Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
2008
Definitia biosenzorilor
Biosenzorii sunt detectori ce se bazeaza pe molecule selective ce intra in componenta plantelor si
animalelor. Biosenzorii moderni au evoluat din combinarea a doua discipline separate: tehnologia
informationala, (microcircuite si fibre optice, procesare numerica a datelor, teoria generala a sistemelor cu
comportare neliniara) si biologia moleculara. Prima furnizeaza electrozi miniaturali sau senzori optici,
tehnica de preluare si procesare a informatiei iar a doua, pune la dispozitie biomolecule care recunosc o
substanta tinta.
Istoria biosenzorilor
In 1950 Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod destinat a fi folosit pentru masurarea oxigenului
dizolvat in sangele bolnavilor operati. Acesta este format dintr-un electrod de platina si un electrod cu o
membrana de plastic permeabila la gaze. Polaritatea electrodului a fost astfel stabilita incat intensitatea
curentului prin circuit sa depinda de viteza de difuzie a oxigenului prin membrana, viteza ce este direct
proportionala cu concentratia externa a oxigenului.
In 1962 Clark extinde folosirea acestui "electrod de masurare a oxigenului" la determinarea
nivelului de glocoza in sange. El a imbracat senzorul pentru oxigen cu un strat subtire de gel ce contine un
biocatalizator, enzima numita gluco-oxidaza, urmat de o membrana semipermeabila de dializa ce permite
glucozei sa difuzeze in senzor, dar opreste enzima sa difuzeze afara. Cu cat intra mai multa glucoza, cu
atat mai mult oxigen este consumat de enzima. Deci, o cantitate mica de oxigen existenta se traduce prin
existenta unui nivel ridicat de glucoza.
In 1969, G.Guilbault a inventat un sistem de masura a ureei in fluidele corpului. Dispozitivul lui
foloseste o enzima, ureaza, ce converteste urea in bioxid de carbon si amoniac. Electrodul sesizeaza
schimbarile in concentratia ionilor de amoniu. Acest dispozitiv a constituit o imbunatatire pentru ca se
bazeaza pe o detectie potentiometrica (un fel de senzor potentiometric), o tehnica ce de atunci a fost
folosita foarte mult. In timp ce senzorii lui Clark masoara trecerea curentului prin electrod, senzorul
potentiometric masoara tensiunea ceruta pentru mentinerea curentului la zero. Electrodul nu consuma nici
un fel de reactanti de aceea este mai putin susceptibil la erori cauzate de schimbarile survenite in mediul
extern. In plus, sistemul potentiometric are o curba logaritmica de raspuns astfel incat poate urmari o
concentratie de peste 100 de ori.
In deceniile ce au urmat, peste 100 de enzime au fost folosite in biosenzori. Cercetatorii in
domeniu au realizat ca nu numai enzimele singulare se pot folosi, ci si tesuturi ce reactioneaza la
aminoacizi si la alte biomolecule importante. De ex, folosirea pulpei de banana pentru masurarea
dopaminei, miezul de porumb pentru piruvat, frunza de castravete pentru cisteina, sfecla de zahar pentru
tirozina, ficatul de iepure pentru guanina si pudra de muschi de iepure pentru monofosfat de adenozina.
Biosenzorii au inceput sa fie folositi cu succes si in alte domenii decat cele medicale. Astfel, Isao
Kurube si Shuichi Suzuki au masurat cerintele biochimie ale oxigenului, ce reprezinta un indiciu al
prezentei materiilor organice in apa uzata.
Biosenzorul, bazat pe drojdie, face o citire a rezultatelor in 30 minute fata de 5 zile in care se obtin
rezultatele prin metode conventionale.
2
Biosenzorii sunt folositi si pentru a determina calitatea hranei si prospetimea ei ( pentru peste,
carne, etc). Cu mare succes sunt folositi in industrie, in procesele industriale, pentru a determina
compozitia chimica a materialelor de-a lungul proceselor. Aceste masuratori sunt importante in special in
biotehnologie, unde in mod curent nu se pot monitoriza culturile de microorganisme procese de
fermentatie ce produc proteine active si alte produse ca interferon sau insulina. [1]
Clasificarea biosenzorilor
Biosenzorii pot fi clasificati:
dupa tipul de agent biologic folosit: biocatalitic (enzime, celule, tesuturi), anticorp (imunosenzor)
sau antigen (fragment de ARN);
dupa tipul traductorului folosit: amperometrice, potentiometrice, conductometrice, calorimetrice,
optice, piezo-electrice, manometrice.;
printr-o combinatie a primelor doua criterii.
dupa analitii sau reactiile pe care le monitorizeaza:
- monitorizare directa a concentratiei analitilor sau a reactiilor care produc sau consuma
analitii;
- monitorizare indirecta care presupune monitorizarea unui inhibitor sau a unui activator al
bioreceptorului.
