina) pe baza interactiunii lor cu substratul biologic activ (receptorul).
3

Atunci cand se face referire la un anumit biosenzor particular (si se doreste identificarea lui exacta)
trebuie precizata clasificarea lui dupa toate criteriile. De exemplu: biosenzor de lactoza IMFET (adica
acest biosenzor este un imunosenzor care are drept traductor un tranzistor cu efect de camp). [3] [4]

Caracterisitici ale biosenzorilor


1.
Selectivitatea. Selectivitatea este probabil cea mai importanta trasatura a unui biosenzor.
Selectivitatea inseamna ca senzorul detecteaza un analizor sigur si nu reactioneaza la amestecari sau cu
contaminanti.
2.
Precizia este o caracteristica al oricarui dispozitiv stiintific care realizeaza masuratori
cantitative.
3.
Stabilitatea semnalului arata semnalul imprastiat sub conditiile constante, care cauzeaza
erori in masurarea concentratiei. Stabilitatea semnalului influenteaza precizia senzorului, este o
caracteristica importanta a unui senzor care executa monitorizari continue.
4.
Sensibilitatea (limita de detectie) arata cantitatea minima (sau concentratia) de analizor
care poate fi detectat.
5.
Distanta de lucru este distanta concentratiilor probelor de analizat cu care senzorul
poate opera. Distanta de lucru a unui senzor trebuie corelata cu distanta concentratiilor posibile a probei
analizate in matrice. De exemplu, concentratia glucozei in sange in mod normal variaza intre 0,2 si 20
mM. Distanta de lucru a senzorului de glucoza nu poate fi mai mica. Daca un senzor nu detecteaza doar
proba de analizat , dar masoara concentratiile probei, distanta liniara este o alta caracteristica importanta.
Distanta liniara este distanta concentratiilor probei in care senzorul raspunde schimbarilor liniare cu
concentratia.
6.
Timpul de raspuns este timpul cerut pentru a analiza matricea.
7.
Timpul de regenerare este timpul cerut de senzor pentru a reveni la stadiul de lucru
dupa interanctia cu proba.
8.
Numarul de cicluri este timpul cerut ca senzorul sa poata opera. Degradarea
materialului biologic este inevitabil si este necesar a fi inlocuit. [2]

Pricinpii de detectie
Fotometrice
Biosenzorii optici bazati pe fenomenul de rezonanta plasmatica de suprafata sunt unde trecatoare
ale tehnicilor. Aceasta utilizand o proprietate cunoscuta a aurului si a altor materiale; specifica pentru un
strat subtire de aur pe o suprafata de sticla cu un indice mare de refractie este posibilitatea de a absorbi
lumina laserului, producand valuri de electroni (suprafata plasmatica). Aceasta se gaseaste numai la
unghiurile specifice si la lungimile de unda a luminii incidente; prezinta o mare dependenta de suprafata
aurului, asemenea legarii probei tinta analizate la un receptor pe suprafata aurului producand un semnal
masurabil.
Senzorii rezonantei plasmatice de suprafata opereaza folosind o parte dintr-un senzor constand
dintr-o caseta de plastic pe un suport de sticla, plat, o parte din acesta fiind invelit cu un strat microscopic
de aur. Aceasta parte contacteaza detectorul optic al instrumentului de masurat. Cealalta parte este apoi
legata cu un sistem de curgere a unui microfluid. Contactul cu sistemul de curgere creaza canale peste care
reactivii pot fi trecuti in solutie. Aceasta parte de sticla a senzorului poate fi modificata in mai multe
moduri, pentru a permite atasarea moleculelor de interes mult mai usor. In mod normal, este acoperita in
carboximetil dextran sau componente similare.
La fixarea unei anumite valori a lungimii de unda, lumina este reflectata asupra partii aurite, la un
unghi al reflectiei interne totale detectat in interiorul instrumentului. Aceasta produce o unda trecatoare
care penetreaza complet sticla si intr-un fel oarecare patrunde in lichidul curgator peste suprafata sticlei.
Indicele de reflactie al partii curgatoare de pe suprafata senzorului are o directa influenta asupra
4