Un alt tip de clasificare imparte biosenzorii in urmatoarele categorii:
Biosenzori de afinitate. Analitul nu se modifica chimic in timpul masuratorii. El doar se leaga de
receptor. La sfarsit el poate fi indepartat chimic sau prin spalare.
Biosenzori de metabolism. Aici substratul biologic se consuma printr-o reactie chimica cu analitul,
formandu-se un nou produs. Starea initiala se poate reface dupa completa consumare a analitului.
(Exemplu: se doreaste detectarea microorganismului Helycobacter Pylor in substanta purtatoare: suc
gastric. In metabolismul sau, acest microb produce NH 3 (amoniac). Asadar, senzorul nu va detecta
microbul in sine, ci concentratia de amoniac.)
Imunosenzori. Detectarea substantelor de tip antigen (Ag) se face cu ajutorul anticorpilor (Ac), pe
principiul "lacat-cheie". Anticorpii sunt proteine cu molecule in forma de Y (numite imunoglobuline). In
varfurile Y-ului sunt doar doua locuri, unde se poate lega un singur tip de antigen. Aceasti anticorpi sunt
produsi de organism ca raspuns la o anumita substanta straina (antigen), pe care nu o poate elimina prin
fagocitoza si careia, in ultima instanta, ii "incurca planurile", legandu-se de ea: Ac+Ag
AcAg.
Senzori biomimetici. Cu ajutorul acestor senzori se detecteaza semnale fizice (sunet, stres mecanic,
lumina) pe baza interactiunii lor cu substratul biologic activ (receptorul).
3
Atunci cand se face referire la un anumit biosenzor particular (si se doreste identificarea lui exacta)
trebuie precizata clasificarea lui dupa toate criteriile. De exemplu: biosenzor de lactoza IMFET (adica
acest biosenzor este un imunosenzor care are drept traductor un tranzistor cu efect de camp). [3] [4]
Pricinpii de detectie
Fotometrice
Biosenzorii optici bazati pe fenomenul de rezonanta plasmatica de suprafata sunt unde trecatoare
ale tehnicilor. Aceasta utilizand o proprietate cunoscuta a aurului si a altor materiale; specifica pentru un
strat subtire de aur pe o suprafata de sticla cu un indice mare de refractie este posibilitatea de a absorbi
lumina laserului, producand valuri de electroni (suprafata plasmatica). Aceasta se gaseaste numai la
unghiurile specifice si la lungimile de unda a luminii incidente; prezinta o mare dependenta de suprafata
aurului, asemenea legarii probei tinta analizate la un receptor pe suprafata aurului producand un semnal
masurabil.
Senzorii rezonantei plasmatice de suprafata opereaza folosind o parte dintr-un senzor constand
dintr-o caseta de plastic pe un suport de sticla, plat, o parte din acesta fiind invelit cu un strat microscopic
de aur. Aceasta parte contacteaza detectorul optic al instrumentului de masurat. Cealalta parte este apoi
legata cu un sistem de curgere a unui microfluid. Contactul cu sistemul de curgere creaza canale peste care
reactivii pot fi trecuti in solutie. Aceasta parte de sticla a senzorului poate fi modificata in mai multe
moduri, pentru a permite atasarea moleculelor de interes mult mai usor. In mod normal, este acoperita in
carboximetil dextran sau componente similare.
La fixarea unei anumite valori a lungimii de unda, lumina este reflectata asupra partii aurite, la un
unghi al reflectiei interne totale detectat in interiorul instrumentului. Aceasta produce o unda trecatoare
care penetreaza complet sticla si intr-un fel oarecare patrunde in lichidul curgator peste suprafata sticlei.
Indicele de reflactie al partii curgatoare de pe suprafata senzorului are o directa influenta asupra
4
comportamentului luminii reflectate pe partea aurita. Legand-o de partea fluida a senzorului are un efect
asupra indicelui de reflectie si in acest fel, interactiile biologice pot fi masurate la un inalt grad de
sensibilitate cu cateva feluri de energie.
Alti biosenzori optici sunt in principal bazati pe schimbarile de absorbanta sau de fluorescenta a
unui compus indicator convenabil. Peste tot se folosesc unelte de cercetare, micro-matricile fiind
fundamentale pentru un biosenzor
Electrochimice
Biosenzorii electrochimici sunt in mod normal bazati pe cataliza enzimatica a unei reactii care
produce sau consuma electroni (de asemenea enzimele sunt pe drept numite enzime redox). Substratul
senzorului contine de obicei 3 electrozi, un electrod de referinta, un electrod activ si un electrod inclinat.
Un electrod fisa poate fi de asemenea prezent ca si sursa de ioni. Proba de analizat tinta este implicata in
reactii care au loc pe suprafata electrodului activ si ionii produsi isi creaza un potential scazut de la
electrodul de referinta care da semnalul. Se poate masura orice curent ( rata de curgere a electronilor este
proportionala cu concentratia probei de analizat) la un potential fixat sau potentialul poate fi masurat la
curent zero (acest lucru da un raspuns logaritmic). Observatia despre potentialul lucrat sau despre
electrodul activ este spatiul sensibil cerut si acesta este adesea folosit.
Alte exemple, biosenzorii potentiometrici, lucreaza in mod contrar curentului, cunoscandu-li-se
abilitatile. Unii biosenzori sunt o imagine (screenprinted ), insotind un polimer invelit, deschid circuitul
potential al biosenzorilor bazati pe incercarile imunologice ale polimerilor conjugati. Sunt doar doi
electrozi si sunt extrem de sensibili, vigurosi si precisi. Dau posibilitatea detectarii probei de analizat la
nivelele anterioare numai prin folosirea HPLC si LC/MS, fara preparari riguroase de proba. Semnalul este
produs de schimbarile electrochimice sau fizice din comportamentul stratului de polimer datorita
schimbarilor aparute la suprafata senzorului. Asemenea schimbari pot fi atribuite puterii ionice, pH-ului,
hidratarii si a reactiilor redox.
Alte principii de detectie
Senzorii piezoelectrici utilizeaza cristale care suporta o deformatie elastica cand ii este aplicat un
potential electric. Un potential alternativ produce o unda de pozitie intr-un cristal la o frecventa
caracteristica. Aceasta frecventa este mult dependenta de proprietatile elastice ale cristalului, astfel ca
daca cristalul este acoperit cu un element biologic apreciat legatura analizorului tinta la un receptor va
produce o schimbare a frecventei rezonantei, care da un semnal legat. In cazul in care se foloseaste
suprafata undei (SAW), sensibilitatea este foarte mult crescuta. Aceasta este o aplicatie speciala a
cristalului Quartz, echilibrata in biosenzor. [2]
(1)
OH-
2H2O2 + luminol
3-aminophthalte + N2 + lumina
(2)
Fig.1.
Fig.2.
Fig.1. Schema de principiu a analizorului cu debit oprit pentru determinarea glucozei prin metoda
chemiluminescentei. R1=solutie de reactic chemiluminogenic; R2=solutie tampon de borat; R3=curentul probei; R4=solutie
tampon de fosfat; P1 si P2=pompe peristaltice; E=reactorul de glucozoxidaza; FC=celula de curgere; MS=agitator magnetic;
OF=legatura de fibre optice bifurcate; D=detector; W=reziduu.
Fig.2. Spectrul pentru solutia de reactiv chemiluminogenic obtinut prin folosirea analizorului cu debit oprit (luminol)
1.010-3 M; [Fe(CN)6 -3], 1.010-2 M; em, 412 nm.
Fig.3.
Fig.4.
Fig.3. Spectrul solutiei de reactiv chemiluminogenic (a) si spectrul chemiluminescentei sistemului luminol-Fe(III)H2O2 obtinut prin folosirea analizorului cu debit oprit (b).
Fig.4. Efectul pH-ului asupra intensitatii chemiluminescentei pentru glucozoxidaza.
Stabilitatea enzimei folosita pentru determinarea glucozei a fost investigata prin realizarea a 20 de
injectii succesive cu 5.0x10-1mM de solutie standard de glucoza, o data la trei zile, timp de 2 luni. Pentru
primele 15 masuratori, intensitatea chemiluminescentei varia cu 5,8%. Pentru ultimele 5 masuratori,
semnalul a scazut considerabil, avand un coeficient de variatie de 11%.
Fig.5.