comportamentului luminii reflectate pe partea aurita. Legand-o de partea fluida a senzorului are un efect
asupra indicelui de reflectie si in acest fel, interactiile biologice pot fi masurate la un inalt grad de
sensibilitate cu cateva feluri de energie.
Alti biosenzori optici sunt in principal bazati pe schimbarile de absorbanta sau de fluorescenta a
unui compus indicator convenabil. Peste tot se folosesc unelte de cercetare, micro-matricile fiind
fundamentale pentru un biosenzor
Electrochimice
Biosenzorii electrochimici sunt in mod normal bazati pe cataliza enzimatica a unei reactii care
produce sau consuma electroni (de asemenea enzimele sunt pe drept numite enzime redox). Substratul
senzorului contine de obicei 3 electrozi, un electrod de referinta, un electrod activ si un electrod inclinat.
Un electrod fisa poate fi de asemenea prezent ca si sursa de ioni. Proba de analizat tinta este implicata in
reactii care au loc pe suprafata electrodului activ si ionii produsi isi creaza un potential scazut de la
electrodul de referinta care da semnalul. Se poate masura orice curent ( rata de curgere a electronilor este
proportionala cu concentratia probei de analizat) la un potential fixat sau potentialul poate fi masurat la
curent zero (acest lucru da un raspuns logaritmic). Observatia despre potentialul lucrat sau despre
electrodul activ este spatiul sensibil cerut si acesta este adesea folosit.
Alte exemple, biosenzorii potentiometrici, lucreaza in mod contrar curentului, cunoscandu-li-se
abilitatile. Unii biosenzori sunt o imagine (screenprinted ), insotind un polimer invelit, deschid circuitul
potential al biosenzorilor bazati pe incercarile imunologice ale polimerilor conjugati. Sunt doar doi
electrozi si sunt extrem de sensibili, vigurosi si precisi. Dau posibilitatea detectarii probei de analizat la
nivelele anterioare numai prin folosirea HPLC si LC/MS, fara preparari riguroase de proba. Semnalul este
produs de schimbarile electrochimice sau fizice din comportamentul stratului de polimer datorita
schimbarilor aparute la suprafata senzorului. Asemenea schimbari pot fi atribuite puterii ionice, pH-ului,
hidratarii si a reactiilor redox.
Alte principii de detectie
Senzorii piezoelectrici utilizeaza cristale care suporta o deformatie elastica cand ii este aplicat un
potential electric. Un potential alternativ produce o unda de pozitie intr-un cristal la o frecventa
caracteristica. Aceasta frecventa este mult dependenta de proprietatile elastice ale cristalului, astfel ca
daca cristalul este acoperit cu un element biologic apreciat legatura analizorului tinta la un receptor va
produce o schimbare a frecventei rezonantei, care da un semnal legat. In cazul in care se foloseaste
suprafata undei (SAW), sensibilitatea este foarte mult crescuta. Aceasta este o aplicatie speciala a
cristalului Quartz, echilibrata in biosenzor. [2]

METODE DE DETERMINARE A GLUCOZEI DIN SANGE CU AJUTORUL BIOSENZORILOR


Senzorii de glucoza reprezinta un mare interes datorita faptului ca unul din cei mai importanti
parametrii care sunt verificati in cadrul analizelor medicale de rutina este continutul de glucoza. Acesti
senzori au fost de asemenea folositi si pentru masurarea glucozei din alte fluide biologice, si in procesele
de fermentatie.
Determinarea glucozei din sange cu ajutorul biosenzorilor este de mare importanta in analizele
clinice pentru cel putin trei motive:
este permisa o scurtare a intregii proceduri analitice pentru determinare, datorita
eliminarii consumului de timp necesar separarii celulelor de sange si plasma;
5

este o nevoie binecunoscuta pentru monitorizarea glucozei bolnavilor critici si a


clientelei chirurgicale;
designul unor astfel de senzori poate conduce direct la dezvoltarea unui senzor
implantat in vivo folosit la inchiderea lantului de infuzii de insulina.
Determinarea glucozei din sange reprezinta numeroase dificultati in comparatie cu determinarea
glucozei din limfa:
- glucoza masurata in intreg sangele este 12-20 % , mai putin decat cea din limfa.
- scaderea rapida a concentratiei de glucoza din proba de sange neconservata, datorita actiunii
glicolitice a eritrocitelor si a leucocitelor
Determinarea nivelului de glucoza din sange se poate realiza folosind 3 mari metode:
utilizarea enzimei glucozoxidaza;
utilizarea enzimei peroxidaza;
metoda elecrochimica.
DETERMINAREA NIVELULUI DE GLUCOZA DIN SANGE FOLOSIND GLUCOZOXIDAZA:
Capacitatea glucozoxidazei de a cataliza oxidarea glucozei la acid gluconic a fost intens promovata
ca un model de sistem pentru obtinerea senzorilor de glucoza. Enzima prezinta o activitate ridicata, este
relativ stabila, accesibila, iar din aceste motive este intens utilizata pentru obtinerea de biosenzori
electrochimici si optici. Un lucru important de care trebuie sa se tina seama in dezvoltarea acestor
dispozitive il reprezinta imbunatatirea metodei de imobilizare. S-au studiat diferite metode, cum ar fi
adsorptia fizica, legatura covalenta, cross linking si electropolimerizarea.
Aceasta metoda de determinare a nivelului de glucoza din sange bazata pe utilizarea
glucozoxidazei se poate realiza in mai multe variante:
a) Metoda chemiluminescentei este una din variantele de determinare a glucozei din sange
folosind glocozoxidaza.
Aceaste metoda se bazeaza pe diferenta de intensitate a chemiluminescentei luminolului in functie
de cantitatea de apa oxigenata rezultata in urma reactiei catalizata de glucozoxidaza. S-a realizat o
imobilizare a glucozoxidazei pe picaturi (margele) de sticla de aminopropil si a fost masurata
chemiluminescenta cu ajutorul unei legaturi cu o fibra optica.
Principiul determinarii glucozei prin metoda enzimatica se bazeaza pe masurarea peroxidului de
hidrogen (apei oxigenate) rezultat in urma reactiei de oxidare a glucozei in prezenta oxigenului molecular
(1):