Tabel.1.
vizuina pentru introducerea probei se realizeaza cu o pipeta automata si un debuaseu capilar din otel
inoxidabil (2), care este un electrod auxiliar.
Fig. 1 : Diagrama schematica a biosenzorului detector de glucoza:
1-biela de Ag cu suprafata sensibila, acoperita cu AgCl; 2-capilar
din otel inoxidabil; 3-cauciuc in forma de cerc; 4-electrod de
Ag/AgCl; 5-disc de platina; 6-orificiu pentru introducerea probelor.
temperatura camerei. Tabelul 1 arata rezultatele obtinute pe parcursul a 10 saptamini, in care intreg
detectorul a fost tinut la 4 C intre determinari. Pe durata procedurii de testare detectorul a fost folosit
pentru determinarea glucozei din limfa diluata 1:10 cu fosfat tampon.
Mici fluctuatii in valorile observate ale
semnalului pot fi atribuite partial la minim tuturor
determinarilor care au dus la bun sfarsit sub conditiile
ne-termostatate.
Detectorul tinut la temeratura
camerei arata o crestere a semnalului cu aproximativ
10 % dupa 2 saptamani.
Un studiu implica precizia unei determinari
discrete a glucozei dusa la bun sfarsit pentru controlul
probelor de limfa diluate 1:10 cu fosfat tampon.
Obtinerea valorii RSD (de la 2,1 la 2,3 %) a
Fig. 2: Stabilitatea raspunsului amperometric a
biosenzorului de glucoza cu o membrana externa de
fost cea mai rea din toate observatiile, care poate fi in
poliester Nucleopore folosita pentru determinarea
mod cert atribuita tuturor determinarilor realizate
sensibila a glucozei din limfa, stocata intr-un
manual.
refrigerator intre probe.
Pentru determinarile practice, dilutia 1:10 probelor cu limfa cu 0,1 M fosfat tampon la pH=7,1 si
citirea semnalului au fost inregistrate dupa 90 s. Inainte de introducerea probelor, masurarea
compartimentelor detectorului au fost spalate cu 0,5 ml apa distilata. Probele cu limfa recoltate proaspat
au fost simultan analizate folosind Analizorul de glucoza Beckman 2 sau Kone progress. Corelatiile
sarjelor obtinute pentru 2 serii ale probelor naturale folosite pentru compararea cu analizele comerciale
sunt prezentate in fig. 2.
Fig.3: Corelarea loturilor obtinute pentru determinarea glucozei din limfa si Analizorul de glucoza Beckman 2 (A) si
Analizorul Kone Progress (B).
Comparand cu analizele din limfa pentru ambele probe de singe, diluate si nediluate, observarea
schimbarilor de semnal expune cu certitudine magnitutidea maxima de semnal intre 10-20 s dupa
introducerea probei si apoi arata o scadere a magnitudinii semnalului (curba A-C din Fig. 3). Natura
imaginilor prezentate in Fig. 3 si 4 cand o solutie standard sau o proba sunt schimbate cu o solutie de
spalare nu a fost investigata, de cind aceasta nu a intervenit cu o estimare a unui rezultat analitic.
Mai precis, se pare ca acest lucru este cauzat de atacul si ne-atacul procesului, raportat anterior de
catre oxido-reducerea electroactiva a suprafetei functionale, sugerata pentru un electrod de carbon sticlos.
B. DETERMINAREA NIVELULUI DE GLUCOZA DIN SANGE FOLOSIND PEROXIDAZA:
Peroxidaza catalizeaza reactia dintre peroxidul de hidrogen cu 3-metil-2-benzotiazolin hidrazina
(MBTH) si cu acidul 3-dimetilaminobenzoic (DMAB)
Sarea acidului naftalensulfonic inlocuieste DMAB.
C6H12O6 + O2
GOD
pentru detectarea electrochimica. Oxidarea catalitica la un potential moderal cu electrod de platina sau de
aur este posibila cu ajutorul unui mecanism care implica adsorbtia glucozei pe suprafata unul electrod
curat. (fig.1.). Din
pacate, produsii acestei oxidari catalitice pot ramane adsorbiti pe suprafata
electrodului, blocand situs-urile catalitice si impiedica urmatoarele oxidari. In mod normal,
comportamentul glucozei pe electodul de platina sau de aur la un potential fix este caracterizat de o
scadere a activitatii electrozilor.(fig.2.).
Efectele negative ale adsorbtiei pot fi anulate si activitatea catalitica a suprafetei electrodului poate fi
refacuta printr-un proces de curatare in doua etape dupa etapa de detectare.(fig3.). Primul pas este la un
potential mai pozitiv decat cel folosit pentru detectie, iar cel de-al doilea pas, la un potential mai negativ.
Efectele acestor potentiali pot fi intelese prin examinarea rotirii discului voltamogram al electrodului de
aur in hidroxid de sodiu 0.1M in absenta (a) si in prezenta glucozei (b). (fig.4.). In absenta glucozei sunt 2
mari caracteristici in rotirea discului voltamogram. Curentul anodic, reprezentat in figura cu litera A, apare
datorita formarii la suprafata a unui strat de oxid , iar curentul catodic, reprezentat cu C, apare datorita
dizolvarii acestui strat. Aditia de glucoza conduce la o crestere insemnata a curentului anodic de la E la F
datorita oxidarii unor grupuri de aldehide si alcooli pe suprafata electrodului gol. Curentul pentru aceste
oxidari catalitice este micsorat la potential mai pozitive din moment ce formarea stratului de oxid
blocheaza situs-urile active de pe suprafata electrodului. Oricum, curentul G este inca mare in prezenta
glucozei datorita desorbtiei oxidative a produsilor de oxidare adsorbiti. Dizolvarea stratului de oxid
permite reinceperea catalizei enzimatice, lucru care este aratat de curentul oxidativ H.
13
Potentialul optim de detectie pentru glucoza este in regiunea de potential in care nu are loc formarea
de oxid si nici reducerea oxigenului (reducerea oxigenului are loc la potentiale mai mici de -0,1V).
Produsii de oxidare adsorbiti care rezulta din aceasta oxidare catalitica pot fi eliberati oxidativ prin
aplicarea unui potential mai mare. Oricum, aplicarea acestui potential conduce la formarea unui strat
oxitativ, care conduce la pasivizarea suprafetei. Activitatea catalitica a suprafetei electrodului se reface
prin aplicarea unui potential mai mic, producand dizolvarea stratului de oxid. Detectarea glucozei (si a
altor zaharuri) folosind acest val de potential triplu-impuls se refera la Detectarea Amperometrica a
Impulsului (Pulse Amperometric Detection) sau la Detectarea Electrochimica a Impulsului (Pulsed
Electrochemical Detection). Eficacitatea lui PAD este ilistrata in figura 2, care compara reproducerea
cromatogramei folosind PAD (a) si un potential constant de detectie (b). Se poate vedea ca picurii
curentilor in cazul detectiei la potential constant scad odata cu timpul, in timp ce pentru PAD raman
constanti.
Oxidarea catalitica a glucozei a fost incercata si prin modificarea electrozilor cu sari de cupru sau cu
metal de cupru. Potentialul optim pentru detectarea glucozei este independent de metoda folosita pentru
fabricarea electrodului de cupru, care sugereaza existenta unui mecanism comun. Un avantaj major al
electrozilor de cupru este faptul ca produsii oxidarii nu sunt adsorbiti.
Oxidarile catalitice mentionate mai sus sunt
specifice doar pentru grupari functionale apropiate.
Altfel, nu se realizeaza o separare (discriminare) intre
glucoza si alte zaharuri, sau intre alcooli inerenti in
PAD, fiind necesara o separare cromatografica.
In consecinta, nu este necesara realizarea unui
val de potential de puls , ci poate fi folosit un
potential constant.(fig.5).
14
BIBLIOGRAFIE
[1]. http://www.csc.matco.ro/biosenzo1.html
[2]. http://en.wikipedia.org/wiki/Biosensor
[3]. http://www.tesionline.com/intl/preview.jsp?idt=16222
[4].http://209.85.135.104/search?
q=cache:AfPJhyDv62AJ:arh.pub.ro/cravariu/Biodispozitive.doc+biosenzori+pentru+detectarea+glucozei
&hl=ro&ct=clnk&cd=2&gl=ro&client=firefox-a
[5].http://209.85.135.104/search?
q=cache:xeJjEu8xcgJ:newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_search/j_download.htm%3Fcode
%3DK010305+biosensor+for+glucose+determination+from+blood&hl=ro&ct=clnk&cd=67&gl=ro
[6].http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php?
cdjournal=analsci1985&cdvol=10&noissue=3&startpage=423&lang=en&from=jnlabstract
[7]. http://www.currentseparations.com/issues/17-1/cs17-1d.pdf
15