-D-glucoza + O2 + H2O glucozoxidaza

acid gluconic +H2O2

(1)

Determinarea amperometrica a peroxidului de hidrogen rezultat in urma reactiei de oxidare a fost


intens studiata. O alta metoda dezvoltata pentru determinarea peroxidului de hidrogen rezultat in urma
reactiei enzimatice o reprezinta masurarea diferentei de semnal de chemiluminescenta in functie de
continutul de peroxid de hidrogen.
Cel mai folosit agent chemiluminogenic il reprezinta luminolul (3- aminophthalhydrazide). Asa
cum rezulta din ecuatia (2), luminolul reactioneaza cu peroxidul de hidrogen rezultat in urma reactiei
enzimatice a glucozei, si duce la obtinerea de chemiluminescenta. Spectrul de chemiluminescenta arata o
lungime de unda larga, a carei intensitate maxima este la 425 nm.
Catalizator

OH-

2H2O2 + luminol

3-aminophthalte + N2 + lumina

(2)

In mod cert, intensitatea chemiluminescentei luminolului este direct proportionala cu concentratia


de peroxid, de catalizator sau de luminol. Ionii metalelor de tranzitie, cum sunt Co2+, Cu2+ si Fe3+ sau
diverse complexe de metal sunt folosite drept catalizatori. Metoda chemiluminescentei este in special
folosita pentru determinarea de peroxid datorita limitei de detectie scazute, sensibilitatii inalte,
selectivitatii ridicate, usurinta folosirii si a instrumentatiei ieftine. In ultimul timp, cablurile de fibra
optica au fost intens folosite pentru masurarea intensitatii luminii.
Aparatura:
O schema de principiu a analizorului automat de injectie cu debit oprit este redata in fig.1 . Acest
sistem de curgere este format din doua pompe peristaltice: una (P1) livreaza o solutie de reactiv
chemiluminogenic (R1)si 1,0x10-1 M solutie tampon (pH 12 , R2), iar cealalta (P2) livreaza o proba de
solutie (R3) si 1,0x10-1M solutie tampon fosfata (pH7, R4). Cele doua componente sunt amestecate, iar
amestecul este trimis intr-o coloana de imobilizare a enzimei glucozoxidaza. Solutia trecand prin reactorul
de enzima a fost amestecata cu mixul P1. Tubul PTFE (0,8 mm) este folosit pentru a conecta toate
componentele acestui sistem.
Pentru masurarea intensitatii chemiluminescentei s-a folosit un fotomultiplicator electronic, a carui
tensiune era de 850 V. Intensitatea chemiluminescentei la 424 nm a fost monitorizata pentru determinarea
glucozei.
Pregatirea enzimei:
Dupa ce 2 g de picaturi (margele) de sticla de aminopropil au fost amestecate cu 30 ml de solutie
tampon de fosfat de pH 7 care continea 2,5% glutaraldehida, amestecul a fost agitat timp de 5 ore la
temperatura camerei. Margelele sunt apoi filtrate si spalate cu solutie tampon de fosfat. Margelele
rezultate sunt amestecate cu 10 ml de solutie tampon de acetat cu pH 5,6 care contine 5g de
glucozoxidaza, iar mixul a fost apoi incubat timp de 5 ore la 4 0C sub agitare continua. Margelele de
enzima imobilizata sunt filtrate si introduse intr-o coloana de sticla de 70 mm. Ambele capete ale coloanei
au fost inchise cu vata de sticla.
Procedeul de masurare:
Proba de sange colectata dintr-un vas de sange uman a fost diluata cu 1,0x10 -1M solutie tampon de
fosfat de sodiu (pH7) care continea 5.0x10-2M NaF, 2.0x10-1M NaCl si 3.5x10-3M EDTA. S-a preparat o
solutie stoc de glucoza 500mM prin dizolvarea D(+)-glucozei intr-o solutie tampon care continea aceleasi
ingrediente ca si cele folosite in cazul probei de sange. Solutia stoc a fost pastrata intr-un vas de sticla
inchis la culoare, la 4 0C. Solutia standard a fost preparata proaspat prin realizarea unor dilutii apropiate de
solutia stoc cu ajutorul unei solutii tampon care continea aceleasi ingrediente ca si cea utilizata la
obtinerea solutiei stoc. O solutie de reactiv chemiluminogenic care continea 1.0x10 -3M luminol si 1.0x10-2
M ferocianura a fost de asemenea folosita.
Proba si solutia tampon de fosfat au fost pompate cu un debit de 3,8ml/min. Solutia tampon de bor
si reactivul chemiluminogenic au fost pompate cu un debit de 2,5ml/min. Intervalele de timp pentru
preluarea datelor si spalarea cu proba martor sunt de 100 si respectiv 150s.
In fig.2. este prezentat spectrul obtinut pentru lungimea de unda de 424nm. Sunt observati 2 picuri
la lungimi de unda de 298 si 358 nm. Intensitatea corecta a spectrului obtinut la 298 nm pentru solutia
proba este aratata in fig. 3(a). In fig. 3(b) este prezentat spectrul inregistrat pentru solutia care continea
solutie tampon, reactiv chemiluminogenic si peroxid de hidrogen.
Rezultatele indica faptul ca glucoza poate fi determinata prin masurarea modificarii intensitatii
chemiluminescentei datorita continutului diferit de peroxid de hidrogen rezultat in urma reactiei
enzimatice a glucozei.

Fig.1.

Fig.2.

Fig.1. Schema de principiu a analizorului cu debit oprit pentru determinarea glucozei prin metoda
chemiluminescentei. R1=solutie de reactic chemiluminogenic; R2=solutie tampon de borat; R3=curentul probei; R4=solutie
tampon de fosfat; P1 si P2=pompe peristaltice; E=reactorul de glucozoxidaza; FC=celula de curgere; MS=agitator magnetic;
OF=legatura de fibre optice bifurcate; D=detector; W=reziduu.
Fig.2. Spectrul pentru solutia de reactiv chemiluminogenic obtinut prin folosirea analizorului cu debit oprit (luminol)
1.010-3 M; [Fe(CN)6 -3], 1.010-2 M; em, 412 nm.

Fig.3.

Fig.4.

Fig.3. Spectrul solutiei de reactiv chemiluminogenic (a) si spectrul chemiluminescentei sistemului luminol-Fe(III)H2O2 obtinut prin folosirea analizorului cu debit oprit (b).
Fig.4. Efectul pH-ului asupra intensitatii chemiluminescentei pentru glucozoxidaza.

Efectul pH-ului asupra intensitatii:


S-a studiat efectul pH-ului intre valorile 5-8 asupra glucozoxidazei prin masurarea intensitatii
chemiluminescentei emisa pentru lungimea de unda de 424 nm. S-a observat ca are loc o crestere a
intensitatii pe masura ce creste si pH-ul, pana la valoarea de 7, dupa care, intensitatea scade (fig.4).
Efectul temperaturii:
Performantele enzimei sunt direct influentate de temperatura. S-au studiat efectele temperaturii
asupra intensitatii chemiluminescentei in intervalul 15-45 0C. Rezultatele arata faptul ca dupa 350C are loc,
probabil, o denaturare a enzimei, motiv pentru care s-a luat ca temperatura de lucru valoarea de 25 0C
pentru aceasta metoda de determinare a glucozei.
Curba de calibrare a glucozei:
Pentru calibrare s-a folosit media inaltimii picurilor a 3 semnale succesive de chemiluminescenta
obtinute in conditii optime experimentale pentru fiecare solutie standard de glucoza. O masurare completa
dureaza mai putin de 5 minute. Figura 7 prezinta o curba obisnuita de calibrare pentru concentratii diferite
de glucoza de pana la 12 mM.
8

Stabilitatea enzimei folosita pentru determinarea glucozei a fost investigata prin realizarea a 20 de
injectii succesive cu 5.0x10-1mM de solutie standard de glucoza, o data la trei zile, timp de 2 luni. Pentru
primele 15 masuratori, intensitatea chemiluminescentei varia cu 5,8%. Pentru ultimele 5 masuratori,
semnalul a scazut considerabil, avand un coeficient de variatie de 11%.

Fig.5.

Tabel.1.

Fig.5. Curba de calibrare a glucozei obtinuta prin metoda chemiluminescentei.


Tabel 1. Rezultate analitice ale glucozei in probe de sange uman, obtinute prin metoda chemiluminescentei.

Analizarea sangelui uman:


Aceasta metoda a fost aplicata pentru determinarea glucozei din sangele uman. Au fost analizate
10 probe de sange folosind aceleasi conditii experimentale ca si in cazul curbei de calibrare, iar rezultatele
au fost comparate cu datele obtinute prin metode clinice oficiale. Rezultatele sunt prezentate in tabelul 1.
S-au obtinut rezultate satisfacatoare intre cele doua rezultate, cu exceptia probelor 4 si 5.
Acuratetea metodei a fost imbunatatita prin refacerea experimentelor. La fiecare din cele doua probe li sau adaugat o cantitate de glucoza, iar apoi au fost analizate. Rezultatele sunt prezentate in tabelul 2;
acestea indica faptul ca aceasta metoda poate determina cu succes continutul de glucoza din probele de
sange uman[5].
Tabel 2. Rezultate obtinute in urma adaugarii de glucoza in probele de sange:

b) Metoda biosenzorilor cu membrana externa folosita pentru determinarea glucozei din


limfa si din intreg sangele, nediluat. Aceasta metoda se bazeaza pe folosirea unei membrane externe de
polipropilena umeda in combinatie cu diversi eteri ai polixietilenei.
In toate studiile s-a pus o mare atentie asupra optimizarii membranelor exterioare a biosenzorilor
folositi in analizele complete de sange. Folosirea ionomerului perfluorinat Nafion ca si membrana dialitica
exterioara produce un mult mai bun biosenzor decat cel care foloseste membrane celulozice. Rezultate
bune au fost de asemenea raportate pentru folosirea membranei policarbonate. Cand microporii
membranei policarbonate sunt tratati cu lichid izopropil miristic, linearitatea raspunsului la glucoza a fost
bine extinsa deasupra substratului fiziologic limita.
Aparatura masuratorile voltmetrice au fost indeplinite folosind un voltamograf tip CV-37 din
Sistemul Bioanalitic (SUA) conectat la o banda (diagrama) de inregistrare.
Designul biosenzorului masurand celula este prezentat in fig.1. Biosenzorul cuprinde 2 bile din
poxiglas montate impreuna folosind 4 asuruburi. In partea A este prevazut cu un electrod de argint (1)
acoperit cu clorura de argint, care serveaste drept electrod de referinta. In aceeasi parte, intrarea in
9

vizuina pentru introducerea probei se realizeaza cu o pipeta automata si un debuaseu capilar din otel
inoxidabil (2), care este un electrod auxiliar.
Fig. 1 : Diagrama schematica a biosenzorului detector de glucoza:
1-biela de Ag cu suprafata sensibila, acoperita cu AgCl; 2-capilar
din otel inoxidabil; 3-cauciuc in forma de cerc; 4-electrod de
Ag/AgCl; 5-disc de platina; 6-orificiu pentru introducerea probelor.

In partea B, un disc de platina de 2 mm diametru


a fost aranjat precum Ag/clorura de argint in cerc, la 1 mm departare si 7 mm diametru (4), care poate fi
folosit ca o alternativa pentru electrodul de referinta. Suprafata discului de platina a fost slefuit cu 3 grade
diferite de pudra de alumina (1, 0.5 asi 0,03 m); a fost spalat cu apa distilata si metanol si apoi curatat
electrochimic 10 minute intr-o baie fosfat alcalina fierbinte, cu o polaritate alcalina intre +5 asi -5 V. Dupa
o atenta spalare si uscare la temperatura camerei, 8 l de solutie Nafion este plasata pe suprafata
electrodului si lasata pentru o ora sa se evapore. Stratul de Nafion a fost acoperit cu o membrana poliester
ce contine glucozoxidaza (GOD) imobilizata si o membrana exterioara protectoare. Masurarea glucozei se
realizeaza la + 0,65 V in prezenta Ag/AgCl.
Reactivi
In toate masuratorile, au fost folosite diferite loturi de glucozoxidaza tip X-S cat. G-7141 de la
Sigma are activitati specifice de la 117 la 138 unitati / mg. Pentru imobilizarea enzimei pe o membrana de
poliester (PE 04 UM )cu o dimensiune a porilor de 0,4 m a fost aplicata 50 % din solutia apoasa de
glutaraldehida.
A fost preparata o cantitate de 20 mM glucoza in solutie fosfat tampon cu NaCl dizolvand 3,60 g
glucoza analitica asi 9,19 g NaCl intr-un litru de solutie fosfat tampon, de 0,05 M, la pH = 7,1. Cantitatea
de solutie stoc este filtrata folosind ca filtru nylon de 0,45 m si colectata intr-un vas inchis la culoare la
4C. Solutia stoc a fost preparata cu cel putin 24 ore inainte de folosire. Solutia standard folosita pentru
determinare este proaspat preparata cu o dilutie apropiata de solutia stoc cu solutie fosfat tampon 0,05 M
la pH = 7,1 continand 8,19 g/l NaCl.
Solutia stoc tampon fosfat la 0,5 M a fost preparata prin dizolvarea a 78,0 g NaH 2PO4 . 2H2O in
700 ml apa distilata. Dupa ajustarea pH-ului la 7,1, se adauga 1 l apa distilata dupa care solutia este
filtrata.
Procedura pentru determinarea glucozei din sange
Probele cu sange uman au fost colectate in microtuburi fluorinate sau heparinizate. Masuratorile
amperimetrice au fost executate folosind un volum de 100 l proba nu mai tarziu de 45 minute, de cand
probele au fost colectate de la pacienti. Inainte de introducerea probelor, detectorul a fost spalat cu 0,5 ml
din solutia fosfat la pH = 7,1 continand 0,14 M NaCl. O parte din fiecare proba a fost centrifugata iar
glucoza din limfa obtinuta a fost determinata folosind analizatori clinici comerciali.
Determinarea glucozei din limfa
Designul integrat al biosenzorului de glucoza cu disc de platina folosit ca electrod functional si
membrana tristratificata a fost optimizat la inceputul masuratorilor rezultate din injectii. Designul
biosenzorului detector folosit in aceste studii are aceeasi structura ca partea sensibila, prezentata in fig. 1.
In masuratorile prealabile pentru determinarea glucozei din limfa, o membrana din poliester Nucleopore
(0,4 m)a fost folosita ca si o membrana exterioara de protectie. Pentru o concentratie in glucoza mai
mare de 5 M cu un detector avand 50 l volum mort al compartimentelor masurate, un semnal cert se
obtine dupa 1,5 minute.
Stabilitatea functionarii dezvoltarii biosenzorului observat mai devreme in masuratorile injectiilor
lichide a fost de asemenea confirmat intrt-o discreta masuratoare a sarjei. A fost testata pentru orice
depozitare a detectorului intre masuratorile din refrigerator sau pentru folosirea constanta si pastrarea la
10

temperatura camerei. Tabelul 1 arata rezultatele obtinute pe parcursul a 10 saptamini, in care intreg
detectorul a fost tinut la 4 C intre determinari. Pe durata procedurii de testare detectorul a fost folosit
pentru determinarea glucozei din limfa diluata 1:10 cu fosfat tampon.
Mici fluctuatii in valorile observate ale
semnalului pot fi atribuite partial la minim tuturor
determinarilor care au dus la bun sfarsit sub conditiile
ne-termostatate.
Detectorul tinut la temeratura
camerei arata o crestere a semnalului cu aproximativ
10 % dupa 2 saptamani.
Un studiu implica precizia unei determinari
discrete a glucozei dusa la bun sfarsit pentru controlul
probelor de limfa diluate 1:10 cu fosfat tampon.
Obtinerea valorii RSD (de la 2,1 la 2,3 %) a
Fig. 2: Stabilitatea raspunsului amperometric a
biosenzorului de glucoza cu o membrana externa de
fost cea mai rea din toate observatiile, care poate fi in
poliester Nucleopore folosita pentru determinarea
mod cert atribuita tuturor determinarilor realizate
sensibila a glucozei din limfa, stocata intr-un
manual.
refrigerator intre probe.
Pentru determinarile practice, dilutia 1:10 probelor cu limfa cu 0,1 M fosfat tampon la pH=7,1 si
citirea semnalului au fost inregistrate dupa 90 s. Inainte de introducerea probelor, masurarea
compartimentelor detectorului au fost spalate cu 0,5 ml apa distilata. Probele cu limfa recoltate proaspat
au fost simultan analizate folosind Analizorul de glucoza Beckman 2 sau Kone progress. Corelatiile
sarjelor obtinute pentru 2 serii ale probelor naturale folosite pentru compararea cu analizele comerciale
sunt prezentate in fig. 2.

Fig.3: Corelarea loturilor obtinute pentru determinarea glucozei din limfa si Analizorul de glucoza Beckman 2 (A) si
Analizorul Kone Progress (B).

Optimizarea membranei externe pentru masurarea intregii cantitati de sange nediluat


Importanta folosirii membranei externe protectoare in designul biosenzorului pentru determinarea
glucozei in tot sangele a fost deja prevazuta de mult timp. Retezarea speciilor macromoleculare si
reducerea ritmului de transport a interferentei oxidabile amelioreaza exactitatea ambelor determinari si
durata de viata a biosenzorului.
Folosirea de membrana macroporoasa de poliester Nucleopore PE 04UM produce rezultate
satisfacatoare pentru determinarea glucozei din limfa in oricare dintre determinari, lichide sau nelichide.
Oricum, din cauza unui complex mare de matrici din intreg singele pentru acelasi exemplar, au fost
examinate mai multe diferente a membranelor. In aceste teste comparatia dintre rezultatele obtinute pentru
intreg singele nediluat cu toate cele obtinute pentru aceeasi proba cu sange intreg nediluat la o diferenta
proportionala cu solutia tampon de fostat facuta. Au fost examinate profilul schimbarii semnalului in timp
11

si rezultatele determinarilor in corelatie cu rezultatele determinarilor obtinute din limfa cu glucoza


comerciala.
Un biosenzor are o membrana externa de poliester, privind satisfacator configuratia pentru
analizele de limfa, se expune mai putin favorabil schimbarilor de semnal cand se aplica pentru analizele
din singe (Fig. 3).
Fig. 4: nregistrarile obtinute pentru determinarea glucozei in
probele cu sange nediluat (A-J) folosind un biosenzor optimizat
de glucoza standardizat cu 7,4 (1) i 3,7 (2) mM soultie apoasa
de glucoza. [6]

Fig. 3: Raspunsul biosenzorului de glucoza avand o


membrana poliester Nucleopore tip PE 04UM si
electrod de referinta Ag/AgCl. Solutiile standard de
glucoza: 0,5 (1), 1,0 (2) si 2,0 (3). Probele cu sange
diluat: 1:5 (A), 1:2,5 (B) si nediluat (C).

Comparand cu analizele din limfa pentru ambele probe de singe, diluate si nediluate, observarea
schimbarilor de semnal expune cu certitudine magnitutidea maxima de semnal intre 10-20 s dupa
introducerea probei si apoi arata o scadere a magnitudinii semnalului (curba A-C din Fig. 3). Natura
imaginilor prezentate in Fig. 3 si 4 cand o solutie standard sau o proba sunt schimbate cu o solutie de
spalare nu a fost investigata, de cind aceasta nu a intervenit cu o estimare a unui rezultat analitic.
Mai precis, se pare ca acest lucru este cauzat de atacul si ne-atacul procesului, raportat anterior de
catre oxido-reducerea electroactiva a suprafetei functionale, sugerata pentru un electrod de carbon sticlos.
B. DETERMINAREA NIVELULUI DE GLUCOZA DIN SANGE FOLOSIND PEROXIDAZA:
Peroxidaza catalizeaza reactia dintre peroxidul de hidrogen cu 3-metil-2-benzotiazolin hidrazina
(MBTH) si cu acidul 3-dimetilaminobenzoic (DMAB)
Sarea acidului naftalensulfonic inlocuieste DMAB.
C6H12O6 + O2

GOD

H2O2 + MBTH + DMAB

acid gluconic + H2O2


peroxidaza MBTH-DMAB (albastru)

C. DETERMINAREA GLUCOZEI FOLOSIND METODA ELECTROCHIMICA:


Detectarea electrochimica care foloseste un potential fix functioneaza foarte bine cu molecule
pentru care produsii de transfer ai electronilor sunt stabilizati prin localizarea cu ajutorul unui system
conjugat . O astfel de stabilitate nu este posibila pentru glucoza, motiv pentru care cei trei radicali
formati in urma reactiei de reducere sau oxidare au o energie ridicata; astfel ca procesele prezinta o
energie de activare ridicata. De aceea este necesara o supratensiune mare, care reprezinta un dezavantaj
12

pentru detectarea electrochimica. Oxidarea catalitica la un potential moderal cu electrod de platina sau de
aur este posibila cu ajutorul unui mecanism care implica adsorbtia glucozei pe suprafata unul electrod
curat. (fig.1.). Din
pacate, produsii acestei oxidari catalitice pot ramane adsorbiti pe suprafata
electrodului, blocand situs-urile catalitice si impiedica urmatoarele oxidari. In mod normal,
comportamentul glucozei pe electodul de platina sau de aur la un potential fix este caracterizat de o
scadere a activitatii electrozilor.(fig.2.).
Efectele negative ale adsorbtiei pot fi anulate si activitatea catalitica a suprafetei electrodului poate fi
refacuta printr-un proces de curatare in doua etape dupa etapa de detectare.(fig3.). Primul pas este la un
potential mai pozitiv decat cel folosit pentru detectie, iar cel de-al doilea pas, la un potential mai negativ.
Efectele acestor potentiali pot fi intelese prin examinarea rotirii discului voltamogram al electrodului de
aur in hidroxid de sodiu 0.1M in absenta (a) si in prezenta glucozei (b). (fig.4.). In absenta glucozei sunt 2
mari caracteristici in rotirea discului voltamogram. Curentul anodic, reprezentat in figura cu litera A, apare
datorita formarii la suprafata a unui strat de oxid , iar curentul catodic, reprezentat cu C, apare datorita
dizolvarii acestui strat. Aditia de glucoza conduce la o crestere insemnata a curentului anodic de la E la F
datorita oxidarii unor grupuri de aldehide si alcooli pe suprafata electrodului gol. Curentul pentru aceste
oxidari catalitice este micsorat la potential mai pozitive din moment ce formarea stratului de oxid
blocheaza situs-urile active de pe suprafata electrodului. Oricum, curentul G este inca mare in prezenta
glucozei datorita desorbtiei oxidative a produsilor de oxidare adsorbiti. Dizolvarea stratului de oxid
permite reinceperea catalizei enzimatice, lucru care este aratat de curentul oxidativ H.

Fig.1. Reprezentarea schematica a oxidarii catalitice a


glucozei cu un electrod de platina sau aur

Fig.3. Forma valului de potential pentru PAD

Fig.2. Comparatie PAD si detectarea la potential


constant a unei solutii ce contine 30 ppm Lys, 10 ppm
glucoza si 40 ppm sucroza

Fig.4.Rotirea discului voltamogram al electrodului de aur


in hidroxid de sodiu 0.1M in absenta (a) si in prezenta
glucozei (b).

13

Potentialul optim de detectie pentru glucoza este in regiunea de potential in care nu are loc formarea
de oxid si nici reducerea oxigenului (reducerea oxigenului are loc la potentiale mai mici de -0,1V).
Produsii de oxidare adsorbiti care rezulta din aceasta oxidare catalitica pot fi eliberati oxidativ prin
aplicarea unui potential mai mare. Oricum, aplicarea acestui potential conduce la formarea unui strat
oxitativ, care conduce la pasivizarea suprafetei. Activitatea catalitica a suprafetei electrodului se reface
prin aplicarea unui potential mai mic, producand dizolvarea stratului de oxid. Detectarea glucozei (si a
altor zaharuri) folosind acest val de potential triplu-impuls se refera la Detectarea Amperometrica a
Impulsului (Pulse Amperometric Detection) sau la Detectarea Electrochimica a Impulsului (Pulsed
Electrochemical Detection). Eficacitatea lui PAD este ilistrata in figura 2, care compara reproducerea
cromatogramei folosind PAD (a) si un potential constant de detectie (b). Se poate vedea ca picurii
curentilor in cazul detectiei la potential constant scad odata cu timpul, in timp ce pentru PAD raman
constanti.
Oxidarea catalitica a glucozei a fost incercata si prin modificarea electrozilor cu sari de cupru sau cu
metal de cupru. Potentialul optim pentru detectarea glucozei este independent de metoda folosita pentru
fabricarea electrodului de cupru, care sugereaza existenta unui mecanism comun. Un avantaj major al
electrozilor de cupru este faptul ca produsii oxidarii nu sunt adsorbiti.
Oxidarile catalitice mentionate mai sus sunt
specifice doar pentru grupari functionale apropiate.
Altfel, nu se realizeaza o separare (discriminare) intre
glucoza si alte zaharuri, sau intre alcooli inerenti in
PAD, fiind necesara o separare cromatografica.
In consecinta, nu este necesara realizarea unui
val de potential de puls , ci poate fi folosit un
potential constant.(fig.5).

Fig.5. Cromatograma unui suc de grapefruit

14

BIBLIOGRAFIE

[1]. http://www.csc.matco.ro/biosenzo1.html
[2]. http://en.wikipedia.org/wiki/Biosensor
[3]. http://www.tesionline.com/intl/preview.jsp?idt=16222
[4].http://209.85.135.104/search?
q=cache:AfPJhyDv62AJ:arh.pub.ro/cravariu/Biodispozitive.doc+biosenzori+pentru+detectarea+glucozei
&hl=ro&ct=clnk&cd=2&gl=ro&client=firefox-a
[5].http://209.85.135.104/search?
q=cache:xeJjEu8xcgJ:newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_search/j_download.htm%3Fcode
%3DK010305+biosensor+for+glucose+determination+from+blood&hl=ro&ct=clnk&cd=67&gl=ro
[6].http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php?
cdjournal=analsci1985&cdvol=10&noissue=3&startpage=423&lang=en&from=jnlabstract
[7]. http://www.currentseparations.com/issues/17-1/cs17-1d.pdf

15